全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (11): 1880~1886　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.03351880
收稿 2015-06-19　　修定 2015-09-06
资助 国家自然科学基金(31370693)。
* 通讯作者(E-mail: chblyan@163.com; Tel: 010-62336062)。
外源抗氧化剂对春石斛类原球茎超低温保存的影响
狄玮, 贾梦雪, 刘燕*
花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室, 国家花卉工程技术研究中心, 城乡生态环境北京实验室, 北京林业大学园林
学院, 北京100083
摘要: 为探讨外源抗氧化剂对春石斛类原球茎(PLBs)超低温保存中氧化应激的缓解效应, 以春石斛‘红梦幻’ PLBs为试材,
在玻璃化法超低温保存程序的不同环节导入3种不同浓度外源抗氧化剂, 检测其对PLBs冻后存活率的影响, 在此基础上分
析最佳抗氧化剂介入实验体系中氧化应激相关指标的变化。结果显示, 在装载、PVS2处理和去装载时导入不同浓度的超
氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)对PLBs冻后存活率影响差异大, 均以去装载时导入效果最好。其中SOD导入最佳
浓度为600 U·mL-1, 存活率提高了5.76%, 但对氧化应激相关指标均无显著影响。CAT导入最佳浓度为400 U·mL-1, 存活率
提高了33.49%, 显著降低过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量, 提高抗坏血酸(AsA)含量。在预培养、装载、PVS2处理和
去装载时导入不同浓度的AsA均可提高PLBs冻后存活率, 以去装载时导入效果最好, 最佳浓度为0.1 mmol·L-1, 存活率提高
了14.34%, 显著降低了超氧阴离子(O2·
–)产生速率和MDA含量, 提高了SOD活性。结果表明, 3种外源抗氧化剂对PLBs冻后
存活率相对提高效果依次为CAT>AsA>SOD。
关键词: 春石斛; 类原球茎; 存活率; 抗氧化剂; 氧化应激
Effects of Exogenous Antioxidants on Cryopreservation of Protocorm-Like
Bodies of Dendrobium nobile
DI Wei, JIA Meng-Xue, LIU Yan*
College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Inno-
vation & Molecular Breeding, National Engineering Research Center for Floriculture, Beijing Laboratory of Urban and Rural
Ecological Environment, Beijing 100083, China
Abstract: The aim was to explore the alleviating effects of oxidative stress in cryopreservation of proto-
corm-like bodies (PLBs) of Dendrobium nobile by importing exogenous antioxidants. PLBs of Dendrobium
nobile ‘Hamana Lake Dream’ were used as materials for cryopreservation by vitrification, in which were added
three kinds of different concentrations of exogenous antioxidants to investigate the effects on the survival rates,
the best antioxidants-applied experiment systems were established respectively to research the changes of oxi-
dative stress related indexes. The results showed that the impact on survival rates of cryopreservated PLBs were
suffered a big difference by adding different concentrations of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) to
the loading, PVS2-treated and unloading stage. However, both for adding in the unloading stage were the best,
In this stage, adding 600 U·mL-1 SOD had the best effects, improved the survival rates of 5.76%, but all oxida-
tive stress related indexes did not make a big difference. Adding 400 U·mL-1 CAT had the best effects, im-
proved the survival rates of 33.49%, the contents of hydrogen peroxide (H2O2) and malonaldehyde (MDA) de-
creased, and the contents of ascorbic acid (AsA) increased significantly. Adding different concentrations of AsA
in the preculture, loading, PVS2-treated and unloading stages all could improve survival rates of cryopreservat-
ed PLBs. The best concentrations was 0.1 mmol·L-1 in the unloading stage, improved the survival rates of
14.34%, the contents of O2·
– (superoxide anion) production rate and MDA decreased significantly, and the activi-
ty of SOD increased significantly. The results indicated that the effects of three kinds of exogenous antioxidants
on survival rates of cryopreservated PLBs were CAT>AsA>SOD in order.
Key words: Dendrobium nobile; PLBs; survival rates; antioxidants; oxidative stress
超低温保存是一种长期、稳定、低成本保存
种质资源的重要手段, 已用于众多植物的成功保
存, 但仍有部分种质冻后无法成活或存活率较低,
狄玮等: 外源抗氧化剂对春石斛类原球茎超低温保存的影响 1881
其原因是保存过程中低温、脱水、冷冻-解冻等逆
境对植物造成了一系列胁迫和损伤 (陈晓玲等
2013)。其中氧化损伤被证明是影响超低温保存效
果的重要原因之一(Tatone等2010)。
活性氧(reactive oxygen species, ROS)是指具
有较高化学反应活性的氧的几种代谢产物, 包括
O2·
–、羟自由基(·OH)、H2O2等, 研究表明逆境下
ROS过度产生与抗氧化防御机制减弱之间的失衡
是引起的脂质、蛋白质和核酸等大分子物质氧化
损伤根本原因(Mittler等2004; 徐瑾等2013)。因此
施用外源抗氧化剂以保护机体免受氧化伤害在超
低温保存中得到了一定的发展。在植物超低温保
存中, 非酶类抗氧化剂如外源抗坏血酸(ascorbic
acid, AsA)和维生素E、硫酸锌、甜菜碱、谷胱甘
肽、聚乙烯吡咯烷酮等均有效提高了部分种质的
冻后存活率和再生率(Uchendu等2010a, 2010b)。
而酶类抗氧化剂, 如过氧化氢酶(catalase, CAT)
(Fernández-Santos等2009)、超氧化物歧化酶(su-
peroxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶
(Thuwanut等2010)等在人类或动物精子的超低温
保存中被证明可有效降低ROS生成量, 减少氧化应
激的发生, 提高精子活力, 但在植物材料的超低温
保存中未见报道。本研究以春石斛‘红梦幻’ PLBs
为试材, 在玻璃化超低温保存程序的几个关键环
节导入不同浓度酶类和非酶类抗氧化剂, 探讨外
源抗氧化剂对春石斛超低温保存PLBs冻后存活率
的影响, 进一步分析其对氧化应激的缓解效应, 为
抗氧化剂在超低温保存中的应用提供依据。
材料与方法
1 试验材料
供试品种为春石斛‘红梦幻’ (Dendrobium nob-
ile Lindl. ‘Hamana Lake Dream’)。PLBs由高2~3
cm的组培苗茎尖在1/2MS+0.5 mg·L-1 TDZ+2.0
m g · L - 1水解酪蛋白的培养基诱导获得 , 并于
1/2MS+2.0 g·L-1水解酪蛋白的培养基中进行继代
培养 , 诱导和继代均在(23±2) ℃ , 光照强度40
μmol·m-2·s-1, 光照时间14 h·d-1的条件下进行, 每4周
继代一次(贾梦雪等2013), 取生长旺盛的PLBs用于
超低温保存试验。
2 试验处理
试验采用前期筛选出的春石斛最佳玻璃化超
低温保存程序, 步骤如下: (1)预培养: 取直径2~3
mm PLBs接种于1/2MS+0.3 mol·L-1蔗糖的固体培
养基, 4 ℃黑暗条件下冷锻炼2 d; (2)装载: 将预培
养后的PLBs放入含装载溶液[2 mol·L-1丙三醇+0.4
mol·L-1蔗糖, pH=5.8]的PCR管中, 室温处理40 min;
(3) PVS2处理: 0 ℃下, PVS2溶液[30% (W/V)丙三
醇+15% (W/V)乙二醇+15% (W/V)二甲基亚砜+0.4
mol·L-1蔗糖, pH=5.8]处理40 min; (4)冻存: 更换
PVS2溶液, 将装有PVS2溶液和材料的PCR管迅速
投入液氮, 冻存至少1 h; (5)解冻: 37 ℃水浴中迅速
化冻40 s; (6)去装载: 去装载溶液[1/2MS+1.2
mol·L-1 蔗糖, pH=5.8]室温下震荡洗涤PLBs 2 次,
每次10 min; (7)再生培养: PLBs用无菌滤纸吸干洗
涤液, 接入1/2MS+2.0 g·L-1 水解酪蛋白+3.0 g·L-1活
性炭的固体培养基, 黑暗培养7 d, 弱光(光照强度
约为3.4 μmol·m-2·s-1)培养3周, 正常光(光照强度约
为40 μmol·m-2·s-1)下继续培养, 室温(23±2) ℃, 光照
时间14 h·d-1。
分别设置外源SOD浓度(购于美国Sigma公司)
为200、400、600和800 U·mL-1, 外源CAT浓度(购于
美国Sigma公司)为50、100、200和400 U·mL-1导
入超低温保存程序中的装载、PVS2处理和去装载
环节; 设置外源AsA浓度(购于北京欣经科生物技
术有限公司)为0.1、0.2、0.4和0.6 mmol·L-1导入超
低温保存程序的预培养、装载、PVS2处理和去装
载环节, 均以不导入抗氧化剂为对照, 统计超低温
保存后的存活率, 以探究外源抗氧化剂的作用。
通过筛选3种外源抗氧化剂在超低温保存程
序中导入的最佳环节和浓度, 设置不导入外源抗
氧化剂(对照), 及外源SOD、CAT、AsA在最佳环
节以最适浓度导入的超低温保存程序共4个处理,
测定其氧化应激相关指标, 以探究外源抗氧化剂
对超低温保存中氧化应激发生的缓解效应。
3 试验方法
3.1 PLBs存活率的测定
采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法(Towill和Ma-
zur 1975)检测PLBs存活率, 取去装载后的10个2~3
mm PLBs, 加入0.8% TTC:0.05 mol·L-1 磷酸缓冲液=
2:1 (V:V)的混合液, 室温静置18 h, 在485 nm波长下
测定吸光度值, 每个处理重复3次。PLBs存活率=
(处理后PLBs的TTC吸光度值/未处理PLBs的TTC
吸光度值)×100%。
植物生理学报1882
3.2 ROS及氧化应激相关指标
H2O2含量采用碘量法(Velikova等2000)测定;
O 2·
–产生速率采用胫氨氧化法 (王爱国和罗广华
1990)测定; MDA采用硫代巴比妥酸法(Heath和
Packer 1968)测定; SOD采用氮蓝四唑光还原法测
定(李合生2000); CAT采用紫外分光光度计法
(Monnet等2006)测定; AsA采用还原铁法(Kampfen-
kel等1995)测定, 每个处理重复3次。
4 数据处理与分析
采用Microsoft Excel 2010进行数据处理 ,
SPSS Statistics 18.0软件进行方差分析(Duncan新
复极差法)。
实验结果
1 外源抗氧化剂对春石斛PLBs玻璃化法超低温保
存后存活率的影响
1.1 外源SOD导入对PLBs冻后存活率的影响
在春石斛PLBs超低温保存的装载、PVS2处
理和去装载环节分别导入4个浓度的外源SOD。
存活率结果(图1)可见, 导入的环节和浓度对PLBs
冻后存活率影响差异较大, 在PVS2处理和去装载
时导入效果总体好于装载环节, 且在PVS2处理时
导入存活率均有提高。装载时导入浓度为100、
400和600 U·mL-1时, PLBs存活率较对照均显著降
低, 而导入浓度为200 U·mL-1时差异不显著。PVS2
处理时导入浓度为100 U·mL-1时, PLBs存活率较对
照显著提高4.4%, 其他处理均有提高但差异不显
著。去装载时导入浓度为400 U·mL-1时, PLBs存活
率较对照显著提高5.76%, 且达到最高值(22.09%),
其他处理稍有提高或降低但差异均不显著。因此,
在PVS2处理时导入100 U·mL-1和去装载时导入400
U·mL-1的外源SOD可能起到一定抗氧化保护作用,
提高了PLBs冻后存活率, 但提高幅度均较小。
1.2 外源CAT导入对PLBs冻后存活率的影响
在春石斛PLBs超低温保存的装载、PVS2处
理和去装载环节分别导入4个浓度的外源CAT。存
活率结果(图2)可见, 在装载和PVS2处理时导入不
同浓度的CAT, 除PVS2处理浓度为400 U·mL-1外,
PLBs存活率较对照均无显著提高。在去装载时导
入200和400 U·mL-1的CAT, PLBs存活率较对照分
别显著提高5 . 7 7 %和3 3 . 4 9 % , 最高存活率达
50.76%。因此, 在去装载时导入较高浓度的外源
CAT可有效发挥抗氧化保护作用, 大幅提高PLBs
冻后存活率(导入浓度大于400 U·mL-1时较400
U·mL-1时的冻后存活率差异不显著, 数据未列出)。
1.3 外源AsA导入对PLBs冻后存活率的影响
在春石斛PLBs超低温保存的预培养、装载、
PVS2处理和去装载环节分别导入4个浓度的外源
AsA。存活率结果(图3)可见, 在预培养、装载、
PVS2处理和去装载时导入不同浓度AsA均可提高
PLBs冻后存活率, 但在去装载时导入效果最佳, 预
培养和装载时次之, PVS2处理时效果最差。预培
养环节导入浓度为0.2、0.4和0.6 mmol·L-1时, PLBs
存活率较对照分别显著提高6.80%、11.97%和
图1 在超低温保存不同环节导入外源SOD对PLBs冻后存活率的影响
Fig.1 Effects of exogenous SOD in different stages of cryopreservation on svrvival rates of cryopreserved PLBs
不同小写字母表示不同处理间在0.05水平存在显著性差异; 下图同此。
狄玮等: 外源抗氧化剂对春石斛类原球茎超低温保存的影响 1883
7.22%。装载环节导入浓度为0.1和0.2 mmol·L-1时,
PLBs存活率较对照分别显著提高9.08%和7.55%,
其他处理差异不显著。PVS2处理环节导入浓度为
0.6 mmol·L-1时 , PLBs存活率较对照显著提高
5.13%, 其他处理差异不显著。去装载环节导入浓
度为0.1、0.2和0.6 mmol·L-1时, PLBs存活率较对照
分别显著提高14.34%、7.79%和5.91%, 且浓度为
0.1 mmol·L-1时, 达到最高值(31.61%)。因此, 在玻璃
化超低温保存的各环节导入外源AsA均可发挥抗氧
化保护作用, 并不同程度提高PLBs冻后存活率。
2 外源抗氧化剂对春石斛PLBs玻璃化法超低温保
存中氧化应激的影响
2.1 导入外源抗氧化剂对ROS与MDA的影响
ROS中的O2¯·主要参与启动膜脂过氧化和膜脂
脱脂作用, 从而破坏膜结构; H2O2不是自由基, 但
是由于具有强氧化性, 也是可以造成氧毒害的ROS
之一。MDA作为膜脂过氧化的最终分解产物, 其
含量的高低一定程度上可代表膜受损伤的程度(李
晶等2000)。
由前部分研究结果可知, 3种外源抗氧化剂均
在去装载时导入效果最好 , 采用最佳效果的浓
度 , 即600 U·mL-1 SOD、400 U·mL-1 CAT和0.1
mmol·L-1 AsA, 探究其对超低温保存中ROS与MDA
的影响。结果(图4)可见, 与对照相比, 去装载时导
入SOD时, PLBs的O2¯·产生速率、H2O2及MDA含量
均无显著变化; 导入CAT时, PLBs的O2¯·产生速率无
显著变化, H2O2及MDA含量均显著降低; 导入AsA
时, PLBs的O2¯·产生速率和MDA含量均显著降低,
H2O2含量无显著变化。可以看出, 去装载时导入
CAT和AsA均可降低膜脂过氧化的程度, 但两者分
图2 在超低温保存不同环节导入外源CAT对PLBs冻后存活率的影响
Fig.2 Effects of exogenous CAT in different stages of cryopreservation on survival rates of cryopreserved PLBs
图3 在超低温保存不同环节导入外源AsA导入对PLBs冻后存活率的影响
Fig.3 Effects of exogenous AsA in different stages of cryopreservation on survival rates of cryopreserved PLBs
植物生理学报1884
氧化物AsA在抵御ROS伤害中发挥着重要的作用
(李秀等2014)。在去装载时分别导入3种最佳浓度
的抗氧化剂, 测定其对超低温保存中抗氧化酶与
非酶物质的影响。结果(图5)可见, 与对照相比, 去
装载时导入SOD显著提高体内SOD的活性, 对CAT
活性和AsA含量均无显著影响; 导入CAT时显著提
高体内CAT活性和AsA含量, SOD活性无显著变化;
导入AsA显著提高SOD活性和体内AsA含量, 对
CAT活性无影响。可以看出, 导入SOD只提高体内
图4 去装载时导入最佳浓度的不同抗氧化剂对O2¯·产生速
率、H2O2含量及MDA含量的影响
Fig.4 Effects of optimum concentration of different
antioxidants on O2¯· generation rate, H2O2 and MDA
contents in the unloading stage
对照: 不导入外源抗氧化剂; SOD: 导入600 U·mL-1外源SOD;
CAT: 导入400 U·mL-1外源CAT; AsA: 导入0.1 mmol·L-1外源AsA。
下图同此。
别是通过减少H2O2含量和O2¯·产生速率而起作用的;
导入外源SOD对氧化伤害未起到显著的保护作用。
2.2 导入外源抗氧化剂对抗氧化酶与非酶物质的
影响
植物体内ROS的清除主要包括酶促和非酶促
两条途径, 其中抗氧化酶类SOD和CAT及非酶类抗
图5 去装载时导入最佳浓度的不同抗氧化剂
对SOD、CAT和AsA影响
Fig.5 Effects of the optimum concentrations of different anti-
oxidants on SOD, CAT and AsA in the unloading stage
狄玮等: 外源抗氧化剂对春石斛类原球茎超低温保存的影响 1885
SOD的活性, 而导入CAT和AsA不仅可提高体内同
类物质的活性或含量, 还可分别促进AsA和SOD的
提高。
讨　　论
逆境下ROS过量产生时, 细胞处于生理应激
状态, 自身的抗氧化系统如SOD、CAT、POD等酶
类以及AsA、GSH等非酶类会协同作用抵抗ROS
可能带来的伤害, 但当细胞抗氧化能力不足以清
除过量ROS时, 就会阻碍细胞正常的生理进程, 导
致持久伤害。这就启发研究者们通过导入外源抗
氧化剂以防御氧化伤害, 在人类和动物精液、胚
胎和卵母细胞的超低温保存中导入外源SOD和
CAT对维持细胞活力, 抑制氧化应激的作用已经得
到证实(Luz等2011)。外源AsA也广泛用于动植物
超低温保存中, 可减轻膜脂过氧化发生, 保护膜的
完整性(Almeida等2014)。本研究结果也显示, 外
源SOD、CAT和AsA 3种抗氧化剂在春石斛‘红梦
幻’ PLBs超低温保存中起到了提高冻后存活率的
效果, 且均在去装载时导入效果最佳, 这与前期实
验得到的在解冻-去装载阶段ROS过量产生与抗氧
化系统下降导致了氧化应激发生的结果相吻合,
说明外源抗氧化剂在去装载时可能抑制了ROS造
成的氧化伤害。3种外源抗氧化剂对春石斛PLBs
冻后存活率的相对提高效果依次为: CAT>AsA>
SOD, 认为高浓度CAT对抑制氧化应激的发生更有
效, 这与Shohael等(2006)的研究结果相似。
进一步通过ROS、MDA和抗氧化系统综合分
析3种抗氧化剂缓解氧化应激发生的可能机制。
SOD作为酶促清除系统的第一道防线, 主要负责
歧化O2·
–生成H2O2, 在抗氧化酶类中处于核心地位
(Calatayud和Barreno 2001)。去装载环节导入600
U·mL-1 SOD时, PLBs存活率仅提高了5.76%, 且只
显著提高了体内SOD本身的活性, 对氧化应激其
他指标均未产生显著影响, 这与前人研究结果不
一致(Thuwanut等2010), 可能是外源SOD不能有效
地参与到细胞的氧化还原反应中。CAT是植物体
内清除H2O2的主要酶类之一(Hernández等2001)。
去装载时导入400 U·mL-1 CAT显著降低了H2O2和
MDA的含量, 对O2·
–产生速率无显著影响, 表明外源
CAT特异性地清除了H2O2, 减轻膜脂过氧化程度,
极大提高冻后存活率。此外, Mukherjee和Choud-
huri (1983)提出抗氧化剂可调节受胁迫组织中内
源H2O2和AsA水平, 从而提高植物耐受性, 本研究
也发现外源CAT会导致AsA含量的升高, 说明CAT
除抑制H2O2的氧化伤害, 还可维持AsA调节氧化还
原平衡的能力, 两者共同参与H2O2的清除过程。
AsA在生物体中可直接同ROS反应, 将其还原; 还
可作为酶的底物在ROS清除中发挥重要作用(许丙
军等2006)。去装载时导入0.1 mmol·L-1 AsA显著
降低了O2·
–产生速率, 减轻了膜脂过氧化程度, 但是
对冻后存活率提高效果较外源CAT稍差, 可能是外
源AsA对H2O2的清除作用较小, 一定程度上说明了
H2O2比O2·
–更容易引起膜脂过氧化的发生, 但O2·
–存
在时, H2O2可能反应生成活性更高的·OH, 对细胞
造成更严重的损伤(Poobathy等2013)。此外, 外源
AsA也引起了SOD活性升高, 可能是O2·
–产生速率下
降的原因之一, 这种现象在其他外源AsA导入实验
中也有发现(马文涛等2002; 郑启伟等2006), 但是
其机理目前还不清楚。
综上所述, 在春石斛‘红梦幻’ PLBs玻璃化法
超低温保存中的导入不同浓度SOD、CAT和AsA
可不同程度地影响冻后存活率, 但均在去装载时
导入效果最好, 最佳导入浓度分别为600 U·mL-1、
400 U·mL-1和0.1 mmol·L-1, 且对春石斛PLBs冻后
存活率提高效果依次为: CAT>AsA>SOD。在去装
载时导入400 U·mL-1 CAT和0.1 mmol·L-1 AsA可提
高体内抗氧化酶或非酶等物质的含量, 并分别抑
制H2O2和O2·
–的产生, 减轻膜脂过氧化程度, 提高
PLBs冻后存活率。
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