全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (9) : 1381 - 1384
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 12 - 11; 修回日期 : 2009 - 06 - 15
基金项目 : 国家林业局 ‘948’项目 (2006242C07, 200524237)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wangyan@caf1ac1cn)
春石斛的多倍体诱导
郑宝强 1 , 张　莹 1, 2 , 王　雁 13 , 李振坚 1 , 朱向涛 1 , 律春燕 1
(1 中国林业科学研究院林业研究所 , 国家林业局林木培育重点试验室 , 北京 100091; 2 中国林业科学院亚热带林业研
究所 , 浙江富阳 311400)
摘 　要 : 在离体培养条件下比较了秋水仙素不同浓度、不同处理时间诱导杂种春石斛体细胞染色体加
倍的效果。结果表明 , 0106%秋水仙素处理 12 h的诱变效果最佳 , 诱变率达 6911%。用组织培养结合不定
芽诱导技术获得了稳定的多倍体变异株。变异株与正常株形态差异明显 , 气孔数及大小之间差异显著。二
倍体对照 2n = 2x = 38, 变异株 2n = 4x = 76 (四倍体 ) , 同时也发现存在嵌合体现象。
关键词 : 石斛 ; 春石斛 ; 多倍体 ; 秋水仙素 ; 染色体
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0921381204
Polyplo id Induction of Nob ile2type D endrobium
ZHENG Bao2qiang1 , ZHANG Ying1, 2 , WANG Yan13 , L I Zhen2jian1 , ZHU Xiang2tao1 , and LüChun2yan1
(1 Research Institu te of Forestry, Ch inese A cadem y of Forestry, Key L abora tory of Tree B reed ing and Cultivation, S tate Forestry
A dm inistration, B eijing 100091, China; 2 R esearch Institu te of Subtropical Forestry, Ch inese A cadem y of Forestry, Fuyang,
Zhejiang 311400, China)
Abstract: A hybrid of nobile2type D end robium was treated with colchicines at different concentration and
time duration in vitro. The results showed that the best effect was obtained by the treatment of 0106% colchi2
cines with 12 hours and its induction rate was 6911%. Comparing the characteristics of p lants and stomas,
there were remarkable difference between the treatment and the control. Chromosome observation found that
the chromosome number of treated p lantswas 76 and the chromosome number of the control was 38, indicating
the tetrap loid (2n = 4x = 76) of nobile2type D endrobium was induced successfully. The m ixer2fold phenome2
non was also found among treatment p lants.
Key words: D end robium ; nobile2type D end robium ; polyp loid; colchicine; chromosome
石斛属 (D endrobium ) 为兰科 (O rchidaceae) 的第二大属 , 不仅具有较高的药用价值 , 而且由于
其切花花期长 , 花色艳丽 , 也是目前国际花卉市场主要的盆花和切花品种之一。目前国内外学者对石
斛属的研究重点主要集中在种质资源 (高江云 , 1996 )、遗传背景 (L i et al. , 2006; Yue et al. ,
2006)、常规育种 (B ill & W ayue, 2002 )、转化体系及基因克隆 ( Yu et al. , 2000; Yang et al. ,
2002, 2003) 等方面 , 化学诱变育种领域的研究相对较少。倍性育种作为一种快捷的育种方法 , 创造
出的多倍体植物通常具有植株粗壮 , 花朵硕大 , 花期长 , 适宜性增强等特点 , 而且异源多倍体还可以
克服远源杂交不育的弊端 , 形成性状稳定的新品种。
本研究中以春石斛二倍体不定芽为材料进行多倍体诱导 , 为尽快培育出花朵硕大、花色艳丽、适
应性强的石斛新品种奠定基础。
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
1　材料与方法
试验材料为春石斛 D en. snowflake‘Red star’与 D en. white rabbit‘Sakurahime’的杂交种。对杂
交种子进行无菌播种后获得大量无菌苗 , 经体细胞染色体鉴定为二倍体 , 2n = 2x = 38。把二倍体材料
接种在 MS培养基 , 经 40 d分化培养获得大量丛生芽苗。
选择该丛生芽苗分别用 0102%、0104%、0106%和 0108%的秋水仙素溶液浸泡进行多倍体诱导 ,
每个浓度处理的时间分别为 12 h和 24 h, 浸泡后用无菌水冲洗干净后接种到 MS培养基上 , 先置于
12～20μmol·m - 2 ·s- 1弱光照下 6～8 h·d - 1培养 5～6 d, 然后再置于 40μmol·m - 2 ·s- 1 , 12 h·
d - 1光照下培养 , 培养温度均为 (25 ±2) ℃。
将形态明显变异株的茎段接种到 MS + 62BA 110 mg·L - 1 +NAA 011 mg·L - 1培养基上继代培养
2～3次 , 从中选择变异明显的植株进行鉴定 , 以获得稳定的多倍体植株。
撕取植株基部向上第 2～3叶片的下表皮制片 , 在 OLYMPUS显微镜下观察并测量气孔大小 , 随
机分别测定 30个二倍体和四倍体气孔的长径和短径 , 计算其平均值 , 以气孔显著增大作为变异的初
步鉴定指标。
取气孔显著增大的变异植株 50株 , 每株取根数总量的 1 /3为染色体观察试材 , 用根尖作染色体
观察。
采用改良苯酚品红染色法制片 , 在显微镜下观察并摄像。
2　结果与分析
211　秋水仙素浸泡法对春石斛的诱导效果
由表 1可以看出 , 0106%秋水仙素处理 12 h诱变率最高 , 为 6911% , 死亡率 2719% , 其次是
0104%秋水仙素处理 24 h, 为 5510% , 但死亡率为 3112%。
表 1　秋水仙素不同浓度与处理时间对春石斛不定芽的诱变效应
Table 1　The induction effects of colch ic ines concen tra tion and dura tion on buds of nob ile2type D endrobium
秋水仙素 /%
Colchicines
处理时间 / h
Treatment time
处理数
Treatment number
死亡率 /%
Death rate
诱变率 /%
Mutation rate
0102 12 60 1010 2313 dD
24 80 2715 4010 cC
0104 12 56 2114 3715 cC
24 80 3112 5510 bB
0106 12 68 2719 6911 aA
24 72 4311 4013 cC
0108 12 60 4117 3617 cC
24 58 5619 2913 cCD
　　注 : 大小写字母表示 0101和 0105显著性水平。
Note: Cap ital and lowercase indicate significant difference at 0101 and 0105 levels respectively.
212　多倍体的初步鉴定
春石斛四倍体植株与二倍体相比 , 顶芽和侧芽膨大成球状 , 假鳞茎变粗 , 下层叶片多呈畸形 , 逐
渐脱落 , 新生叶宽、短而厚 , 呈圆锥形 , 叶色浓绿 , 叶表面粗糙 , 凹凸不平 , 有泡状凸起 , 叶片脆而
易折断 (图 1)。
不定芽生长明显受到抑制 , 生长缓慢 , 生根较晚 , 且根短而粗壮 , 并出现轻微木质化。这种现象
在齿瓣石斛上也有发现 (李涵 等 , 2005)。
2831
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　9期 郑宝强等 : 春石斛的多倍体诱导 　
图 1　春石斛四倍体与二倍体植株 ( A) 和叶片 ( B) 的比较
F ig. 1　Com par ison of tetraplo id and d iplo id nob ile2type
D endrobium ( A) and leaves ( B)
四倍体植株单位面积的气孔数明显减少 , 气孔大 (图 2) , 保卫细胞中叶绿素含量也明显增加。
二倍体气孔为 1212μm ×718μm。四倍体气孔为 1518μm ×1116μm, 气孔的长径和短径分别比
二倍体增加 2912%和 4917%。
四倍体的气孔接近于圆形 , 而二倍体则多呈长圆形。
图 2　春石斛四倍体 (左 ) 和二倍体 (右 ) 气孔大小比较
F ig. 2　Com par ison of stoma size of tetraplo id ( left) and d iplo id ( r ight)
nob ile2type D endrobium
二倍体春石斛的染色体为 2n = 2x = 38, 四倍体为 2n = 4x = 76 (图 3, A、B )。同时也观察到染色
体数为 2n = 64 (图 3, C) 和 2n = 72的嵌合体现象 (图 3, D) , 占筛选出的变异植株的 32%。
春石斛染色体小 , 数量多 , 有重叠现象。根据可数染色体数接近或超过 60的情况看 , 初步筛选
的变异植株约 80%为四倍体或四倍体嵌合体。
3831
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
图 3　春石斛二倍体 ( A) , 四倍体 ( B) 和非整倍体染色体 ( C, D )
F ig. 3　Chrom osom es of d iplo id ( A) , tetraplo id ( B) and aneuplo id nob ile2type D endrobium ( C, D )
我们将进一步在田间对其性状进行观察并开展田间的一系列试验 , 期望筛选出具大花、奇花、抗
病性好等优良商品性状的品系。
References
B illL , W ayne H. 2002. D endrobium and its relatives. USA: Timber Press: 8 - 35.
L i Han, Zheng Si2xiang, Long Chun2lin. 2005. Induction of polyp loid of D endrobium devonianum. Acta Botanica Yunnaniea, 27 ( 5) : 552 -
556. ( in Chinese)
李　涵 , 郑思乡 , 龙春林. 2005. 齿瓣石斛多倍体的诱导初报. 云南植物研究 , 27 (5) : 552 - 556.
Gao J iang2yun. 1996. Conservation and utilization of D endrobium p lants in Xishuangbanna. Acta Horticulturae Sinica, 23 ( 2) : 60 - 64. ( in
Chinese)
高江云. 1996. 西双版纳石斛资源的保护利用. 园艺学报 , 23 (2) : 60 - 64.
L i Tong2xiang, W ang J in2ke, Bai Yun2fei, Lu Zu2hong. 2006. D iversity supp ression2subtractive hybridization array for p rofiling genom ic DNA
polymorphism s. Journal of Integrative Plant B iology, 48 (4) : 460 - 467.
Yang S H, Yu H, Goh C J. 2002. Isolation and characterization of the orchid cytokinin oxidase DSCKX1 p romoter. Journal of Experimental Bota2
ny, 53: 1899 - 1907.
Yang S H, Yu H, Goh C J. 2003. Functional characterization of a cytokinin oxidase gene DSCKX1 in D endrobium orchid. PlantMolecular B iolo2
gy, 51: 237 - 248.
Yu H, Yang S H, Goh C J. 2000. DOH1 , a class 1 knox gene, is required for maintenance of the basic p lant architecture and floral transition in
orchid. Plant Cell, 12: 2143 - 2159.
Yue G H, Lam2Chan L T, Hong Y. 2006. Development of simp le sequence repeat ( SSR) markers and their use in identification of D endrobium
varieties. Molecular Ecology Notes, 6 (3) : 832 - 834.
4831