全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月 657
收稿 2009-03-18 修定 　2009-06-01
* 通讯作者(E-mail: limy@swu.edu.cn; Tel: 023-68251250)。
彩叶草中一个富亮氨酸重复相关蛋白基因 SsLRP的克隆和分析
祝钦泷 1,2, 李名扬 2,*
1 华南农业大学生命科学学院, 广东省植物功能基因组与生物技术重点实验室, 广州 510642; 2 西南大学园艺园林学院, 西南
大学花卉研究所, 重庆 400716
提要: 根据彩叶草叶片小型 EST库中一条具有 1个富亮氨酸重复(leucine-rich repeat, LRR)结构域的 EST序列, 采用 RACE
与文库结合的方法, 克隆了1个具有5个LRR结构域的全长cDNA, SsLRP (LRR-Related Protein) (GenBank登录号FJ787729)。
SsLRP cDNA全长 1 024 bp, 包含一个 657 bp的ORF框, 编码 218个氨基酸。其 5’-UTR区含有 2个终止子 TAG, 3’-UTR区
具有推测的加尾信号AATAAA。SsLRP蛋白N端具有的信号肽和保守的亮氨酸拉链结构域, 具有 5个保守的LRR结构域,
多个磷酸化位点和N-糖基化位点。多序列比对和系统进化分析表明, SsLRP与番茄SlLRP同源性最高。二级结构和三级
结构预测表明, SsLRP的功能可能与保守的LRR结构域密切相关, 推测该基因可能参与蛋白间的相互作用与信号识别。RT-
PCR分析表明, SsLRP与番茄SlLRP具有相似的表达模式, 在正常植株的根、茎、叶和花中都有表达, 在受菌核病感染植株
的茎和叶中表达上调。
关键词: 彩叶草; 富亮氨酸重复蛋白; SsLRP基因
Molecular Cloning and Analysis of a Novel Leucine-Rich Repeat Related Pro-
tein Gene, SsLRP, from Solenostemon scutellarioides (L.) Codd
ZHU Qin-Long1,2, LI Ming-Yang2,*
1Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Biotechnology of Guangdong Province, College of Life Sciences, South China
Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2Institute of Ornament Plants, College of Horticulture and Landscape, South-
west University, Chongqing 400716, China
Abstract: According to a EST sequence with a LRR (leucine-rich repeat) domain from Solenostemon
scutellarioides, a novel leucine-rich repeat prelated rotein (LRP) gene with 5 LRRs, denoted SsLRP (GenBank
Accession No. FJ787729), was rapidly cloned using a strategy of RACE combined with cDNA library. The full
length of SsLRP was 1 024 bp and contained a 657 bp open reading frame (ORF) encoding a 218 amino acid
protein. Two stop codons (TAG) were found in 5’-UTR and one possible polyadenylation signal, AATAAA,
was found in 3’-UTR. The SsLRP contained a predicted signal peptide and a conserved LZ (leucine zipper)
domain in the N-terminal region, five conserved LRR domains, and multiple phosphorylation sites and N-linked
glycosylation sites. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis showed that SsLRP shared high
homology with tomato SlLRP, and belonged to the same subfamilies of LRPs. The prediction analysis of sec-
ondary structure and three dimensional structures of SsLRP showed that the possible function of the protein
was decided by the multiple LRR domains, and involved in protein-protein interactions and signal perception.
The RT-PCR analysis showed that SsLRP and SlLRP had the same expression pattern. SsLRP was expressed in
all normal tissues, and up-regulated at high levels in diseased steam and leaves infected with Sclerotinia
sclerotiorum.
Key words: Solenostemon scutellarioides; leucine-rich repeat protein; SsLRP
植物特异的富亮氨酸重复蛋白(leucine-rich re-
peat protein, LRR)大多具有相似或相同的功能, 直
接参与对病原体的识别和信号转导(Kobe和Kajava
2001), 主要包括LRR型的类受体蛋白激酶(LRR re-
ceptor-like protein kinase, LRR-RLK)、抗病基因编
码的蛋白(disease-resistance proteins, R)、多聚半
乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting
protein, PGIP)和LRR相关蛋白(LRR-related protein,
LRP)等。LRR-RLK参与植物体应答逆境和与防御
相关的过程, 与抗逆性反应、调节植物发育和介导
植物激素信号转导相关, 如水稻抗白叶枯病基因
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月658
Xa21 的胞外 LRR 结构能够特异识别配体, 诱导胞
内激酶磷酸化, 保护水稻免受病原菌的侵害(Wang
等 2004); 拟南芥AtSERK1基因具有5个LRR结构,
参与了胚胎发育的调节和相关信号传导(Hecht 等
2001)。已克隆的R基因参与细胞对病原体的防御,
基本上都具有LRR这一共同的结构, 通过该结构与
不同病原体的特异识别, 参与病原的识别过程(王友
红等 2005)。抗真菌的 PGIP 基因与多聚半乳糖醛
酸酶(polygalacturonase, PG)的相互作用也是通过
LRR介导的特异识别完成的(蒋豪和汤浩茹 2008)。
LRPs大多为防卫反应相关蛋白, 主要以LRRs为功
能单位直接参与防卫反应的信号识别, 如高粱SLRP
基因是防卫反应相关基因(Hipskind等 1996); 番茄
SlLRP基因受发育调控, 参与正常状态下或受病原
侵染时的信号识别过程(Tornero 等 1996); 辣椒
CaLRP1 基因参与应答逆境胁迫信号转导, 是韧皮
部特异的病原诱导表达基因(Jung等2004); 烟草的
NtLRP1基因参与了病原诱导的过敏反应的信号识
别(Jacques 等 2006), NtLRP2 基因参与逆境胁迫信
号转导, 在病毒侵染和盐胁迫下表达上调(Xu 等
2009)。
彩叶草是唇形花科鞘蕊花属草本观叶植物, 广
泛用于园林绿化, 具有较强的抗病性, 至今关于彩
叶草抗病性的研究很少。为此我们构建了彩叶草
叶片cDNA文库(祝钦泷等2007a), 通过RACE与文
库结合的方法(祝钦泷等2007b), 首次从彩叶草叶片
中分离到一个可能参与防卫反应信号识别的SsLRP
蛋白基因。
材料与方法
从彩叶草[Solenostemon scutellarioides (L.)
Codd]红色品种 ‘C4’ 构建的小型EST库中, 经测序
和BLASTx比对分析, 获得一条 426 bp的具有 1个
LRR 结构域的 EST序列。采用 RACE和文库结合
的方法, 快速分离目的基因。根据该 EST 序列设
计 2 条基因特异引物(GSP), 5’ GSP1 (5 GAT-
GTGCTCAAATGGACCACTGGAAGG 3)和5’ GPS2
(5 GGAGACATCTATAACTTTCAAGGTAG 3), 分
别与文库载体上 5 端的 2 条特异引物 5’ P (5 ’
TriplEx sequencing primer: 5 TCCGAGATC-
TGGACGAGC 3) 和 5’ NP (5 TriplEx LD-Insert
screening primer: 5 CTCGGGAAGCGCGCCATTG-
TGTTGGT 3)配对进行 5’ RACE, 扩增目的基因的
5 端。在 50 μL体系中, 用 1 μL 稀释 100× 的原始
文库为模板, 以5’ GSP1 和 5’ P为引物, 进行第1次
扩增; 再用一扩产物 0.5 μL 为模板, 引物 5’ GSP2
和 5’ NP 进行第 2 次扩增。2 次 PCR 反应采用相
同的 TD-PCR (降落 PCR)条件: 95 ℃变性 10 min,
裂解噬菌体, 加入PCR 反应混合物, 并按以下程序
扩增: 94 ℃变性4 min; 94 ℃变性1 min, 65~55 ℃退
火 1 min (每循环下降 0.5 ℃), 72 ℃延伸 2 min, 20
个循环; 94 ℃变性 1 min, 55 ℃退火 1 min, 72 ℃延
伸 2 min, 15 循环; 72 ℃延伸 10 min。根据 5 端序
列, 设计特异引物 FLRP (5 GCCGATTCTCCTTT-
TAACATTTTTGCTTTTATTGC 3)和载体上 3 端
的特异引物 3’ P (3’ TriplEx LD-Insert screening
prime: 5 TAATCGACTCACTATAGGGCGAATTGG
3)直接扩增全长 cDNA。纯化 PCR 产物, 连接于
克隆载体 pMD18-T, 送上海生工公司测序。
生物信息学分析主要采用Vector NTI Suite 10.0
软件及网上软件包进行。BLAST 分析、ORF 的
查找、核苷酸的翻译以及蛋白保守结构域搜索, 均
在在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上进
行。应用 ExPASy (http://www.expasy.ch/)提供的
ProtParam程序对推测的SsLRP编码蛋白进行相对
分子量、等电点(pI)等基本特征的运算; 在网站
http://www.expasy.org、http://www.softberry.
com/、http://www.cbs.dtu.dk/services/ 和 http://
psort.nibb.ac.jp/form.html 上, 用相关软件进行综合
预测分析编码蛋白的基本性质、结构特点、亚细
胞定位、磷酸化位点等; SsLRP蛋白二级结构预测
采用SOPMA程序分析, 三级结构预测采用SWISS-
MODEL的同源建模, 用 PyMol software 软件显示。
用 Invitrogen的Trizol试剂提取彩叶草根、茎、
叶、花以及受菌核病感染植株的茎和叶的总RNA,
用 Promega 的 M-MuLV 逆转录酶进行 cDNA 第一
链合成。以彩叶草 Action (GenBank 登录号 DQ42
3374)为对照, 进行半定量RT-PCR分析。SsLRP使
用 ORF 引物 lrp1 (5 ATGGCGGGGAGAGGAG-
ATTTGCTG 3)和 lrp2 (5 TTAAGAACAGTTT-
GTATCATAACTA GCA 3)进行 30 个循环的扩增,
Action采用引物 actin1 (5 CTCGGCAGTTGTGGT-
AAACATG 3) 和 actin2 (5 CCGTGTCGCTCCTG-
AAGAGC 3)进行 24 个循环的扩增。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月 659
结果与讨论
1 彩叶草 SsLRP全长 cDNA的克隆及序列特征
通过 RACE 和文库结合的方式, 以 1 μL稀释
100× 的原始文库为模板, 经 5’ RACE 获得了一条
约650 bp左右的片段, 测序后BLASTx比对和拼接
表明该片段为 SsLRP的 5 端。用 5 端特异引物与
3’ P, 以稀释100×的原始文库为模板进行全长扩增,
获得一条约1.0 kb的cDNA片段, 测序后用BLASTx
比对表明, 该片段编码的推测蛋白与番茄 SlLRP
(GenBank登录号CAA64565)有高达87%的同源性,
确定为彩叶草富亮氨酸重复相关蛋白 SsLRP 基
因。SsLRP (GenBank登录号FJ787729)全长 cDNA
为 1 026 bp, 由 127 bp (1~127bp)的 5-UTR (5
untranslated region)、242 bp (785~1 026 bp, 包括
32 bp的 polyA结构)的 3-UTR 及 657 bp (128~784
bp)编码 218 aa 的 ORF 框组成(图 1)。SsLRP 5 和
3-UTR 富含 A+T, 各占其碱基的 55% 和 71%, 比
ORF 区域高(53%), 与其他植物基因很相似(Liu 等
2003)。位于 125~131 bp 的 ATG 及邻近序列
(GCCATGG)符合真核生物起始密码ATG预测保守
序列(A/GXXATGG) (Kozak等1984), 同时在5-UTR
中还发现位于 65~67 bp和 113~115 bp的 2个终止
密码 TGA, 进一步确认该 ATG 为起始密码(图 1)。
在 P o l y A 上游 2 3 b p 处有典型的加尾信号
“AATAAA”(图 1)。
图 1 SsLRP 的核酸序列及其推测的氨基酸序列和结构
Fig.1 cDNA sequence, the deduced amino acid sequence and structure of SsLRP
起始密码子和终止密码子用粗体表示, 5-UTR 区的 2 个终止子用下波浪线表示; 虚线部分为 27 个氨基酸的信号肽; 箭头表示信
号肽剪切位点; 方框中为 N 端保守的亮氨酸拉链结构域, 其中保守的亮氨酸用粗体表示; 阴影部分表示保守的 LRR 结构域, 其中保守
氨基酸用黑体表示; 粗体加单下划线表示推测的磷酸化位点; 粗体加双下划线表示推测的 N- 糖基化位点; 加尾信号 “AATAAA” 用粗
体加单下划线表示。
2 彩叶草 SsLRP蛋白的基本特征、同源比对和
高级结构预测分析
SsLRP编码一个218 aa的蛋白, 分子量为23.76
kDa, 等电点pI=5.11, 为酸性蛋白, 其中亮氨酸含量
很高, 占整个氨基酸量的 16.97%, 为富亮氨酸蛋
白。SsLRP 中极性氨基酸和疏水氨基酸比例很高,
均为氨基酸总量的 33.03%, 利用 ProtScale 分析其
疏水性, 显示 SsLRP 蛋白中疏水性最大值是 2.878
(第 12位 aa), 最小值为-2.033 (第 201、202位 aa),
N端存在一个大的疏水区域(第5~19位aa), 但总体
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月660
为亲水蛋白。Tmpred的跨膜结构预测表明在N端
疏水区内(第 7~23 位 aa)具有跨膜结构。SignalP 3.0
预测显示 SsLRP N 端具 27 个氨基酸的信号肽, 正
好位于疏水区的跨膜结构中, 是一个分泌蛋白。
TargetP预测显示SsLRP最可能定位于细胞的分泌
途径(细胞外基质)。NetPhos 2.0 Server 的磷酸化
位点预测与N-糖基化位点预测显示, SsLRP蛋白有
6 个 Ser 磷酸化位点、3 个 Thr 磷酸化位点、2 个
Tyr磷酸化位点和2个N-糖基化位点(图1), 这些位
点的存在说明蛋白翻译后修饰在实现 SsLRP 蛋白
的功能中起重要作用。ProtScale和CDS保守结构
域搜索表明, SsLRP蛋白N端具有一个高度保守的
亮氨酸拉链结构域(LZ, leucine zipper: Lxxxxxx
LxxxxxxLxxxxxxLxxxxxx), 中部和 C 端具有 5 个
保守的 L R R 结构域( L x x L x x L x x L x L x N x
LxGxIPxx) (图 1)。SsLRP 蛋白 5 个保守的 LRRs
中, 除第 1 个不完整外, 其余 4 个高度保守(图 1)。
SsLRP 蛋白在整个结构上与一些已被研究的 LRP
蛋白高度一致(图 2), 暗示 SsLRP 可能具有与它们
一致或相近的功能。
用NCBI的BLASTp程序以及Vector NT I Suite
10.0软件的分析表明, SsLRP蛋白序列与许多已知
的植物富亮氨酸重复相关蛋白(LRP)具有较高的同
源性(图 2), 其中与番茄(Solanum lycopersicum)的
SlLRP 同源性最高达 87%, 与水稻(Oryza sativa)、
拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小麦(Triticum
aes tivum )、辣椒(Caps icum annuum )和烟草
(Nicotiana tabacum)等也具有较高的同源性, 同源
性在 60%~83% 之间。并且, SsLRP 蛋白与这些
LRP 在功能结构域、磷酸化位点和糖基化位点上
表现出高度的一致性(图2), 推测它们具有相同的功
能和相似的蛋白后修饰方式。
SOPMA二级结构预测表明SsLRP蛋白主要由
α螺旋、随机卷曲、β 折叠和延伸链组成。SsLRP
与不同LRPs蛋白二级结构比较显示: 在LZ结构域
中均含 α1 螺旋, 除第 1 个 LRR 单元只有一个 β 折
图 2 SsLRP 蛋白与同源蛋白的多序列比对
Fig.2 The multiple sequence alignment of SsLRP with homologous proteins
保守的 N 端亮氨酸拉链结构域(LZ)和 LRR 结构域用粗的方框表示; 粗圆点表示保守的氨基酸; 三角符号表示保守的磷酸化位点;
菱形符号表示保守的 N- 糖基化位点; 黑色背景表示完全一样的氨基酸序列。序列上面深灰色方框代表 α 螺旋; 箭头代表 β 折叠, 除
第 1 个 LRR 外, 其余保守的 LRR 结构均包括 1 个 β 折叠和 1 个 α 螺旋。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月 661
叠外, 其余 4个LRR单元均由一个 β折叠和一个α
螺旋组成, 它们二级结构几乎完全一致(图 2)。用
已知晶体结构的菜豆 PGIP2 (Di Matteo等 2003)为
模板, 使用 SWISS-MODEL同源建模, 得到 SsLRP
蛋白与 SlLRP 蛋白的三级结构(图 3)。SsLRP蛋白
由 5个α螺旋和 6个 β 折叠组成, 除第 1个LRR单
元只有一个β折叠外, 其余4个LRR单元中每一个
都包含一个 β 折叠和一个相平行的α螺旋, 由 loop
环连接形成一个发夹状的结构。并且所有LRR单
元均以一个共同的轴平行排列, 形成一个凹面为 β
折叠、凸面为 α螺旋的非球状的马蹄形分子结构,
在这种结构中, 保守的亮氨酸残基形成一个与配体
相结合的疏水性的核心, 而其他非保守性的氨基酸
残基则暴露在马蹄形分子的外周。SsLRP 中的LZ
结构域和 LRRs 形成的非球状马蹄形分子结构, 都
是理想的介导蛋白之间相互作用的结构(Landschulz
等 1988; Forrer 等 2003)。SsLRP 蛋白的这一结构
特征与菜豆PGIP2的LRR结构和其它植物LRPs蛋
图 3 用 SWISS-MODEL 同源建模推测的 SsLRP 蛋白和番茄 SlLRP 蛋白三维结构
Fig.3 3-D structure of deduced SsLRP and SlLRP from tomato by SWISS-MODEL homology-modeling
图 4 用邻位相连法构建的 SsLRP 蛋白与其它植物 LRR 蛋白的系统发生树
Fig.4 Neighbor joining phylogenetic tree of SsLRP and LRRs from other plants
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月662
白预测结构非常相似, 与番茄SlLRP蛋白的三级预
测结构几乎完全一致(图3), 因而进一步推测SsLRP
蛋白与SlLRP蛋白具有相同的功能, 参与蛋白间的
相互作用与信号识别。
3 彩叶草 SsLRP蛋白的系统进化树分析
在多序列比对的基础上, 用SsLRP蛋白序列和
植物的4种类型LRRs蛋白序列构建了系统发生树
(图 4)。系统树中, 不同类型的 LRRs 蛋白聚为一
组, SsLRP 属于 LRP 一类, 并且和番茄、拟南芥和
水稻聚为一小支, 说明SsLRP与它们可能具有相同
的功能。另外, LRP 蛋白与 LRR 型的类受体激酶
SERK (体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶)处于
同一大支, 暗示着LRP蛋白可能具有与SERK 蛋白
相似的参与发育调节的某些信号传导功能。
4 彩叶草 SsLRP基因的RT-PCR分析
提取正常生长植株的根、茎、叶、花的
m R N A 以及受菌核病感染的植株的茎和叶的
mRNA, 分别反转录为 cDNA后对 SsLRP做半定量
的 RT-PCR 比较分析。如图 5 所示, SsLRP 在正常
植株中是组成型表达的, 其中在茎中最弱, 花中最
强; 而在感病植株的茎和叶中, 表达上调。SsLRP
的表达模式与大多数 LRP基因相似, 与番茄 SlLRP
基因相同, 都在正常植株表达, 在感病植株中表达
上调, 因此推测SsLRP可能参与正常状态下或受病
原侵染时的信号识别过程。
祝钦泷, 李艳冬, 刘光德, 郭余龙, 眭顺照, 李名扬(2007a). 彩叶草
cDNA 文库的构建与分析. 中国农学通报, 23 (2): 60~64
祝钦泷, 李名扬, 刘光德, 李艳冬, 眭顺照, 郭铁英(2007b). 彩叶
草叶片衰老相关新基因 Cbcbs 的分子特征和功能分析. 中国
生物化学与分子生物学报, 23 (4): 249~255
Di Matteo A, Federici L, Mattei B, Salvi G, Johnson KA, Savino
C, De Lorenzo G, Tsernoglou D, Cervone F (2003).The
crystal structure of polygalacturonase-polygalacturonase-
inhibiting protein (PGIP), a leucine-rich repeat protein in-
volved in plant defense. Proc Natl Acad Sci USA, 100 (17):
10124~10128
Forrer P, Stumpp MT, Bina HK, Plückthun A (2003). A novel
strategy to design binding molecules harnessing the modular
nature of repeat proteins. FEBS Lett, 539 (1~3) : 2~6.
Hecht V, Vielle-Calzada JP, Hartog MV, Schmidt ED, Boutilier K,
Grossniklaus U, de Vries SC (2001). The Arabidopsis SO-
MATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE 1 gene is
expressed in developing ovules and embryos and enhances
embryogenic competence in culture. Plant Physiol, 127 (3):
803~816
Hipskind JD, Nicholson RL, Goldsbrough PB (1996). Isolation of
a cDNA encoding a novel leucine- rich repeat motif from
Sorghum bicolor inoculated with fungi. Mol Plant Microbe
Interact, 9 (9): 819~825
Jacques A, Ghannam A, Erhardt M, de Ruffray P, Baillieul F,
Kauffmann S (2006). NtLRP1, a tobacco leucine-rich re-
peat gene with a possible role as a modulator of the hyper-
sensitive response. Mol Plant Microbe Interact, 19 (7):
747~57
Jung EH, Jung HW, Lee SC, Han SW, Heu S, Hwang BK (2004).
Identification of a novel pathogen- induced gene encoding a
leucine-rich repeat protein expressed in phloem cells of Cap-
sicum annuum. Biochim Biophys Acta, 1676 (3): 211~222
Kobe B, Kajava AV (2001). The leucine-rich repeat as a protein
recognition motif. Curr Opin Struct Biol, 11 (6): 725~732
Landschulz WH, Johnson PF, McKnight SL (1988).The leucine
zipper: a hypothetical structure common to a new class of
DNA binding proteins. Sci, 240 (4860): 1759~1764
Tornero P, Mayda E, Gómez MD, Cańas L, Conejero V, Vera P
(1996). Characterization of LRP, a leucine-rich repeat (LRR)
protein from tomato plants that i s processed du ring
pathogenesis. Plant J, 10 (2): 315~330
Wang GL, Wu C, Zeng L, He C, Baraoidan M, de Assis Goes da
Silva F, Williams CE, Ronald PC, Leung H (2004). Isolation
and characterization of rice mutants compromised in Xa21-
mediated resistance to X. oryzae pv. oryzae. Theor Appl
Genet, 108 (3): 379~384
Xu ZS, Xiong TF, Ni ZY, Chen XP, Ming C, Li LC, Gao DY, Yu
XD, Pei L, Ma YZ (2009). Isolation and identification of
two genes encoding leucine-rich repeat (LRR) proteins dif-
ferentially responsive to pathogen attack and salt stress in
tobacco. Plant Sci, 176 (1): 38~45
图 5 彩叶草 SsLRP基因在不同器官中的表达
Fig.5 Expression of SsLRP in different organs of
S. scutellarioiders
参考文献
蒋豪, 汤浩茹(2008). 植物 pgip 基因特性及表达调控研究进展.
中国农学通报, 24 (8): 63~68
王友红, 张鹏飞, 陈建群(2005). 植物抗病基因及其作用机理. 植
物学通报, 22 (1): 92~99