全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (11): 1692~1698　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.03911692
收稿 2014-09-01　　修定 2014-09-29
资助 国家自然科学基金(31170368)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail : ywang@nefu.edu.cn; Tel: 0451-
82190052)。
盐芥miR396的表达分析、前体克隆及靶基因预测
宫晓琳*, 熊雪梅*, 吴莹, 王洋**
东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心, 东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室, 哈尔滨150040
摘要: 利用实时定量PCR的方法分析了tsa-miR396在盐芥不同组织的表达情况及盐、冷胁迫下的表达量变化, 结果显示tsa-
miR396在盐芥的不同组织均有表达, 且在盐芥幼苗受盐、冷胁迫处理2 h后其表达量明显上升, 随后呈波动性变化。利用
在线软件psRNATarget预测到25个tsa-miR396的靶基因并进行功能分类。成功克隆tsa-miR396前体, 并利用Mfold在线软件
分析该前体能够折叠形成茎环结构。
关键词: 盐芥; miRNA; 实时定量PCR; 靶基因; 前体
Expression Analysis, Precursor Cloning and Target Prediction of miR396 in
Thellungiella salsuginea
GONG Xiao-Lin*, XIONG Xue-Mei*, WU Ying, WANG Yang**
Key Laboratory of Saline-Alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field, Ministry of Education, Alkali Soil Natural Environ-
mental Science Center, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: In this study, we analyzed the expression levels of tsa-miR396 in different tissues and response to the
salt and cold stresses by real-time quantitative RT-PCR. The results showed that tsa-miR396 widely expressed
in different tissues of Thellungiella salsuginea and its expression level was strongly up-regulated at 2 hours of
salt or cold treatment and then changed in volatility. Using the psRNATarget online 25 target genes of tsa-
miR396 were predicted and classificated according to their functions. Moreover, the precursor of tsa-miR396
was successfully cloned and could fold into the stem-loop structure by Mfold web server.
Key words: Thellungiella salsuginea; miRNA; real-time quantitative PCR; target gene; precursor
盐芥(Thellungiella salsuginea)是十字花科
(Brassicaceae)盐芥属的一年生草本植物, 是与拟南
芥近缘的盐生植物。盐芥(山东生态型)与拟南芥
形态学相似, 具有植株矮小、生长周期较短、自
花授粉、种子数量多、遗传转化较为容易等优良
的遗传性状(Bressan等2001; Wong等2006)。盐芥
最大可耐受500 mmol·L-1 NaCl的高浓度盐胁迫, 冷
驯化后能够在–18.5 ℃的低温条件下生存, 盐芥对
高盐和低温具有极强的耐受能力使其成为研究植
物响应非生物胁迫应答机制的重要模式植物(Inan
等2004; Griffith等2007)。盐芥全基因组测序的完
成为科研人员提供了更多可靠的信息(Wu等2012;
Yang等2013)。
miRNA是一类广泛存在于真核生物中, 长度
为20~24 nt , 非蛋白质编码的内源单链小分子
RNA。miRNA可以与靶mRNA结合, 在RNA诱导
的沉默复合体RISC (RNA-induced silencing com-
plex)的作用下识别靶mRNA, 通过剪切或抑制其翻
译两种方式来调节靶mRNA的表达 , 实现对靶
mRNA的转录后调控功能 (Eu la l io等2008)。
miRNA在Lee等(1993)和Wightman等(1993)研究线
虫胚胎发育时被首次发现。随着2001年3个课题
组在线虫、果蝇及人中发现大量miRNA并鉴定与
组织发育相关, miRNA被认为是动物中广泛存在
并调控发育的保守小RNA(Lagos-Quintana等2001;
Lau等2001; Lee和Ambros 2001)。植物miRNA被
Reinhart等(2002)在拟南芥中首次发现, 与动物
miRNA相比, 植物miRNA的研究虽起步较晚, 但相
关研究报道逐年增多。已有研究表明 , 植物
miRNA能够调控植物的生长发育、激素信号、免
疫应答以及响应多种生物和非生物胁迫(Zhang等
宫晓琳等: 盐芥miR396的表达分析、前体克隆及靶基因预测 1693
2007; Pedersen和David 2008; Khraiwesh等2012)。
在拟南芥研究中发现, miR396靶向生长调节
因子(growth-regulating factor, GRF)对植物的生长
发育起到重要作用(Liu等2009); 同时, miR396对高
盐、干旱、低温、UV-B辐射等环境胁迫均有响
应, 参与环境胁迫应答(Liu等2008; Covarrubias和
Reyes 2010; Casadeval等2013)。miR396作为双子
叶植物和单子叶植物中一类保守的miRNA (Zhang
等2006), 在盐芥中尚未见其与生长发育及应答环
境胁迫的相关报道。本文利用实时定量PCR (re-
al-time quantitative PCR)技术分析tsa-miR396在盐
芥不同组织及盐胁迫、冷胁迫下的表达量变化,
预测tsa-miR396的靶基因, 克隆tsa-miR396的前体
并分析其二级结构, 为进一步研究miR396在盐芥
发育及抗性的作用机制奠定基础。
材料与方法
1 植物培养与样品处理
实验用盐芥[Thellungiella salsuginea (Pall.) O.
E. Schulz]为山东生态型。种子消毒冲洗后播种到
MS培养基上, 置于4 ℃黑暗环境春化14 d。打破休
眠后移至人工气候室培养(16 h光照/8 h黑暗的光
周期, 25 ℃白天/20 ℃夜晚, 光强150 μmol·m-2·s-1,
湿度50%~70%)。将长出2~4片子叶的盐芥幼苗移
至土和蛭石(1:1)的混合培养基中继续培养, 40 d后
移至4 ℃环境苗期春化, 28 d后移回人工气候室。
分别采集根、茎生叶、莲座叶、花, 3组重复, 样品
迅速冷冻于液氮, –80 ℃保存备用。
参照刘峰和施卫明(2006)的方法, 将盐芥在MS
培养基上生长约1周后移至水培体系, 4周后选取长
势一致的幼苗进行胁迫处理。盐处理用含300
mmol·L-1 NaCl的1/2Hoagland营养液代替原培养液
处理盐芥幼苗, 冷处理用4 ℃预冷的1/2Hoagland营
养液替代原培养液, 后迅速将盐芥幼苗移至4 ℃人
工气候培养箱中, 分别在0、2、8和24 h取整株盐芥, 3
组重复, 样品迅速冷冻于后于液氮, –80 ℃保存备用。
2 tsa-miR396的实时定量PCR鉴定
2.1 引物设计
参照Chen等(2005)和Pant等(2009)的方法, 以
盐芥U6为内参基因, 设计tsa-miR396的实时定量
PCR引物, 序列见表1。引物由北京六合华大基因
科技股份有限公司合成。
表1 tsa-miR396的实时定量PCR引物序列
Table 1 Primer sequences of tsa-miR396 for real-time quantitative PCR
基因 引物 序列(5′→3′)
tsa-miR396 Stem-loop RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAAGA
Real-time qPCR-F CGGCGGTTCCACAGCTTTC
Real-time qPCR-R CCAGTGCAGGGTCCGAGGT
U6 Real-time qPCR-F GGGGACATCCGATAAAATTGG
Real-time qPCR-R GATTTGTGCGTGTCATCCTTG

2.2 总RNA提取
样品用液氮处理并研磨成粉末, 加入1 mL
TRIzol试剂(Invitrogen), 涡旋后室温静置5 min;
4 ℃离心后保留上清液并加入0.2 mL氯仿, 摇动后
室温静置3 min; 4 ℃离心后保留上清液加入0.4
mL异丙醇, 混匀后室温静置10 min; 4 ℃离心后
用75%乙醇洗涤沉淀, 待乙醇挥发净后用20 μL灭
菌ddH2O (不含RNase)溶解, 60 ℃助溶10 min, –80
℃保存备用。用紫外分光光度计(Thermo SCIEN-
TIFIC)测定RNA浓度及A260/A280, 电泳检测RNA
质量。
2.3 实时定量PCR
使用DNAase (TaKaRa)对总RNA中的痕量基因
组DNA消化后, 反转录获得cDNA。分别向1.5 μg
已消化的RNA中加tsa-miR396茎环引物(1 μg·μL-1)
和U6的R引物(1 μg·μL-1) 1 μL, 用灭菌ddH2O (不含
RNase)补至15 μL, 70 ℃处理5 min; 冷却后依次
加入5×M-MLV缓冲液5 μL, M-MLV (200 U·L-1,
Promega) 1 μL, dNTP (各10 mmol·L-1, TaKaRa) 1.25
μL, RNase Inhibitor (40 U·μL-1, TaKaRa) 0.5 μL, 灭
菌ddH2O (不含RNase) 2.25 μL, 42 ℃孵育90 min, 85
℃处理10 min; 合成的cDNA于–20 ℃保存备用。
植物生理学报1694
tsa-miR396实时定量PCR的反应体系包括
SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus, 2×, Ta-
KaRa) 10 μL, ROX Reference Dye II (50×) 0.4 μL,
正反向引物(10 mmol·L-1)各0.8 μL, 稀释后的cDNA
模板4 μL, 灭菌ddH2O补至20 μL。扩增条件为95
℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 61 ℃ 34 s, 40个循环。每个反应
3次重复。通过7500型实时PCR仪(Applied Biosys-
tems)系统自带软件处理数据。
3 tsa-miR396靶基因的预测
利用靶基因在线预测软件psRNATarget (http://
plantgrn.noble.org/psRNATarget/)预测tsa-miR396的
靶基因(Dai和Zhao 2011)。
4 tsa-miR396前体的克隆
4.1 引物设计
根据生物信息学同源预测获得tsa-miR396的
前体序列, 为提高扩增的特异性, 在该预测序列的
两端加上UTR序列设计引物, 并分别在F和R引物5′
末端添加限制性内切酶SpeI和PmlI的酶切位点。
SpeI-tsa-miR396-F primer: 5′-CTAGACTAGTAAAG-
GAAAAGATGAAGA-3′; PmlI-tsa-miR396-R primer:
5′-CTACACGTGGAGTAGTGGGGAGTTGT-3′。
4.2 CTAB法提取盐芥基因组DNA
用液氮处理盐芥叶片并研磨成粉末, 加入500
μL CTAB提取液; 65 ℃水浴30 min后加入500 μL氯
仿:异戊醇(24:1); 离心后保留上清液并加入无水乙
醇, 混匀后–20 ℃静置30 min; 4 ℃离心后用75%乙
醇冲洗沉淀, 待乙醇挥发净后用30 μL灭菌ddH2O
溶解可得盐芥叶片基因组DNA, –20 ℃保存备用。
4.3 克隆和测序
以盐芥基因组DNA为模板进行PCR扩增, 回
收目的条带连接到pMD19-T (TaKaRa)载体上, 转
化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 菌落PCR检测后, 挑
选若干阳性转化菌株送至北京六合华大基因科技
股份有限公司进行测序。测序结果在NCBI中比
对, 利用Mfold (http://mfold.rna.albany.edu/?q=m-
fold)在线软件分析前体的二级结构。
实验结果
1 总RNA的提取与检测
采用TRIzol法成功提取盐芥总RNA, 1%琼脂
糖凝胶电泳表明28S和18S rRNA谱带清晰(图1、
2), A260/A280比值均在1.8~2.0, 能够成功用于反转
录、实时定量PCR等后续实验研究。
图1 盐芥不同组织中总RNA电泳图
Fig.1 Electrophoresis of total RNA in T. salsuginea
different tissues
1: 根; 2: 茎生叶; 3: 莲座叶; 4: 花。
图2 不同胁迫条件下盐芥总RNA的电泳图
Fig.2 Electrophoresis of total RNA in T. salsuginea under
different stress conditions
1: 0 h; 2: NaCl 2 h; 3: NaCl 8 h; 4: NaCl 24 h; 5: 4 ℃ 2 h; 6: 4
℃ 8 h; 7: 4 ℃ 24 h。
2 tsa-miR396的实时定量PCR分析
2.1 tsa-miR396引物的设计方法及效果检测
miRNA成熟体很短, 仅有20~24 nt, 与PCR引
物的长度接近, 因此无法直接扩增获得。通过设计
茎环引物(图3-A), 其3′端有7 nt同tsa-miR396的3′端
互补, 正向引物包含tsa-miR396的13个5′端核苷酸,
反向引物与茎环引物部分序列完全一致。通过电
泳检测PCR产物的大小认为扩增得到tsa-miR396
(图3-B)。扩增时采用两步法PCR, 优化反应体系等
条件使检测到的tsa-miR396的Ct值在15~30, 溶解
曲线为单峰(图3-C), 扩增效率在90%~110%, R2在
0.9~1.0 (图3-D), 因此定量结果能够真实、准确的
反映出tsa-miR396的表达量变化。
2.2 tsa-miR396在盐芥不同组织及盐、冷胁迫下
的表达差异分析
采用SYBR Green定量PCR的方法检测发现:
tsa-miR396在盐芥的4种组织中均有表达, 而且在
茎生叶中的表达量(4.5)明显高于莲座叶(1.7)、根
宫晓琳等: 盐芥miR396的表达分析、前体克隆及靶基因预测 1695
图3 茎环引物实时定量PCR策略及tsa-miR396实时定量RCR扩增结果
Fig.3 Strategy of real-time quantitative PCR by stem-loop primer and real-time quantitative RCR
amplification results of tsa-miR396
A: 采用茎环引物的实时定量PCR策略, 修改自Chen等(2005); B: tsa-miR396实时定量RCR扩增产物电泳图, M为20 bp DNA Marker, 1
为tsa-miR396扩增片段, 2为阴性对照; C: tsa-miR396的溶解曲线, (RFU)/dT表示相对荧光强度与时间的导数比; D: tsa-miR396的标准曲线。
(1.0)和花(0.7) (图4-A)。在盐胁迫和冷胁迫下, tsa-
miR396的表达量在处理2 h均显著增加, 分别为0 h
的2.5倍和1.7倍, 而处理8 h均显著下降为0 h的0.4
倍, 处理24 h时, 盐处理下的tsa-miR396恢复到与0
h相似的表达水平, 而低温处理下的tsa-miR396表
达水平为0 h的0.5倍, 依然保持较低的表达水平(图
4-B、C)。
3 tsa-miR396靶基因的预测
miRNA与靶基因序列具有高度互补性, 因此利
用靶基因在线预测软件psRNATarget对tsa-miR396潜
在的靶基因进行预测, 共获得25个tsa-miR396的靶
基因(表2)。通过分析盐芥基因的功能注释初步确
定其功能。结果表明, 多数tsa-miR396的靶基因编
码转录因子, 还有部分参与物质代谢, 编码蛋白激
酶等。miR396是保守的miRNA, 在不同物种中的
功能具有保守性, 通过靶基因功能分析认为tsa-
miR396可能参与转录调控、物质代谢及逆境胁迫
响应等多种生物学进程。
4 tsa-miR396前体的克隆
克隆到的片段与目的基因大小相符(图5), 测
序并与NCBI中的盐芥基因组序列比对, 序列相似
性100% (图6)。利用Mfold软件在线分析 tsa-
miR396前体序列的二级结构, 能够折叠形成茎环
结构(图7)。
讨　　论
目前, 检测植物miRNA表达量及其变化的方
法有多种, 如Northern blot、原位杂交、实时定量
PCR等, 其中实时定量PCR技术以其灵敏度高、特
异性强、操作简便等多重优势, 已成为科研人员
检测miRNA的首选方法(Chen等2010)。本实验通
过设计具有茎环结构的tsa-miR396反转录引物
植物生理学报1696
表2 tsa-miR396靶基因的预测结果
Table 2 Prediction results of tsa-miR396 target genes
靶基因 拟南芥中的同源基因 编码蛋白 功能分类
Thhalv10000124m AT2G22840 生长调节因子1 转录因子
Thhalv10024915m AT4G37740 生长调节因子2 转录因子
Thhalv10016778m AT2G36400 生长调节因子3 转录因子
Thhalv10010453m AT3G52910 生长调节因子4 转录因子
Thhalv10013862m AT5G53660 生长调节因子7 转录因子
Thhalv10025371m AT4G24150 生长调节因子8 转录因子
Thhalv10001460m AT2G45480 生长调节因子9 转录因子
Thhalv10002204m AT2G26320 AGAMOUS-like 33 核蛋白
Thhalv10013123m AT5G58960 功能未知的植物蛋白(DUF641) -
Thhalv10015335m AT5G03860 苹果酸合酶 催化作用
Thhalv10016075m AT5G01370 ALC-相互作用蛋白1 核蛋白
Thhalv10016401m AT2G40930 泛素特异性蛋白酶5 核蛋白
Thhalv10018007m AT1G75310 生长素样蛋白1 -
Thhalv10018008m AT1G75310 生长素样蛋白1 -
Thhalv10020474m AT3G16380 poly(A)结合蛋白6 核苷酸结合作用
Thhalv10026227m AT4G17615 钙调神经磷酸酶B样蛋白1 蛋白激酶
Thhalv10023475m AT1G60960 铁调节转运体3 -
Thhalv10001096m AT4G10200 带帽状二聚结构域的TTF型锌指蛋白 核蛋白
Thhalv10011654m AT1G55450 S-腺苷-L-甲硫氨酸-依赖型甲基转移酶超家族蛋白 物质代谢
Thhalv10011702m AT1G55450 S-腺苷-L-甲硫氨酸-依赖型甲基转移酶超家族蛋白 物质代谢
Thhalv10016048m AT4G10200 带帽状二聚结构域的TTF型锌指蛋白 核蛋白
Thhalv10024466m AT4G14200 三角状五肽重复型(PPR)超家族蛋白 核蛋白
Thhalv10021699m AT3G10020 - -
Thhalv10000352m - - -
Thhalv10002335m - - -
　　“-”表示该靶基因未匹配到编码蛋白或者无功能分类。
(Chen等2005), 采用实时定量PCR技术扩增获得的
条带分子量大小为70~80 bp, 与预计的条带大小一
致, 溶解曲线为单峰且检测到的Ct值、扩增效率和
R2均符合实验要求, 表明本方法可真实准确的反映
tsa-miR396的表达量。
本研究发现tsa-miR396在盐芥的叶、根、花
中均有表达 , 且在叶中的表达量明显高于根和
花。已有研究表明, 在植物的不同组织中均检测
到miR396的表达(Rodriguez等2010; Baucher等
2013; Casadeval等2013; Bao等2014)。Rodriguez等
图4 tsa-miR396在不同组织及盐、冷胁迫下的相对表达情况
Fig.4 The relative expression of tsa-miR396 in different tissues and salt, cold stress
A: tsa-miR396在不同组织中的相对表达量; B: 不同盐处理时间tsa-miR396的相对表达量; C: 不同冷处理时间tsa-miR396的相对表达量。
宫晓琳等: 盐芥miR396的表达分析、前体克隆及靶基因预测 1697
(2010)和Bao等(2014)在拟南芥的叶和根中检测到
miR396的表达; Baucher等(2013)在杨树的花器官
中也发现了miR396的表达。此外, 我们预测到的
miR396的靶基因中有7个GRF转录因子。Kim等
(2003)和Liu等(2009)研究发现拟南芥GRF转录因
子家族的9个成员中有6个是miR396的靶基因 ,
miR396在生长的叶片中积累, 并且通过负调控
GRF转录因子控制叶片中的细胞增殖以调控叶片
发育。这可能是我们发现盐芥叶片尤其是茎生叶
中miR396表达量较高的原因。
此外, tsa-miR396在盐胁迫和冷胁迫处理后表
图6 克隆的tsa-miR396前体与NCBI中盐芥基因组序列比对结果
Fig.6 Sequence alignment result between cloned tsa-miR396 precursor and T. salsuginea genome in NCBI
“克隆序列”表示克隆到的盐芥tsa-miR396前体的序列, “NCBI序列”表示NCBI盐芥基因组序列。
图7 tsa-miR396前体的茎环结构
Fig.7 Stem-loop structure of tsa-miR396 precursor
虚线表示tsa-miR396成熟体序列。
达量呈波动性变化, 胁迫处理2 h后均显著上调, 8
h又都显著下调, 24 h盐处理下的tsa-miR396恢复到
与0 h相似的表达水平, 而低温处理下的tsa-miR396
仍保持较低水平。结果显示tsa-miR396可以迅速
响应盐胁迫和低温胁迫, 并随处理时间变化表达
量也相应改变, 说明tsa-miR396在盐芥应对盐胁迫
和冷胁迫中具有重要作用。Zhang等(2013)对200
mmol·L-1 NaCl处理24 h的盐芥样品及其对照组进
行solexa测序, 结果显示tsa-miR396的表达量显著
下调, 与我们的实验结果一致。Liu等(2008)发现拟
南芥在高盐、低温及干旱处理下其miR396表达量
均发生显著变化, 其中miR396a在300 mmol·L-1 NaCl
处理24 h时表达量上调至最高, 尽管与我们的结果
存在差异, 但很可能是Liu等只检测了miR396家族
中一个成员所致, 也可能是盐土植物盐芥与甜土
植物拟南芥在应答盐胁迫本身存在差异的结果。
本实验分析了tsa-miR396在盐芥不同组织及
盐胁迫和低温胁迫下的表达特性, 成功克隆tsa-
miR396的前体, 并且预测了tsa-miR396的靶基因,
为揭示tsa-miR396生物学功能提供理论基础。
图5 tsa-miR396前体PCR电泳图
Fig.5 Electrophoresis of cloned tsa-miR396 precursor
1: tsa-miR396前体扩增产物; 2: 阴性对照; M: 1 000 bp DNA
Marker。
植物生理学报1698
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