全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (12): 1201~1206 1201
收稿 2011-09-09　　修定 2011-11-07
资助 南京林业大学优秀博士学位论文创新基金项目和国家
“十一五”科技支撑项目(2006BAD19B02)。
* 通讯作者(E-mail: ylding@vip.163.com; Tel: 025-85428004)。
毛竹中NYE基因的分离及功能分析
陈云霞1,3, 魏强1, 蒯本科2, 丁雨龙1,*
1南京林业大学竹类研究所, 南京210037; 2复旦大学生命科学学院, 上海200433; 3南京森林警察学院鉴定中心, 南京210046
摘要: AtNYE1是拟南芥叶片衰老过程中叶绿素降解的重要调控基因, 本文用AtNYE1为诱饵基因, 通过NCBI tblastn在毛竹
的cDNA文库中找到3个与其相似性较高的cDNA全长序列, 分别命名为PeNYE1、PeNYE2和PeNYE3。为了验证其是否具
有AtNYE1相似的功能, 分别将它们的编码区构建到带有花椰菜花叶病毒35S强启动子的植物表达载体上, 并通过冻融法将
这3个表达载体导入GV3101农杆菌。通过农杆菌介导法, 将这3个基因分别在烟草叶片中瞬时表达及在拟南芥植株中稳定
表达, 结果显示, 瞬时过表达和组成型过表达PeNYE1均导致了叶片的黄化, 而瞬时或组成型过表达PeNYE2或PeNYE3均未
观察到黄化表型。这些结果表明PeNYE1是毛竹中叶绿素降解的重要调控基因。
关键词: 叶片衰老; 叶绿素降解; 毛竹; 滞绿; NYE
Isolation and Function Analysis of NYE Genes in Moso [Phyllostachys edulis
(Carr.) Lehaie]
CHEN Yun-Xia1,3, WEI Qiang1, KUAI Ben-Ke2, DING Yu-Long1,*
1Bamboo Research Institute, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2School of Life Sciences, Fudan University,
Shanghai 200433, China; 3Identification Center, Nanjing Forest Police College, Nanjing 210046, China
Abstract: AtNYE1 is an important chlorophyll degradation regulatory gene during leaf senescence of Arabidop-
sis thaliana. With AtNYE1 as a bait gene, three sequences which have high similarity with AtNYE1 were found
in the moso (Phyllostachys edulis) EST database through NCBI tblastn, and were named PeNYE1, PeNYE2 and
PeNYE3 respectively. To verify whether those genes have the similar function of AtNYE1, the coding regions of
PeNYE1, PeNYE2 and PeNYE3 were constructed to the plant expression vector with CaMV 35S promoter. And
the resulting constructs were introduced into Agrobacterium tumefaciens GV3101 through the freeze-thaw
method. By Agrobacterium-mediated method, the three genes were transiently expressed in tobacco leaves and
constitutively expressed in Arabidopsis plants, respectively. The results showed that both transient-expression
and constitutive-expression of PeNYE1 could result in the leaf yellowing phenotype. But transient- or constitu-
tive-overexpression of PeNYE2 or PeNYE3 couldn’t induce the leaf de-greening phenotype. The results collec-
tively indicate that PeNYE1 is an important regulator gene of chlorophyll degradation in moso.
Key words: leaf senescence; chlorophyll degradation; moso; stay green; NYE
叶绿素降解是植物绿色器官衰老的一个显著
特征, 通过近20年的研究, 植物叶绿素降解代谢途
径已经基本明了, 但长期以来对于衰老进程中叶
绿素降解的分子调控机制知之甚少。Ren等(2007)
通过筛选滞绿(stay-green)突变体, 鉴定到一个与叶
绿素降解代谢途径相关的关键调控基因NYE1
(Non-yellowing)。AtNYE1的过表达能引起拟南芥
叶片黄化, 甚至出现白化苗。其无义突变体nye1-1
在叶片衰老进程中叶绿素及光合作用相关蛋白的
降解受到显著抑制。AtNYE1在植物中高度保守,
在其他植物物种中相继鉴定出AtNYE1的同源基
因, 且这些基因的变异也能够导致植株的滞绿表
型(Barry等2008; Jiang等2007; Park等2007; Arm-
stead等2006)。这些基因统称为衰老诱导的叶绿体
滞绿相关蛋白(senescence-inducible chloroplast
stay-green protein, SGR)基因(Hörtensteiner 2009)。
在水稻上的研究发现, NYE1很可能是参与捕光色
素蛋白复合物II (light-harvesting chlorophyll-pro-
tein complex II, LHCII)解构的蛋白因子(Park等
植物生理学报1202
2007), 但其具体的作用途径目前还一无所知。
竹类植物是禾本科(Ggramineae)竹亚科(Bam-
busoideae)植物的总称。竹子生长快、成材早、产
量高、用途广, 如今在建筑、造纸、装饰材料、
食品保健、园林绿化和生态防护等领域, 均以其
独有的特点表现出巨大的优势和潜力(Chen等
2011)。竹林集经济效益、生态效益和社会效益于
一身, 已经成为我国最重要的森林类型之一。竹
子属于常绿植物, 但在生长过程中不断有衰老的
叶片脱落, 新的叶片产生。有些竹子在一年中叶
片有长达6个月的半衰老状态, 严重影响其光合作
用。毛竹是我国分布面积最广、经济价值最大的
一个竹种。近年来, 毛竹已成为竹类植物中的模
式竹种被大家广泛研究, 但毛竹秆型高大, 基因组
数量庞大, 变异不稳定, 尚未有成熟的组培体系及
经典分子生物学手段的局限性等客观原因限制了
过去乃至将来一段时间人们对毛竹生长发育等分
子机制的深入研究。
本文利用目前已有的毛竹cDNA序列(Peng等
2010), 克隆了3个与拟南芥NYE1相似性较高的
cDNA全长序列, 借助烟草和拟南芥植物系统, 分
析了这3个基因的功能, 并初步明确了PeNYE1在毛
竹叶绿素降解过程中的功能, 为今后观赏类竹类
植物绿期及色泽的改良提供了候选基因。
材料与方法
1 材料
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚
生态型(Col-0)和烟草(Nicotiana tabacum L. cv.
K326)均由复旦大学蒯本科教授实验室提供。毛
竹[Phyllostachys edulis (Carr.) Lehaie]种子为南京
林业大学竹类研究所保存。实生苗植株生长于装
有黑土、蛭石、珍珠岩(体积比为3:9:0.5)的盆钵
中, 置于长日照光周期(16 h光照/8 h黑暗), 光照强
度为130 μmol·m-2·s-1, 温度为(22±2) ℃的人工培养
室内培养。
植物表达载体pCHF3、大肠杆菌(Escherichia
coli)菌株Top10和农杆菌(Agrobacterium tumefa-
ciens)菌株GV3101均由复旦大学蒯本科教授实验
室保存。克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司, PCR
引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成, DNA
序列测定由上海杰李生物技术有限公司完成。
2 方法
2.1 植物叶片DNA和总RNA的抽提
采用十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法抽提
DNA; 使用Invitrogen公司的Trizol试剂抽提总
RNA。
2.2 cDNA第一链的合成及实时荧光定量PCR (real-
time PCR)
使用Fermentas公司的RevertAid™ First Strand
cDNA Synthesis试剂盒合成cDNA第一链; 荧光定
量PCR使用TaKaRa公司的SYBR® Premix Ex Taq™
(Perfec t Real Time)试剂盒。相关引物如下 :
ACT2-F, 5-CGCTCTTTCTTTCCAAGCTC-3;
ACT2-R, 5-AACAGCCCTGGGAGCATC-3; Pe-
ACT-F, 5-GGTGTGAGCCATACTGTGCCCAT-3;
PeACT-R, 5-TTTCCCGTTCAGCAGAGGTT-
GTG-3; PeNYE1RT-F, 5-GCCTCCGCTACTA-
CATCTTTCGC-3; PeNYE1RT-R, 5-GAAGCG-
G G G G A G G T T G G A G T - 3 ; P e N Y E 2 R T - F ,
5-CGGGCTCGGTGGTCGTGTT-3; PeNYE2RT-R,
5-CTTCTCCTCGTCCACCCCCAG-3; PeNY-
E3RT-F, 5-GACCTACCGTATTCCTCCCTGGC-3;
PeNYE3RT-R, 5-GCGGTGAAGTCGCAGTG-
GGT-3。
2.3 毛竹NYEs基因cDNA及其基因组序列的克隆
利用拟南芥中AtNYE1为诱饵, 通过NCBI的
tblastn程序检索毛竹中与AtNYE1同源性较高的基
因, 根据找到的3个相似较高的cDNA序列, 分别设
计3对包含酶切位点的特异引物(带下划线序列为
酶切位点)如下: PeNYE1-F, 5-GGGTACCATGGC-
GACTGCTACCAC-3 (Kpn Ι ) ; PeNYE1-R ,
5-GCTCTAGAACGAACCATGTAGCGGC-3
(XbaΙ); PeNYE2-F, 5-GGGTACCATGGCTACTGC-
CACCAT-3 (KpnΙ); PeNYE2-R, 5-TGCTCTAGA-
CACATTCTATTTAGTCAGTCCC-3 (XbaΙ); Pe-
NYE3-F, 5-GGGTACCTGCCAGAGTTCATC-
AATG-3 (KpnΙ); PeNYE3-R, 5-TGCTCTAGA-
CTTATGGGCCTAGGTACGTA-3 (XbaΙ)。以毛竹
衰老叶cDNA为模板, 扩增其完整编码区序列; 以
毛竹叶DNA为模板, 扩增其基因组序列。
PCR反应体系为: 5 μL 10 Plus缓冲液、5 μL 2
陈云霞等: 毛竹中NYE基因的分离及功能分析 1203
mmol·L-1 dNTPs、2 μL 25 mmol·L-1 MgSO4、1 μL
PeNYEs-F、1 μL PeNYEs-R、1 μL cDNA/DNA、
1 μL KOD Plus、34 μL MiliQ H2O。PCR反应程序
为: 首先94 ℃预变性5 min; 然后94 ℃变性30 s, 60 ℃
退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 38个循环; 最后72 ℃延
伸10 min。
2.4 生物信息学分析
序列相似性用NCBI的BLAST程序(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行分析; 多序列
比对应用GeneDoc软件; 系统进化树用MEGA软件
进行构建, 采用NJ法, 重复1 000次; 基因结构分析
在http://gsds.cbi.pku.edu.cn/网站完成。
2.5 表达载体构建
利用引物PeNYE1~3-F与PeNYE1~3-R扩增出
PeNYE1、PeNYE2及PeNYE3的完整编码区, 测序
无误之后, 用限制性内切酶KpnΙ与XbaΙ进行双酶
切, 回收、纯化目的片段, 连接至用同样两个内切酶
酶切并纯化的pCHF3载体上, 转化农杆菌GV3101。
2.6 烟草叶片瞬时表达
选择生长了3~4周烟草完全展开的嫩叶作为
侵染材料, 先在烟草叶片下表皮的两条侧脉之间
用注射器针头轻轻扎一个小孔, 用1 mL不带针头
的注射器吸取含有目的基因AtNYE1、PeNYEs及
pCHF3空载体的农杆菌GV3101重悬菌液, 从烟草
下表皮经小孔将菌液缓缓注射进叶肉中, 烟草注
射菌液后继续在正常条件下生长, 2~3 d后开始观
察叶片黄化表型。
2.7 转基因拟南芥的获得
将长势良好的拟南芥材料经2~3次打顶, 增加
其花蕾数量, 采用花蕾侵染法转化。收集转化后
的拟南芥种子, 用75%的酒精灭菌, 铺于含有50
mg·L-1卡那霉素的MS培养基上, 经抗性筛选获得
转基因的拟南芥植株, 再抽提DNA, 用PCR鉴定。
实验结果
1 PeNYEs基因cDNA全长及其基因组序列的获得
利用NCBI的tblastn程序, 在毛竹中检索得到3
个(FP099970、FP100808、FP094177)与AtNYE1相
似性分别为62%、76%、53%的cDNA序列, 分别
命名为PeNYE1、PeNYE2、PeNYE3。PeNYE1基
因cDNA全长1 481 bp, 包含816 bp的开放阅读框,
编码271个氨基酸残基; PeNYE2基因cDNA全长975
bp, 包含564 bp的开放阅读框, 编码187个氨基酸残
基; PeNYE3基因cDNA全长986 bp, 包含729 bp的
开放阅读框, 编码242个氨基酸残基。利用特异引
物PeNYE1~3-F/R, 扩增获得其基因组序列, 基因结
构分析显示其基因结构差异较大(图1)。PeNYE1
含有3个外显子和2个内含子, PeNYE2含有2个外显
子和1个内含子, 而PeNYE3则含有4个外显子和3个
内含子。
2 PeNYEs的生物信息学分析
2.1 PeNYEs的多重序列比对
为了验证PeNYEs与其他物种来源的NYE的
同源性, 使用GeneDoc软件分析它们蛋白的相似
性。结果表明, PeNYE1与其他5个物种来源的NYE
相似性最高; PeNYE2虽然相似性也很高, 但是只
覆盖了其他物种的前2/3氨基酸序列; 而PeNYE3相
对PeNYE1与PeNYE2, 相似性则较低(图2)。
2.2 PeNYEs的进化树分析
为了进一步探讨PeNYEs与不同物种中SGR/
NYE的同源性 , 构建了PeNYEs与其他9个物种
SGR/NYE蛋白的进化树, 结果表明PeNYE1和Pe-
NYE2与水稻的SGR蛋白在进化关系上最近, 而Pe-
NYE3则不属于SGR/NYE蛋白类群(图3)。
3 PeNYEs在毛竹中的表达模式分析
取自然生长状态下未衰(新叶完全展开后生
图1 PeNYEs的基因结构
Fig.1 The gene structure of PeNYEs
黑色条块: 外显子(exon); 黑色线条: 内含子(intron)。
植物生理学报1204
长1周无黄化的叶片)、初衰(新叶完全展开后生
长2个月左右1/3面积黄化的叶片)和衰老(新叶完
全展开后生长5个月左右完全黄化的叶片)的毛竹
叶片(图4-A)。以毛竹中的ACTIN作为内参, Pe-
SAG12 (毛竹中拟南芥衰老相关基因SAG12的同
源基因)作为衰老标记基因(图4-C), 实时荧光定
量PCR分析PeNYE1、PeNYE2及PeNYE3在不同
衰老阶段毛竹叶片中的表达水平, 结果显示, Pe-
NYE1和PeNYE2的表达量均随着叶片衰老程度的
增加而显著上调, 衰老叶片中这2个基因的表达量
可达未衰叶片中的30多倍, 而PeNYE3在这3种不
同衰老阶段叶片中的表达量没有显著变化 (图
4-B)。
4 PeNYEs在烟草中的瞬时表达
为了验证PeNYEs的功能, 通过农杆菌介导法
将PeNYE1、PeNYE2和PeNYE3分别在烟草叶片中
瞬时超量表达。通过直接观察注射农杆菌液体的
烟草叶片发现, 注射含AtNYE1及PeNYE1基因菌液
的烟草叶片2~3 d后能观察到黄化的出现, 而注射
含PeNYE2和PeNYE3基因菌液的烟草叶片均未观
察到叶片黄化现象(图5)。
图2 PeNYEs与其他物种来源的NYE的多重序列比对
Fig.2 Multi-alignment of PeNYEs with NYE from other plants
黑色表示完全一致的氨基酸序列; 灰色表示50%以上一致的氨基酸序列; 序列下方是一致性的氨基酸; 序列上方的数字代表包括
空格在内的氨基酸数目; 序列右侧的数字代表实际的氨基酸数目。AtNYE1 (DQ437531)和AtNYE2 (NM_117261.5): 拟南芥(Arabidopsis
thaliana); HvSGR (AY850135.1): 大麦(Hordeum vulgare); OsSGR (AY850134.1): 水稻(Oryza sativa); SbSGR (AY850140.1): 高粱(Sorghum
bicolor); ZmSGR1 (AY850138.1)和ZmSGR2 (AY850139.1): 玉米(Zea mays)。
图3 PeNYEs与不同物种来源SGR/NYE的进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of PeNYEs with other
SGR/NYE from different plants
AtNYE1 (DQ437531)和AtNYE2 (NM_117261.5): 拟南芥(Ara-
bidopsis thaliana); GmSGR1 (AY850141)和GmSGR2 (AY850142):
大豆(Glycine max); PsSGR (AB303332): 豌豆(Pisum sativum); Os-
SGR (AY850134.1): 水稻(Oryza sativa); ZmSGR1 (AY850138.1)和
ZmSGR2 (AY850139.1): 玉米(Zea mays); ZjSGR1 (AY850154.1):
结缕草(Zoysia japonica); SbSGR (AY850140.1): 高粱(Sorghum
bicolor); HvSGR (AY850135.1): 大麦(Hordeum vulgare); LeSGR1/
SlSGR1 (AY850152): 番茄(Lycopersicon esculentum)/辣椒(Solanum
lycopersicum)。
陈云霞等: 毛竹中NYE基因的分离及功能分析 1205
5 PeNYEs在拟南芥中的组成型超量表达
为了进一步验证PeNYEs的功能, 将构建好的
PeNYEs的过表达载体转化拟南芥野生型Col-0, 在
拟南芥中稳定表达。自然生长到第20天, 观察T2代
转基因植株与野生型植株的表型发现, 部分Pe-
NYE1的过表达株系呈现黄化的表型(图6-A), 而Pe-
NYE2和PeNYE3的转基因植株均不出现叶片黄化
表型(资料未列出)。实时荧光定量PCR检测各株
系中PeNYE1的表达水平, 结果显示其表达量与转
基因植株的黄化程度呈正相关(图6-B), 与叶绿素
含量呈负相关(图6-C)。
讨　　论
研究表明, 叶绿素的降解不仅影响一些园艺
植物的观赏性, 还会影响到绿叶蔬菜的货架期及
农作物的产量(Lim等2003; Reyes-Arribas等2001)。
AtNYE类基因是调控植物叶绿素降解的关键基因
(Ren等2007), 基于毛竹测序工作的完成, 我们利用
生物信息学及分子生物学的方法, 初步阐明了毛
竹中与AtNYE序列相似的3个同源基因在调控毛竹
叶绿素降解过程中的作用。
在毛竹现有的测序数据库中, 检索到3个与At-
NYE1相似性较高的序列。但通过生物信息学和分
子生物学的分析发现, 在进化树中, PeNYE3不属
于NYE/SGR蛋白这一类群, 表达量不随叶片衰老
程度的增加而增加, 并且瞬时过表达和组成型过
表达均不能引起叶片黄化。以上分析结果表明,
PeNYE3应不参与植物叶片衰老过程中叶绿素降解
过程。
图4 3种不同衰老阶段叶片中PeNYEs的表达水平
Fig.4 The transcript level of PeNYEs in moso leaves at three
different senescence stages
A: 自然生长条件下不同衰老阶段的毛竹叶片; B: PeNYE1、
PeNYE2、PeNYE3在A图叶片中的相对表达量; C: PeSAG12在A图
叶片中的相对表达量。
图5 PeNYEs在烟草叶片中的瞬时超量表达
Fig.5 Transient-overexpression of PeNYEs in tobacco leaves
AtNYE1: 阳性对照; pCHF3: 空载体阴性对照。箭头所示为农杆菌注射区域。
植物生理学报1206
PeNYE2与其他NYE/SGR蛋白相似性较高,
且响应植物衰老信号, 但是PeNYE2只编码187个氨
基酸残基, 与其他NYE/SGR蛋白相比少了将近1/3
的氨基酸序列, 且在植物中的功能分析发现, 瞬时
和组成型过表达PeNYE2也都不能引起叶片的黄
化。这些结果表明, PeNYE2参与响应植物衰老信
号, 但不具备NYE/SGR的功能, 同时也暗示NYE/
SGR蛋白的后1/3氨基酸序列可能就是NYE蛋白行
使功能的必需区域。
与PeNYE2和PeNYE3相比, PeNYE1与AtNYE1
的相似性最高, 并响应叶片衰老信号, 而且不论是
在烟草中的瞬时表达还是在拟南芥中的稳定超量
表达, 都能引起叶片的黄化。这些结果表明Pe-
NYE1应参与了毛竹叶片中叶绿素的降解过程, 具
有与AtNYE1类似的功能, 是毛竹叶片衰老过程中
叶绿素降解的重要调控基因。
参考文献
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图6 PeNYE1在拟南芥中的超量表达能导致叶片黄化
Fig.6 The constitutive overexpression of PeNYE1 could result in leaf yellowing in Arabidopsis
A: 野生型植株与随机挑选的6个转基因T2代株系(OE-1、OE-3、OE-9、OE-10、OE-17、OE-21)自然生长第20天时的表型; B: A图中
各植株体内PeNYE1的相对表达量; C: A图中各对应植株全部莲座叶的总叶绿素含量。
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