全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (3): 356–364 doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0691356
收稿 2015-12-28 修定 2016-02-25
资助 宁波市重大科技专项(2014C11002)和浙江省重中之重学
科“生物工程”开放基金(KF2015008)。
* 通讯作者(E-mail: wyynb2009@163.com)。
杜鹃花EST-SSR标记的开发及遗传多样性分析
李美芹1,2, 潘叶羽2, 钱萍仙2, 卢丹2, 明萌1,2, 饶慧云2, 刘蓉2, 谢晓鸿2, 吴月燕2,*
1上海海洋大学水产与生命学院, 上海201306; 2浙江万里学院生物与环境学院, 浙江宁波315100
摘要: 从NCBI公共数据库下载2 535条杜鹃花相关表达序列标签(expressed sequence tags, EST), SSR位点搜索共得到435个
位点。利用Primer5.0对重复基元数较大的30个SSR位点设计引物, 通过混合基因池进行引物初筛, 25对引物可扩增出条带;
利用非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)研究25对SSR引物的PCR扩增特点。14个SSR位点为多态性, 各位点的等位基因介于
2~5个, 平均等位基因数3.8个; 观望杂合度Ho、期望杂合度He、多态信息含量PIC范围分别为0~0.8333、0.0816~0.7172、
0.0767~0.6471; 多态位点中有5个高度多态、7个中度多态和2个低度多态。非加权配对算术平均法(UPGMA)聚类分析结
果表明: 开发的14个EST-SSR标记能有效鉴定种质资源, 对于杜鹃花品种的鉴定与遗传多样性分析具有重要应用价值。
关键词: 杜鹃花; EST-SSR; PAGE; 遗传多样性
杜鹃花是杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rho-
dodendron)植物的总称, 又称为山踯躅、山石榴、
映山红等(李波等2011), 属常绿或落叶灌木, 花种
类繁多, 花色绚丽, 花、叶兼美, 素有木本花卉之王
的称号 , 具有极高的观赏和药用价值 (张艳红
2007)。杜鹃花新种质资源的开发多依靠杂交育种,
选择遗传距离和亲缘关系较远的亲本进行远缘杂
交对于开发丰富、有价值的新种质至关重要(兰熙
等2012)。目前, 杜鹃花种质资源分类混乱、亲缘
关系复杂, 给杂交育种选择亲本带来困难, 难以实
现育种目标。随着分子标记技术的发展, 利用分子
标记技术探究种质资源亲缘关系的问题已经成为
一种趋势。目前, 许多学者利用不同的分子标记方
法对杜鹃花种质资源多样性进行了研究。肖政等
(2015)利用15条ISSR引物研究25份杜鹃花遗传多
样性, 共得到210条多态性条带, 将25份种质资源聚
成两类; 陈建梅等(2014)利用ITS条形码技术分析了
北京云蒙山22份杜鹃花材料的遗传多样性; 吴月燕
等(2013)利用SRAP分子标记技术对西洋杜鹃的分
类和遗传多样性进行了研究; 李辛雷(2012)利用
SSR、AFLP分子标记技术研究杜鹃红山茶的遗传
多样性; 周兰英(2008)利用RAPD分子标记技术研
究43种杜鹃花属植物的遗传多样性和亲缘关系。
简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)又
称微卫星DNA (microsatellite DNA), 是广泛存在于
真核和原核生物基因组中1~6个核苷酸基元串联
重复而成的DNA序列(Tautz和Renz 1984), 具有多
态性高, 共显性, 通用性高等特点(贾继增1995)。
根据SSR来源可将SSR分为基因组SSR和EST-SSR。
传统的基因组SSR标记开发需要构建基因组文库,
对克隆进行逐一鉴定, 造成费时、费力且成本高
的现象(张增翠和侯喜林2004; 陈怀琼等2009); 而
EST-SSR来源于基因表达区域, 可直接反映基因的
多样性, 在不同物种间具有良好的通用性(Powell
等1996), EST-SSR标记不仅具有传统SSR标记多态
性高、重复性好与共显性等特点, 而且无需构建
基因组文库, 无需进行杂交和测序, 并且开发成本
低。近年来, 大量快速增长的EST数据已成为SSR
的重要来源, 基于EST序列开发SSR标记在梨(王西
成等2010; 吕彦霞等2015)、荔枝(向旭等2010; 孙
清明等2011)、桃(Vendramin等2007)、核桃(齐建
勋等2011)、猕猴桃(廖娇等2011)、小桐子(杨春和
刘爱忠2011)、小麦(潘海涛等2010)、金银花(蒋超
等2012)、杨树(宋跃朋等2010)、甘蓝(陈琛等
2010)和大白菜(李丽等2009)等多种植物中均有报
道。在杜鹃花属植物中, 王书珍等(2014)对1 323条
EST序列进行了整理分析, 得到65个SSR位点, 为
杜鹃花的遗传多样性分析提供了依据; Nian等
(2010)开发了15个马缨杜鹃微卫星位点并研究了
杜鹃花的遗传结构和同族杜鹃花的基因流向; Tan
等(2009)利用FIASCO方法从映山红上开发了8个
标记; Dendauw等(2001)开发了8对标记引物, 其中
6对有较好的扩增效果和多态性。到目前为止, 国
内外仅有少量关于杜鹃花EST-SSR分子标记建立
研究的报道。
李美芹等: 杜鹃花EST-SSR标记的开发及遗传多样性分析 357
浙江宁波地区是杜鹃花原产地之一, 种质资
源丰富, 主要包括本地原始种质资源、引进种质
资源以及本地杂交种质资源等, 由于种质资源引
进过程中音译问题、杂交育种的种质资源命名随
意性及种属关系不当等问题造成了种质资源分类
混乱的现象, 出现了一物多名或一名多物等现象,
给杜鹃花种质资源的进一步开发带来了很大的困
难。另外, 杂交育种是杜鹃花选育中的主要手段,
杂交育种过程中, 盲目的选择育种亲本, 极易造成
新种质资源开发过程中的人力、物力的浪费, 解
决我国杜鹃花种质资源的系统分类问题是杜鹃花
种质资源发展的迫切要求(刘晓青等2011)。本研
究以宁波地区的原始种、杂交育种和园林绿化中
常用的杜鹃花种质资源为研究材料, 旨在通过分
析杜鹃花的EST序列中的SSR位点, 开发杜鹃花
EST-SSR引物, 探究宁波地区杜鹃花种质资源的遗
传多样性及其遗传结构, 为杜鹃花的系统分类和
新种质资源的开发提供技术支持和理论指导。
材料与方法
1 试验材料
供试杜鹃花(Rhododendron sp.)样品取自宁波
北仑万景杜鹃园、四明山国家森林公园和宁波植
物园, 根据Chamberlain等(1996)提出的8个杜鹃花
亚属分类系统, 将24个种质资源进行分类: ‘闹羊
花’归类到羊踟躅亚属; ‘映山红’、‘满山红’、‘溪
畔杜鹃’和‘夏红’归类到映山红亚属; ‘马银花’和
‘刺毛杜鹃’归类到马银花亚属; ‘云锦杜鹃’归类到
常绿杜鹃亚属; 其余材料均未进行系统分类。供
试材料详细信息见表1。
2 试验方法
2.1 DNA提取
采用改良CTAB法(Porebski等1997)提取杜鹃
花叶片基因组DNA, 并针对其自身多糖含量丰
富、叶表绒毛量多的特性, 利用固体聚乙烯吡咯烷
酮(PVP)、5%PVP溶液和β-巯基乙醇去除叶片中
的多糖类物质。核酸纯度测定仪(Smart Spec Plus,
BIO-RAD)测定样品浓度及纯度, 取3.0 μL DNA样
品与1.0 μL 6×Loading Buffer混匀后用1.0%琼脂糖
凝胶电泳检测DNA样品完整性和纯度, 核酸染料
(全式金, R322)显色, DL1, 5000 Marker (Bio Basic
表1 供试杜鹃花材料
Table 1 Rhododendron accessions for the experiment
编号 品种名称 来源 亚属 备注
1 ‘紫鹤’ 日本 未知 引进种
2 ‘闹羊花’ 中国 羊踟躅亚属 原种
3 ‘粉鹤’ 日本 未知 引进种
4 ‘琉球红’ 日本 未知 引进种
5 ‘白鹤’ 日本 未知 引进种
6 ‘天女舞’ 未知 未知 未知
7 ‘恰恰’ 美国 未知 引进种
8 ‘粉红泡泡’ 美国 未知 引进种
9 ‘小叶毛鹃’ 西欧 未知 引进种
10 ‘秋水波’ 中国 未知 杂交种
11 ‘华顶杜鹃’ 中国 未知 未知
12 ‘肯特’ 比利时 未知 引进种
13 ‘十二乙重’ 中国 未知 杂交种
14 ‘红苹果’ 中国 未知 杂交种
15 ‘绿色光辉’ 美国 未知 引进种
16 ‘溪畔杜鹃’ 中国 映山红亚属 原种
17 ‘映山红’ 中国 映山红亚属 原种
18 ‘满山红’ 中国 映山红亚属 原种
19 ‘牡丹红’ 西欧 未知 引进种
20 ‘夏红’ 中国 映山红亚属 杂交种
21 ‘刺毛杜鹃’ 中国 马银花亚属 原种
22 ‘马银花’ 中国 马银花亚属 原种
23 ‘美人笑’ 西欧 未知 引进种
24 ‘云锦杜鹃’ 中国 常绿杜鹃亚属 原种
Inc)为标准分子量对照, 紫外凝胶成像系统成像观
察。根据检测结果稀释DNA至50 ng·μL-1, 供后续
PCR扩增实验使用, 保存于–20°C冰箱备用。
2.2 EST-SSR位点筛选
从NCBI (National Center for Biotechnology In-
formation)公共数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
sites/entrez)下载杜鹃花2 535条EST序列(截至2015
年11月), 保存为Fasta格式。用BioEdit编辑EST序
列, 剔除小于150 bp的EST序列, 利用简单重复序
列鉴定工具(Simple Sequence Repeat Identification
Tool, SSRIT) (http://archive.gramene.org/db/markers/
ssrtool)在线软件分析EST序列, 查找SSR位点。参
数设置标准: 重复基元一核苷酸、二核苷酸、三
核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重
复次数分别为12次、6次、4次、3次、3次、3次
(王书珍等2014; 廖娇等2011; 陈琛等2010)。
2.3 EST-SSR引物设计
对筛选出含有SSR位点的EST序列, 剔除SSR
植物生理学报358
位点旁邻序列小于30 bp的EST序列后, 利用Primer
5.0进行引物设计, 引物长度18~20 bp, GC含量
40%~60%, Tm值50~65°C之间, 产物长度100~350
bp。引物设计原则: 无发卡结构, 无二聚体, 无错配,
并且尽量无交叉二聚体。利用Oligo6.0软件对所设
计出的引物进行评价分析, 选取引物评分在90~100
之间, 确保可扩增出目的片段; 由于SSR位点侧翼序
列为保守序列, 为保证目标序列的扩增性, 一般将
目标产物的长度控制在100~350 bp之间。设计的引
物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.4 EST-SSR引物筛选
选取6个观赏性状差异较大的品种‘紫鹤’、
‘琉球红’、‘恰恰’、‘美人笑’、‘映山红’和‘云锦杜
鹃’的基因组DNA等量混合构建混合基因池。引
物初步筛选条件: 将所有引物在Mg2+浓度为2.5
mmol·L-1、Tm 56°C条件下, 用混合基因池模板进
行PCR扩增 , 反应体系10 μL: 1×Buffer, 2 .0
mmol·L-1 MgCl2, 0.2 mmol·L
-1 dNTPs, 0.25
mmol·L-1的上下游引物, 0.5 U的DNA Polymerase,
以及2.5 ng的DNA模板, 加ddH2O补齐体系。PCR
扩增反应在Eppendorf公司生产的Mastercycler普通
梯度PCR仪上进行。初步筛选反应程序: 94°C预变
性4 min; 94°C变性40 s, 56°C退火40 s, 72°C延伸1
min, 35个循环; 72°C延伸7 min; 4°C保存。PCR扩
增产物利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测, 核酸染
料染色, 紫外凝胶成像系统成像观察。选取扩增
结果为明显的单一条带或两条条带(亮带较弱带强
2倍以上)的引物保留(刘果等2012), 用于SSR多态
性分析。
2.5 SSR位点分析
用筛选出的引物对24个杜鹃花个体进行SSR
位点的多态性检测及最适温度的确定, PCR反应产
物利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)于北
京六一仪器厂生产的DYY-II型垂直板电泳仪中电
泳分离。电泳缓冲液为1×TBE, 电压180 V, 电流
180 mA, 电泳时间为2~3 h, EB染色, 用Biorad凝胶
成像系统检测电泳结果。选取PCR扩增效果最好
的25对引物进行杜鹃花的SSR多态性分析, 反应条
件及反应程序同引物筛选部分, 不同引物组合的
最适退火温度见表2。根据电泳结果, 统计SSR位
点信息, 在相同迁移位置有带的记为1, 无带的记
为0, 建立0、1矩阵, 利用Popgen32软件处理结果,
获得评价多态性位点的遗传学参数: 等位基因数
(Na)、期望杂合度(He)、观测杂合度(Ho)、多态
信息含量(PIC)、哈迪-温伯格平衡(Hardy-Wein-
berg Equilibrium, HWE)及遗传距离(genetic dis-
tance, GD)并利用遗传距离进行聚类分析, 构建24
份种质资源的聚类进化树。
实验结果
1 SSR位点分布、频率和特点
利用SSRIT共筛选出435个SSR位点, 占总EST
序列17.1%。由图1可知, 重复基元数较高的为二
核苷酸和三核苷酸, 单核苷酸相对较低, 四核苷酸,
五核苷酸和六核苷酸只占极少数, 表明杜鹃花中
SSR重复基元分布不平衡, 主要分布在二核苷酸和
三核苷酸。
2 杜鹃花SSR位点的筛选
为检测所开发EST-SSR标记的可用性, 选择
SSR位点重复性较高的引物30对进行合成, 包括二
核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复基元的SSR位
点的引物并以‘紫鹤’、 ‘琉球红’、‘恰恰’、‘美人
笑’、‘映山红’和‘云锦杜鹃’ 6个杜鹃花品种的混合
DNA池为模板进行梯度PCR扩增, 筛选出可扩增
引物25对, 有效扩增率为83.3%; 对24个杜鹃花品
种进行多态性分析, 共筛选出多态引物14对, 多态
率为46.7%。表明利用杜鹃花EST序列开发EST-
SSR标记是可行的。
3 EST-SSR引物评价
由表2可知, 14个SSR多态性位点在杜鹃花24
个个体中共获得47个等位基因, 多态位点的等位
基因数为2~5个, 平均等位基因数为3.36个, 其中
R01、R07二个位点的等位基因数为5个。观望杂
合度、期望杂合度分别为0.000~0.8333、0.0816~
0.7172。PIC值是衡量群体变异程度的重要参数,
24个多态位点的PIC值介于0.0767~0.6471, 平均值
为0.4208, 其中有5个高度多态位点(PIC>0.5)、7个
中度多态位点(0.25
态性扩增情况。
4 14个SSR位点对杜鹃花群体的多态性评价
图3的UPGMA聚类分析结果表明: 24份杜鹃
李美芹等: 杜鹃花EST-SSR标记的开发及遗传多样性分析 359
表2 杜鹃花14个EST-SSRs标记的特征
Table 2 Characteristics of 14 EST-SSRs for azalea
位点 引物序列(5→3)
重复模式 产物长度/bp
退火温 等位基因 观望杂合 期望杂合 多态信息
P值 度/°C 数(Na) 度(Ho) 度(He) 含量(PIC)
R01 AAAGGCTGTAGCAACAACTG (cct) 4 180~300 54.5 5 0.3750 0.5027 0.4585 0.0000
GTTTCAGGGTGTCTTTAGGG
R02 ACGGGACGAGAATCTACCAC (ctcggc)3 160~250 56.3 2 0.8333 0.4965 0.3680 0.0007
CTATCACCCCAAGTCCAACA
R03 GGAAAACATTGAGGAAGAAC (agacaa)3 160~220 52.5 2 0.1667 0.1560 0.1411 0.7025
GGTCATCTTCATCCATCAAA
R04 CACCCTTTACTACAACCTGG (acctca)3 160~250 58.7 3 0.4167 0.3449 0.2930 0.6887
TTGAACCTAACCCGAAGATA
R05 TTGAATCGGTTAGAGAAGGC (tct) 5 180~300 56.7 4 0.5000 0.7066 0.6326 0.2227
AGAAGGAATGTCCATCAGCA
R06 ACGAGGAGAGGAGGCAAAAC (ag) 9 126~200 59.3 4 0.5000 0.7172 0.6471 0.0188
TGATGGAGCCGACCTAAATG
R07 TCTACTTTTCCCAACGCTCC (cca)10 180~240 58.5 5 0.2500 0.3041 0.2869 0.0000
ACCCCCTTTCAATAGTCACC
R08 ACTTTTCCCAACGCTCCTCT (cca)10 180~300 59.7 4 0.4583 0.6702 0.5887 0.0197
CAAACCCTTAGCCAGTCCCA
R09 CGTCAAGAAACCTCCAGAAG (tactag) 3 160~250 57.5 2 0.0000 0.0816 0.0767 0.0000
GTATTACAAAGCGAGCCCAT
R10 ATAGCAGCAGTAGCAACCGC (agg)5 140~220 60.3 4 0.2917 0.5523 0.4498 0.0820
CGTTCTGAGCAGTGAGTTCG
R11 ATTAGGATAACACAGGCAAG (tg)7 225~325 54.9 2 0.7083 0.4672 0.3528 0.0095
ACAACAAACGATAGAAGACG
R12 GCTGAGAATGCTACGGAGAC (at)11 160~250 58.1 3 0.0000 0.5922 0.5020 0.0000
AGTGCTACCGACACAGAATA
R13 TATTGTAAACCAGGAGGGCA (ag)31 160~250 58.9 3 0.2917 0.5257 0.4563 0.0055
GTCCCCTTCTGGTGATGTCT
R14 CCCCAATCACTTGCCACTTT (ct)17 200~300 58.7 4 0.6250 0.7083 0.6375 0.3340
TTTGGAGGAAGCGGCTAAGA
平均值 — — — — 3.3571 0.3869 0.4875 0.4208 —
花种质资源聚成9类, 如羊踯躅亚属的‘闹羊花’和
‘十二乙重’、‘天女舞’聚成一类; 马银花亚属的‘马
银花’和‘刺毛杜鹃’聚成一类; 常绿杜鹃亚属的‘云
锦杜鹃’和‘华顶杜鹃’、‘溪畔杜鹃’聚成一类; 映山
红亚属的‘映山红’和‘满山红’聚成一类; ‘琉球红’、
‘小叶毛鹃’、‘粉鹤’、‘紫鹤’和‘白鹤’聚成一类。
‘溪畔杜鹃’和‘夏红’同属映山红亚属, 但未聚成一
类, 可能与杜鹃花种质资源混乱的杂交有关。
讨 论
目前, 鉴于EST-SSR开发的简便高效性, 越来
越多的研究者倾向于利用EST-SSR开发EST-SSR引
物。忻雅等(2006)利用15对EST-SSR引物28个白菜
品种进行PCR扩增, 发现7对引物显示多态性, 占引
物总数的46.7%; 上官凌飞等(2011)对杏的EST-SSR
标记进行开发, 设计的50对引物40对可扩增出理想
条带, 25对可扩增出多态性, 有效扩增率为80%, 多
态性占62.5%; 本研究设计了30对EST-SSR引物, 其
图1 EST-SSR位点核酸分布特征
Fig.1 EST-SSR loci nucleic acid distribution characteristics
植物生理学报360
中25对引物可扩增出条带, 有效扩增率为83.3%, 多
态性占46.7%。说明以EST序列开发的SSR引物扩
增效率较高, 能有效反应种质资源的遗传多样性,
为探究生物遗传多样性提供了丰富的资源。
在杜鹃花EST序列中搜索到435个SSR位点,
占EST序列的17.1%, 该比率高于廖娇等(2011)猕
猴桃的14.1%, 上官凌飞等(2010)梅的9.2%, 但低于
Jiang等(2006)柑橘的21.6%。不同物种间的SSR位
点的差异多是由于物种间SSR信息差异或物种在
GenBank中可用来分析的EST数量不同、搜索SSR
位点的软件算法不同及设定参数的不同等原因造
成的。随着EST数据库的容量不断增大, EST-SSR
图2 R01~R14位点在24杜鹃花种间的多态性
Fig.2 Polymorphisms showed 24 azalea cultivars with locus R01–R14
R01~R14为14个位点的扩增图。1: ‘紫鹤’; 2: ‘闹羊花’; 3: ‘粉鹤’; 4: ‘琉球红’; 5: ‘白鹤’; 6: ‘天女舞’; 7: ‘恰恰’; 8: ‘粉红泡泡’; 9: ‘小叶
毛鹃’; 10: ‘秋水波’; 11: ‘华顶杜鹃’; 12: ‘肯特’; 13: ‘十二乙重’; 14: ‘红苹果’; 15: ‘绿色光辉’; 16: ‘溪畔杜鹃’; 17: ‘映山红’; 18: ‘满山红’; 19:
‘牡丹红’; 20: ‘夏红’; 21: ‘刺毛杜鹃’; 22: ‘马银花’; 23: ‘美人笑’; 24: ‘云锦杜鹃’; M: 20 bp DNA Ladder Marker。
李美芹等: 杜鹃花EST-SSR标记的开发及遗传多样性分析 361
标记的开发将进入新的阶段, 设定物种间的SSR位
点的标准, 将给SSR标记的开发带来很大便利, 但
设定标准后, 相对减少了SSR位点开发的丰富性。
目前, 大多数植物EST序列的SSR位点重复基元多
为二、三碱基重复, 陈琛等(2010)在甘蓝的EST-
SSR中, 二核苷酸和三核苷酸占优势重复基元类
型。蒋超等(2012)研究金银花的EST-SSR发现SSR
重复多为二核苷酸和三核苷酸, 与本试验的研究
一致。在EST-SSR开发过程中, 二至四个核苷酸重
复基元的开发, 成功率相对较高。
黄茂如和强鸿良(1984)根据表型和来源, 将杜
鹃花品种分成4类, 主要有东鹃、西鹃、春鹃和夏
鹃。目前, 我国普遍认可的杜鹃花分类方式, 主要
是东鹃、西鹃、春鹃、夏鹃和高山杜鹃。这种分
类多依据开花时间和引种地等外在表观信息进行
分类, 难以达到规范化、合理化的分类目的; 并且
杜鹃花属植物杂交品种数量繁多, 种间形态各异;
品种名称与地方俗名的混用以及国外引进品种音
译的不规范等各种问题, 均使得传统的分类方法
已无法对杜鹃花属植物亲缘关系做出更为准确分
析。而EST-SSR分子标记的开发则为该方面的研
究提供了一种新的手段。本研究UPGMA聚类结
果分析表明: ‘云锦杜鹃’和‘华顶杜鹃’聚成一类, 表
明‘华顶杜鹃’可能是‘云锦杜鹃’的地理变种; 马银
花亚属的‘马银花’和‘刺毛杜鹃’聚成一类; 映山红
亚属的‘映山红’和‘满山红’聚成一类, 分类结果表
图3 24个杜鹃花品种聚类分析树状图
Fig.3 Dendrogram of 24 azalea varieties clustering analysis
植物生理学报362
明SSR分子标记技术能从分子水平给杜鹃花分类
提供更为科学的依据, 对研究杜鹃花系统位置和
亲缘关系时具有很大的应用价值。对未知分属杜
鹃花聚类分析可知‘十二乙重’和‘天女舞’可能是以
‘闹羊花’或羊踯躅亚属的其他种质作为亲本杂交
而成的; ‘牡丹红’和‘夏红’聚成一类, 可以推测‘牡
丹红’与映山红亚属植株有一定的关系; ‘绿色光
辉’、‘红苹果’、‘恰恰’、‘粉红泡泡’、‘美人笑’和
‘肯特’这些杂交西鹃与原种‘云锦杜鹃’亲缘关系较
近, 可推测其杂交亲本可能是‘云锦杜鹃’, 系统分
类可以划分到常绿杜鹃亚属。
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植物生理学报364
Development of EST-SSR primers for azalea and genetic analysis of cultivars
LI Mei-Qin1,2, PAN Ye-Yu2, QIAN Ping-Xian2, LU Dan2, MING Meng1,2, RAO Hui-Yun2, LIU Rong2, XIE Xiao-Hong2, WU Yue-
Yan2,*
1College of Fisheries and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2College of Biology and Environment, Zhe-
jiang Wanli University, Ningbo, Zhejiang 315100, China
Abstract: A total of 2 535 azalea ESTs downloaded from the NCBI database were analyzed, from which 435
ESTs were obtained. Thirty pairs of primers were designed by the software Primer5.0 Plus. Genomic DNA
pooling technology was used to quickly screen SSR primers, 25 pairs of EST-SSR primers could amplify frag-
ments. The PCR products of 25 pairs of EST-SSR primers were detected by PAGE. It was revealed from the
investigation of polymorphism that 14 SSR locus were polymorphic, the number of alleles of the 14 EST-SSR
locus varied from 2 to 5, and the mean value is about 3.8. The range of the observed heterozygosity, the expected
heterozygosity and the high polymorphism information content (PIC) values was 0 to 0.8333, 0.0816 to 0.7172,
0.0767 to 0.6471, respectively. There are 5 high polymorphic SSR locus, 7 moderate polymorphic SSR locus,
and 2 low polymorphism SSR locus. Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Means (UPGMA) cluster
analysis showed that the 14 EST-SSR markers are capable of differentiate the varieties and will be of great im-
portance in azalea genetic analysis.
Key words: azalea; EST-SSR; PAGE; genetic diversity
Received 2015-12-28 Accepted 2016-02-25
This work was supported by Ningbo Science and Technology Major Project (Grant No. 2014C11002) and Top Key Discipline “Bioengineering”
Open Fund of Zhejiang Province (Grant No. KF2015008).
*Corresponding author (E-mail: wyynb2009@163.com).