全 文 ：#研究论文#
束花石斛及其相似种的 ⁄‘„分子鉴别
丁小余t ou o徐珞珊t o王峥涛t o徐 红t o周开亚u
k t q中国药科大学 中药学院 o江苏 南京 utssv{ ~
u q南京师范大学 生命科学学院 o江苏 南京 utss|zl
≈摘要  目的 }探讨束花石斛与同属相似种 }玫瑰石斛 !喇叭唇石斛 !报春石斛 !兜唇石斛等植物及药材鉴别的
⁄‘„分子标记 ∀方法 }对束花石斛及其相似种进行 µ⁄‘„ Œ×≥区序列比较研究 ∀结果 }尽管束花石斛及其相似种
的外部形态差异较小 o但在µ⁄‘„ Œ×≥序列上却存在着显著而稳定的差异 ∀在µ⁄‘„ Œ×≥区域中 o作者共挑选了 tx
个碱基位点用作鉴别束花石斛及其相似种的 ⁄‘„标记 ∀结论 }根据 µ⁄‘„ Œ×≥区碱基序列差异 o能准确鉴别束花
石斛及其相似种植物及药材 ∀
≈关键词  束花石斛 ~喇叭唇石斛 ~报春石斛 ~兜唇石斛 ~玫瑰石斛 ~µ⁄‘„Œ×≥区序列 ~⁄‘„ 序列鉴别
≈中图分类号  • u{u qx ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukussulsy2swsz2sx
石斛属植物是兰科附生植物的重要代表 o许多
种具有重要的药用价值 o国内外学者因此曾对其形
态特征 !分类地位 !化学成分 !药理活性 !人工繁殖等
方面进行过多方面的报道≈t  ∀ 5中国药典6规定石
斛的来源有铁皮石斛 ∆ενδροβιυ µ οφφιχιναλε Ž¬°∏2
µ¤ ·¨¬ª²!粉花石斛 ∆ενδροβιυ µ λοδδιγεσιι • ²¯©¨ !
束花 石 斛 ∆ενδροβιυ µ χηρψσαντηυ µ • ¤¯¯q ¬¨
¬±§¯ q!金钗石斛 ∆ενδροβιυ µ νοβιλε ¬±§¯ q!流苏石
斛 ∆ενδροβιυ µ φι µ βριατυ µ ‹²²®q等 x种 ∀束花石
斛具有养阴生津 !温胃润肺 !补肾益气 !润喉护嗓 !活
血明目等功效 o也是制作/脉络宁注射液0 !/石斛夜
光丸0 !/复方清咽宁0等复方中药的重要原料≈t ∗ y  ∀
鉴于束花石斛在叶鞘未脱落时其茎的外部形态酷似
兜唇石斛的茎 o同时当鲜药材茎上的叶鞘脱落时 o其
茎的外部形态与色泽又与玫瑰石斛 !喇叭唇石斛 !报
春石斛等鲜药材的外部特征非常相似k皆为深绿
色l o因此在药材收购的过程中常常会产生混淆 o为
保证用药安全有效 o准确鉴别束花石斛及其相似种
成了燃眉之急 ∀
近年来 o特定的 ⁄‘„ 序列不断被用于中药材
的鉴定研究≈z o| ott  o不仅准确可靠 o而且随着测序成
≈收稿日期  usst2s|2tt
≈基金项目  国家自然科学基金资助项目kvstzttwwl
≈通讯作者  电话 }tv|xtzvzsyy ∞2°¤¬¯}§¬±ª¬¼±­ƒ uyv q±¨ ·
本的降低也将逐渐廉价可行 ∀本文拟选择进化速率
较快的µ⁄‘„ Œ×≥区k转录间隔区l作为种间鉴别的
分子标记 o探讨束花石斛及其相似种植物及药材之
间的 ⁄‘„分子差异 o达到对束花石斛及其相似种
进行 ⁄‘„分子鉴别 ∀
1 材料
实验所用的束花石斛及其相似种的原植物采自
我国石斛主产区 }云南 !广西 !贵州等省区的原始森
林 o现被整丛栽种于中国药科大学药用植物园及实
验室以便及时取材和观察 o有关实验材料的详细情
况请参见表 t o每种植物均测试了来源于不同居群
表 t 实验材料
种名 标本号 采集地点 Š ±¨¥¤±®登录号
∆ . πρι µ υλινυ µ


÷ ≠ ⁄||svttl
÷ ≠ ⁄||st|
÷ ≠ ⁄||sws
云南勐腊
云南勐腊
广西天峨
„ƒvyu|tv


∆ . απηψλλυ µ

÷ ≠ ⁄||su|tl
÷ ≠ ⁄||svx
云南勐腊
云南勐腊
„ƒvxxxzv

∆ . λιτυιφλορυ µ

÷ ≠ ⁄||stwtl
÷ ≠ ⁄||svu
云南勐腊
云南勐腊
„ƒvxxxzt

∆ . χηρψσαντηυ µ


÷ ≠ ⁄||stutl
÷ ≠ ⁄||suw
÷ ≠ ⁄||swv
广西天峨
贵州三都
广西天峨
„ƒvxxxzu


∆ . χρεπιδατυ µ

÷ ≠ ⁄||ss{tl
÷ ≠ ⁄||sut
云南勐腊
云南勐腊
„ƒvxxxzw

注 }tl标本的序列已被 Š ±¨…¤±®收录
#zsw#
第 uz卷第 y期
ussu年 y月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quz o‘²qy
∏±¨ qoussu
的 u ∗ v个个体 o各标本由中国科学院植物研究所吉
占和教授以及丁小余鉴定 o保存于中国药科大学的
标本馆中 ∀
2 ⁄‘„序列测定方法
2 q1 总 ⁄‘„ 提取 取各样品新鲜原植物或药材
的叶片或茎 s qt ªo也可采用硅胶干燥材料 o用无菌
水冲洗干净 o在液氮中研成粉末 ∀根据 ±Œ„Š∞‘试
剂盒的使用指南进行总 ⁄‘„提取 ∀
2 q2 °≤ • 扩增 根据 ∞°°¤±∏¨¯等≈ts 对兰科植物
Œ×≥区的研究 o设计了一对石斛属 Œ×≥区的扩增引
物 °t o°u o序列如下 }°t 为 xχ2≤ Š× „„≤ „„Š2
Š× × × ≤≤ Š× „ŠŠ× Š„„≤2vχ o位于 t{≥上 ~°u为 xχ2
× × „× × Š„× „× Š≤ × × „„„≤ × ≤ „Š≤ ŠŠŠ2vχ o位于
uy≥上 ∀ °≤ • 扩增反应在 vs ˏ的体系中完成 o反
应液含 ts °°²¯#pt ×µ¬¶2‹≤¯o³‹ { qv oxs °°²¯#
pt Ž≤¯ot qx °°²¯ #pt  ª≤ u¯ os qt h ×µ¬·²± ÷2
tss o Ταθ酶 t˜ ow种 §‘×°各 txs °°²¯#pt o两个
引物各 ts ³ o⁄‘„ 模板约 tss ±ª∀反应在 °× ≤2
uss型 °≤ • 仪上进行 o循环参数为 |x ε 预变性 w
°¬±o然后经 |x ε 变性 t °¬±oxu ε 退火 wx ¶ozu
ε 复性 u °¬±o共 vs个循环后 ozu ε 延伸 z °¬±补
齐 o以 ⁄⁄‹u’代替模板 ⁄‘„作空白对照 ∀
2 q3 °≤ • 产物纯化 °≤ • 产物用 • ¬½¤µ§或 • ¤·2
¶²±试剂盒纯化 o按试剂盒操作指南进行 ∀
2 q4 ⁄‘„序列测定 用 …¬ª⁄¼ ר 测序试剂盒进
行测序反应 o测序反应的参数为 }¬¬ t ˏo纯化后
的 ⁄‘„ 片段 tx ∗ wx ±ªo °µ¬° µ¨t qy ³°²¯ o¥∏©©¨µ
t qu ˏo⁄⁄‹u’适量 ∀测序反应条件为 }|x ε 预变
性 x °¬±o|x ε vs ¶oxs ε us ¶oys ε w °¬±o共 vx
个循环 ∀扩增产物纯化后用 ts ˏ×≥• 溶解 o热循
环仪上变性 u °¬±o移入全自动测序专用管 ∀用
„…Œvts全自动测序仪进行序列测定 ∀
2 q5 ⁄‘„ 序列数据分析 Œ×≥t和 Œ×≥u的起止
范围参照 Š ±¨¥¤±®中兰科 Œ×≥范围 o所得 ⁄‘„ 序
列输入计算机后 o用 ≤ ∏¯¶·¤¯ ÷ 软件≈tw 对位排列 o并
辅以人工校对 ∀用  ∞Š„ u 软件≈tx 分析各样品
⁄‘„序列间的差异百分率和碱基替换数 ∀
3 结果
运用  ∞Š„ 软件对 x种植物 µ⁄‘„ Œ×≥序列
进行了排序 o结果如图tkt{≥ ouy≥片段已删除 o
x q{≥为阴影部分所示 o/ q0部位表示具相同碱基l ∀
本文 x种植物的 µ⁄‘„ Œ×≥序列已被收录于 Š ±¨2
¥¤±®中 o详情请见表 t ∀由于所测试的各种石斛不
存在种内差别 o故本文不列出相同序列 ∀
束花石斛及其相似种µ⁄‘„ Œ×≥区具有鉴别意
义的碱基位点如方框所示 o其中Œ×≥t区域有 x个位
点 ox q{≥区 v个位点 oŒ×≥u区域有 y个k图 tl ∀在
这些位点上 o虽然 w个相似种的碱基均相同 o但与束
花石斛均不同 o其位置及碱基变换情况列表 u ∀束
花石斛及其相似种µ⁄‘„ Œ×≥区的碱基替换数以及
遗传距离见表 v ∀
4 讨论
近几年来 o生物体内被称为/活化石0的 µ⁄‘„ o
因具比¦³⁄‘„更快的进化速率 o且不存在 ¦³⁄‘„
的母系单向遗传 o被用作研究科内 !属内 !种间的分
子系统演化及物种鉴别的重要分子标记≈{ ots  ∀有
关利用µ⁄‘„ Œ×≥区对药用植物进行过系统发育及
种类鉴别的研究 o国内外学者曾作过一些报道 ∀
• ±¨等对人参属 tu 种植物的 Œ×≥区进行了序列分
析 o发现西洋参与东亚种人参 !竹节参 !三七具有更
近的亲缘关系≈tt  ∀ ‘ª¤±等以保守的植物序列作引
物 o对核糖体 Œ×≥t2x q{≥2Œ×≥u的 ⁄‘„ 序列进行了
扩增 o有效鉴定了人参属 y 种药用植物以及 u 种常
见的人参伪品k紫茉莉和商陆l o同时利用 • ƒ°标
记技术对上述品种进行了有效的鉴别≈tu  ∀葛颂等
用核糖体 ⁄‘„的 Œ×≥序列探讨药用植物裂叶沙参
的系统位置 o并讨论了 Œ×≥片段在沙参属系统学研
究中的价值≈{  ∀赵志礼运用µ⁄‘„ Œ×≥序列鉴定了
山姜属红豆蔻及其同属相似种≈|  ∀蔡金娜等曾利
表 u 束化石斛 ∆ . χηρψσαντηυ µ 及其相似种 µ⁄‘„ Œ×≥区
的差异性位点
µ⁄‘„ Œ×≥区的碱基位点
k从 x.端起l
束花石斛的碱基

相似种的同样
位点的碱基
{v Š „
{w „ ×
|u ≤ ×
|y „ ≤
tvy „ ≤
tzt × „
vv{ „ ≤
vx| „ Š
vy| × Š
wvs „ Š
w|{ × Š
xtt ≤ ×
xuw × ≤
x|v × Š
yuv ≤ ×
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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∏±¨ qoussu
表 v 束花石斛 ∆ . χηρψσαντηυ µ 及其相似种 µ⁄‘„ Œ×≥区的碱基替换数k对角线上方l以及遗传距离k对角线下方l
∆ . χηρψσαντηυ µ ∆ . λιτυιφλορυ µ ∆ . απηψλλυ µ ∆ . πρι µ υλινυ µ ∆ . χρεπιδατυ µ
∆ . χηρψσαντηυ µ p z{ {s zz zx
∆ . λιτυιφλορυ µ tu .v{ p {{ {{ |w
∆ . απηψλλυ µ tu .yw tv .{x p yt |v
∆ . πρι µ υλινυ µ tu .tw tv .|s | .x{ p {{
∆ . χρεπιδατυ µ tu qty tx qu{ tx qsu tw quu p
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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图 t 束化石斛 ∆ . χηρψσαντηυ µ 及其相似种的 µ⁄‘„ Œ×≥区排序图
用µ⁄‘„ Œ×≥序列对不同居群蛇床的进行了居群鉴
别≈z  ∀∞°°¤±∏¨¯等对兰科的大多数属运用 µ⁄‘„
Œ×≥序列进行了分子系统学研究 o阐述了兰科大多
数属的系统演化地位≈ts  o但遗憾的是没有涉及到
石斛属植物 µ⁄‘„ Œ×≥区的研究 ∀ ¤∏等利用 µ⁄2
‘„ Œ×≥区部分序列对石斛属部分药材进行了鉴
别 o它们只对 Œ×≥u和 x q{≥的部分序列进行测序 o
未对 Œ×≥t区域进行测序≈tv  ∀
本文通过对束花石斛及其相似种µ⁄‘„ Œ×≥区
全序列的比较研究 o发现束花石斛与其相似种间存
在较大的 !稳定的差异 o碱基替换总数高达 zx ∗ {s o
遗传距离为 tu qtw h ∗ tu qyw h o在本试验中尚未发
现种内居群间的差异 ∀在束花石斛与其相似种 µ⁄2
‘„ Œ×≥区的全序列内 o经过  ∞Š„ 分析软件的对
位排列 o我们共挑选出 tx个具有鉴别意义的碱基位
点 o其中 Œ×≥t区域有 y个位点 oŒ×≥u区域有 y个 o
另外在 x q{≥保守区还有 v个位点 ∀在这 tx个位点
上 o虽然 w个相似种每个的碱基均相同 o但与束花石
斛均不同 o因此它们的 µ⁄‘„ Œ×≥区序列特征是鉴
别束花石斛及其相似种极好的分子标记 ∀利用特定
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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⁄‘„ 序列鉴定原植物及中药材 o可完全消除鉴别性
°≤ • 中存在的假阳性现象 o既准确又可靠 ∀随着测
序成本的日益降低 o此方法将逐渐变得切实可行 ∀
≈参考文献 
≈t  王康正 o高文远 q石斛属药用植物研究进展 q中草药 ot||z ~u{
ktsl }yvv q
≈u  吉占和 q中国植物志 qt|卷 q北京 }科学出版社 ot||| qyz q
≈v  陈心启 o吉占和 q中国兰花全书 q北京 }中国林业出版社 o
t||{ qtxv q
≈w  中国科学院植物研究所 q中国高等植物图鉴 q第五册 q北京 }科
学出版社 ot|{v qy|y q
≈x  吉占和 q中国石斛属的初步研究 q植物分类学报 ot|{s ot{
kwl }wuz q
≈y  包雪声 o顺庆生 o陈立钻 q中国药用石斛 q上海 }复旦大学出
版社 o上海医科大学出版社 ousst q
≈z  蔡金娜 o周开亚 o徐珞珊 q不同居群蛇床的 µ⁄‘„ Œ×≥ 序列分
析 q药学学报 ousss ovxktl }xy q
≈{  葛 颂 o… „ ≥¦«¤¤¯ o洪德元 q用核糖体 ⁄‘„的 Œ×≥序列探讨裂
叶沙参的系统位置 ) ) ) 兼论 Œ×≥片段在沙参属系统学研究中
的价值 q植物分类学报 ot||z ovxkxl }v{x q
≈|   «¤²oŽ≠ «²∏o ‹ ⁄²±ªo¨·¤¯ q ≤«¤µ¤¦·¨µ¶²© ±µ⁄‘„ Œ×≥
• ª¨¬²± ≥¨´ ∏¨ ±¦¨¶²© ƒµ∏¬·¶²© Αλπινια γαλανγα ¤±§ ׫¨¬µ„§∏¯2
·¨µ¤±·¶q °¯ ¤±·¤ ° §¨¬¦¤ousst oyz }v{t q
≈ts  ∞°°¤±∏¨¯° ⁄²∏½¨ µ¼ o„¯¨ ¦  °µ¬§ª¨ ²± o°¤∏¯ Ž²µ¨¶ ‹ ° o¨·¤¯ q
 ²¯ ¦¨∏¯¤µ°«¼¯ ²ª¨ ±¨ ·¬¦¶²© ⁄¬¶¨¤¨ k’µ¦«¬§¤¦¨¤¨ l } „ ≤²±·µ¬¥∏·¬²±
©µ²° ‘∏¦¯ ¤¨µ •¬¥²¶²°¤¯ Œ×≥ ≥¨´ ∏¨ ±¦¨ q „ ° µ¨¬¦¤± ²∏µ±¤¯ ²©
…²·¤±¼ ot||| o{ykyl }{{z q
≈tt  • ±¨ o¬°° µ¨∞ „ q °«¼¯ ²ª¨ ±¼ ¤±§ …¬²ª¨ ²ªµ¤³«¼ ²© Παναξ q
k·«¨ Š¬±¶¨±ª Š ±¨∏¶o „µ¤¯¬¤¦¨¤¨ l }Œ±©¨ µ¨±¦¨¶©µ²° Œ×≥ ≥¨´ ∏¨ ±¦¨¶
²© ‘∏¦¯ ¤¨µ •¬¥²¶²°¤¯ ⁄‘„ q  ²¯ ¦¨∏¯¤µ °«¼¯ ²ª¨ ±¼ ∞√²¯∏·¬²±o
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Παναξ ≥³¨ ¦¬¨¶q°«¼·²¦«¨ °¬¶·µ¼ ot||| oxs }z{z q
≈tv  פ¬2 • ¤¬¤∏o°¤±ª2≤«∏¬≥«¤º o∏± • ¤±ªo¨·¤¯ q„∏·«¨ ±·¬¦¤·¬²± ²©
 §¨¬¦¬±¤¯ ∆ενδροβιυ µ ≥³¨ ¦¬¨¶¥¼ ׫¨ Œ±·¨µ±¤¯ ×µ¤±¶¦µ¬¥¨ §≥³¤¦2
µ¨²© •¬¥²¶²°¤¯ ⁄‘„ q °¯ ¤±·¤  §¨¬¦¤ousst oyzkxl }wxy q
≈tw  „¬¼¤µ„ q ׫¨ ˜¶¨ ²© ≤˜≥× „ • ¤±§≤˜≥× „÷ ©²µ  ∏¯·¬2
³¯¨≥¨´ ∏¨ ±¦¨ „ ¬¯ª±° ±¨·q  ·¨«²§¶  ²¯ ¦¨∏¯¤µ…¬²¯²ª¼ ousss otvu }
uut q
≈tx  Ž∏°¤µ≥ o פ°∏µ¤ Žo¤®²¥¶¨± Œ … o¨·¤¯ q  ∞Š„u }  ²¯ ¦¨∏¯¤µ
∞√²¯∏·¬²±¤µ¼ Š ±¨¨ ·¬¦¶ „±¤¯¼¶¬¶≥²©·º¤µ¨ q …¬²¬±©²µ°¤·¬¦¶o usst o
tzktul }tuww q
Μολεχυλαρ Αυτηεντιχατιον οφ ∆ενδροβιυµ χηρψσαντηυµ
φροµ ιτσ Αλλιεδ Σπεχιεσ οφ ∆ενδροβιυµ
⁄Œ‘Š ÷¬¤²2¼∏t ou o ÷ ˜ ∏²2¶¤±t o • „‘Š «¨ ±ª2·¤²t o ÷ ˜ ‹²±ªt o ‹ ’ ˜ Ž¤¬2¼¤u
kt q⁄¨ ³¤µ·° ±¨·²© °«¤µ°¤¦²ª±²¶¼ o≤«¬±¤ °«¤µ°¤¦¨∏·¬¦¤¯ ˜±¬√ µ¨¶¬·¼ o
‘¤±­¬±ªutssv{ o¬¤±ª¶∏≤«¬±¤~
u q≤²¯¯¨ ª¨ ²© ¬©¨ ≥¦¬¨±¦¨¶o ‘¤±­¬±ª ‘²µ°¤¯ ˜±¬√ µ¨¶¬·¼ o
‘¤±­¬±ªutss|z o¬¤±ª¶∏o≤«¬±¤l
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ §¨©¬±¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ¦«¤µ¤¦·¨µ¶·²§¬¶·¬±ª∏¬¶« ∆ . χηρψσαντηυ µ ©µ²°¬·¶¤¯ ¬¯¨§¶³¨ ¦¬¨¶ ∆ . πρι µ υλινυ µ ,
∆ . λιτυιφλορυ µ , ∆ . απηψλλυ µ , ∆ . χρεπιδατυ µ . Μετηοδ : × «¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦¶²© ∆ . χηρψσαντηυ µ ¤±§¬·¶¤¯ ¬¯¨§¶³¨ ¦¬¨¶
º µ¨¨ ¦²°³¤µ¨§q × «¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²©µ⁄‘„ Œ×≥ µ¨ª¬²±¶º µ¨¨ ¬¨³¯²¬·¨§·² ¬¨³¯²µ¨ ·«¨ √¨¬§¨ ±¦¨ ©²µ¤∏·«¨ ±·¬¦¤·¬²± ∆ . χηρψσαντηυ µ ¤±§
¬·¶¤¯ ¬¯¨§¶³¨¦¬¨¶q Ρεσυλτ : „ ·¯«²∏ª«·«¨ °²µ³«²¯²ª¬¦¤¯ §¬©©¨ µ¨±¦¨ º¤¶¶¯¬ª«·o·«¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ §¬©©¨ µ¨±¦¨ ²©Œ×≥ µ¨ª¬²±¶¤°²±ª©¬√¨µ⁄‘„¶
º¤¶²¥√¬²∏¶¤±§¶·¤¥¯¨qƒ¬©·¨ ±¨ ¶¬·¨¶²©Œ×≥ µ¨ª¬²± º µ¨¨ §¨©¬±¨ §¤¶⁄‘„ ¦«¤µ¤¦·¨µ·²¬§¨ ±·¬©¼ ∆ . χηρψσαντηυ µ ©µ²° ·«¨ ²·«¨µ©²∏µ
¤¯ ¬¯¨§¶³¨ ¦¬¨¶qΧονχλυσιον : × «¨ §¬©©¨ µ¨±¦¨ ²©µ⁄‘„ Œ×≥ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶¦¤± ¥¨ ∏¶¨§·²¤∏·«¨ ±·¬¦¤·¨ ¤¦¦∏µ¤·¨¯ ¼ ∆ . χηρψσαντηυ µ ©µ²°·«µ¨¨
¤¯ ¬¯¨§¶³¨ ¦¬¨¶²© ∆ενδροβιυ µ q
[ Κεψ ωορδσ] ∆ . χηρψσαντηυ µ ; ∆ . λιτυιφλορυ µ ; ∆ . πρι µ υλινυ µ ; ∆ . απηψλλυ µ ; ∆ . χρεπιδατυ µ ~¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²©µ⁄‘„ Œ×≥
µ¨ª¬²± ~¤∏·«¨ ±·¬¦¤·¬²± ¥¼ ⁄‘„ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨
≈责任编辑 袁桂京 
本刊自 t||x年 t月 t日开始对来稿收取处理费k每篇 tsss字以下 vs元 otsss字以上 xs元l o请作者在寄发稿件的同时
将处理费通过邮局寄汇本刊k请勿在稿件中夹带现金l ∀汇单上请注明论文题目及第一作者姓名 ∀收款地址 }北京东直门内
北新仓 t{号中国中药杂志 o邮编 tsszss ∀
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