全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (6): 589~596 589
收稿 2012-03-13　　修定 2012-04-27
资助 国家自然科学基金项目(30872029)、北京市自然科学
基金重点项目(6071001)、北京市自然科学基金项目
(6092007)、北京市教委重点项目(KZ201010020016)、北
京市教委平台建设项目和北京市属高校人才强教深化计
划项目(PHR20090516和PHR200906134)。
* 共同通讯作者(E-mail: huabg@yahoo.com, wyn1951@126.
com; Tel: 010-80797225)。
桃PpNST1和PpSND1转录因子基因的克隆与表达分析
胡昊1,2, 刘勇1, 刘悦萍2, 邬瑞杰2, 花宝光2,*, 王有年2,*
1北京林业大学林学院, 北京100083; 2北京农学院, 农业部都市农业(北方)重点实验室, 北京102206
摘要: 为了解NAC类转录因子与桃果实内果皮发育木质化的关系, 本文以桃内果皮为试材, 采用同源基因克隆法获得了两
个NAC类转录因子的全长编码区, 分别命名为PpNST1和PpSND1。序列分析表明2个基因编码区全长均为1 188 bp, 可编码
396个氨基酸, 其预测蛋白均包含1个NAC结构域和2个特征结构域(LP-box和WQ-box)。氨基酸序列系统进化分析显示
PpNST1和PpSND1与苹果、葡萄、毛果杨和拟南芥等参与调控次生细胞壁形成和木质化的NST/SND1类转录因子具有较
高同源性。荧光实时定量PCR分析表明, PpNST1和PpSND1的表达水平随内果皮的木质化程度加强而不断升高, 分别于盛
花期后59和52 d达到最高表达量, 且它们在内果皮中的表达水平远高于中果皮。对PpNST1和PpSND1下游可能的作用靶标
进行进一步的表达分析表明, PpNST1和PpSND1可能在内果皮发育木质化过程中扮演重要角色。
关键词: 桃; 内果皮; 发育木质化; NAC转录因子
Cloning and Expression Analysis of PpNST1 and PpSND1 Genes from Prunus
persica L.
HU Hao1,2, LIU Yong1, LIU Yue-Ping2, WU Rui-Jie2, HUA Bao-Guang2,*, WANG You-Nian2,*
1College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2Key Laboratory of Urban Agriculture (North), Ministry
of Agriculture, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China
Abstract: In order to investigate the relationship between NAC domain transcription factors and developmental
lignification of peach endocarp, two NAC domain transcription factor genes PpNST1 and PpSND1 were isolat-
ed from peach (Prunus persica L. ‘Okubo’) endocarp by homologous cloning. Sequence analysis indicated that
both PpNST1 and PpSND1 were 1 188 bp, encoding 396 amino acids. The predicted proteins of them contained
one NAC domain in N terminus and two featured domains (LP-box and WQ-box) in C terminus. Phylogenetic
analysis results revealed that PpNST1 and PpSND1 were closely related to secondary cell wall formation- and
lignification-related NAC domain transcription factors in Malus domestica, Vitis vinifera, Populus trichocarpa
and Arabidopsis thaliana. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression patterns of PpNST1
and PpSND1 were dramatically up-regulated during the lignification of peach endocarp, and their transcript ex-
pression levels were more abundant in endocarp than in mesocarp. Moreover, the expression analysis of the pu-
tative downstream targets of PpNST1 and PpSND1 suggested that they might play important role in endocarp
developmental lignification.
Key words: Prunus persica; endocarp; developmental lignification; NAC domain transcription factor
内果皮发育木质化是蔷薇科等植物果实发育
过程中的一种特殊现象(Dardick等2010)。其形成
过程与植物中普遍存在的管状分子(tracheary ele-
ment)的形成过程类似, 以木质素在次生细胞壁中
沉积为起始, 继而引发细胞凋亡, 并最终形成高度
木质化的死细胞, 而这一过程的核心环节就是木
质素等次生代谢物的沉积(Marjamaa等2007)。木
质素不仅可以为植物提供机械支持、水分运输和
防御保护等重要功能，而且也在造纸、饲料、化
工和生物质能源等经济领域中占有重要地位
(Boerjan等2003)。虽然目前有关木质素的生物合
成途径的研究已经较为深入, 但是越来越多的证
植物生理学报590
据显示, 其生物合成途径受到庞大而复杂的转录
网络直接调控(Zhao和Dixon 2011)。NAC转录因
子就是参与其中的重要的成员之一。
NAC (NAM, ATAF1/2, CUC2)转录因子为植物
所特有, 其命名取自矮牵牛NAM、拟南芥ATAF1/2
和CUC2的第一个字母，这些蛋白的N端都包含一
段保守氨基酸序列(李鹏等2010)。这类转录因子
在拟南芥、水稻和杨树中分别含有105个、75个
和163个家族成员(Hu等2010; Kikuchi等2000; Ooka
等2003)。大量研究表明NAC转录因子广泛参与顶
端分生组织形成、花器官形态建成、叶片衰老和
次生代谢物合成等调控过程(Olsen等2005)。其中
的NST/SND1类转录因子是近年来发现的一类特
异调控次生细胞壁形成和木质化的NAC转录因子
(宋东亮等2010)。
据报道, 拟南芥NST1和SND1不仅冗余调控
茎次生细胞壁的形成和木质化(Mitsuda等2005), 而
且可以通过调控长角果内果皮层b (enb)的木质化
影响果实开裂(Mitsuda和Ohme-Takagi 2008), 此外
研究还发现NST1和NST2可以冗余调控花粉囊内
皮层细胞次生细胞壁的生长(Mitsuda等2007)。
Zhong等(2010a)在杨树中发现了与拟南芥NST1/
SND1同源的、在木材发育过程中特异表达的
PtrWND1A/1B/2A/2B, 并认为它们与拟南芥NST/
SND1类转录因子类似, 是杨树中次生壁形成和木
质化转录调控的关键核心。因此, 分析研究NST/
SND1类转录因子在内果皮等特殊组织发育木质
化过程中所扮演的角色，对于阐明果实内果皮发
育形成机制具有重要的理论和应用价值。
桃是我国广泛栽培的重要果树作物, 同时也
是国际公认的蔷薇科中的模式植物之一(Shulaev
等2008), 其基因组已于2010年测序完成(http://
www.rosaceae.org/peach/genome)。桃果实中高度
木质化的内果皮通常被认为是食品加工和鲜食过
程中产生的副产品与垃圾, 但有研究指出桃内果
皮可以超量积累优质木质素, 因此可能成为潜在
的生物质原料(biomass feedstock) (Arvelakis等
2005; Mendu等2011)。目前有关桃内果皮发育木
质化机制的系统研究尚处于起步阶段, 仅有Dardick
等(2010)和Hu等(2011)分别从转录组学和蛋白质
组学水平研究的报道。
在本文中, 我们以硬核期桃内果皮为试材, 克
隆获得2个与拟南芥NST1/2和SND1同源的基因, 并
对其编码蛋白的结构特征及其在硬核期内果皮和
中果皮的表达特性进行分析, 以期为进一步研究
桃内果皮发育木质化过程中的转录调控机制提供
理论依据和研究线索。
材料与方法
1 试验材料
以桃‘久保’果实(Prunus persica L. ‘Okubo’)为材
料。采样树为北京市平谷区试验果园中树势健壮,
生长较为一致, 采用常规栽培管理的六年生桃树5
株, 自盛花期后每7 d从每株树外围长势相似的1年
生结果枝上采取果实5个, 液氮速冻后–70 ℃保存。
2 PpNST1和PpSND1基因序列的克隆
我们以拟南芥NST1/2和SND1的氨基酸序列
为信息探针, 使用BLASTP搜索桃基因组, 分别选
取了相似度最高且E值最低的2条序列, 在其编码
区序列两侧设计基因特异引物(NST1F: 5 ATGAG-
TATATCTGTAAATGGG 3, NST1R: 5 TTATATA-
GAACCGTTCGAC 3; SND1F: 5 ATGGCTGAG-
GATCATATGAATC 3, SND1R: 5 TTATACAG-
AC A AGTGGCACAG 3)。使用EASYspin植物
RNA快速提取试剂盒(北京博迈德科技发展有限公
司)提取盛花期后37 d内果皮的总RNA, 经Prime-
Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit (大连宝生物
工程有限公司)合成cDNA 第一链, 并以此cDNA为
模板, 采用50 μL反应体系进行PCR扩增, 反应程序
为: 95 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 61 ℃退火
30 s, 72 ℃延伸1 min, 38次循环; 72 ℃延伸10
min。PCR产物经1%琼脂糖电泳检测后回收、纯
化与并与pMD-19T载体连接后转化DH5α感受态
细胞, 挑选阳性克隆交由上海生工生物工程技术
服务公司进行测序。
3 PpNST1和PpSND1的生物信息学分析
使用ProtParam (http://web.expasy.org/prot-
param/)预测编码蛋白的理化性质; 使用Pfam 26.0
(http://pfam.sanger.ac.uk/)预测蛋白结构域; 使用
SignalP 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)
预测信号肽; 使用TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.
dk/services/TMHMM/)预测跨膜区; 使用WoLF
胡昊等: 桃PpNST1和PpSND1转录因子基因的克隆与表达分析 591
PSORT (http://wolfpsort.org/)预测亚细胞定位; 使
用ClustalW 2.1进行多重序列比对分析; 使用MEGA
5.0以Neighbor-Joining (NJ)算法和Poisson 模型构
建系统进化树, 其中bootstrap值设为1 000。
4 木质素的组织化学染色与定量分析
将采集的果实沿缝合线纵切, 采用间苯三酚-
盐酸染色法(Abeles和Biles 1991)检测内果皮木质
素的沉积状况, 同时切取内果皮参照鞠志国(1991)
方法测定木质素含量。
5 荧光实时定量PCR分析
使用PrimerExpress 3.0 (美国Applied Biosys-
tems公司)软件设计荧光实时定量PCR引物(表1),
以TEF2 (translation elongation factor 2, 桃基因组位
点ppa001368m)基因作为内参照(Tong等2009)。提
取桃果实硬核期, 即盛花期后28、35、45、52和59
d的内果皮和中果皮的RNA, 经DNase I (美国Pro-
mega公司)处理后采用ReverTra Ace qPCR RT Kit
(日本Toyobo公司)合成cDNA第一链。对所得cDNA
稀释10倍后, 使用SYBR Premix Ex Taq (大连宝生
物工程有限公司), 以25 μL反应体系在7300 Real-
Time PCR System (美国Applied Biosystems公司)上
进行荧光实时定 量PCR分析, 每个反转录样品重
复4次试验。反应程序为: 95 ℃预变性30 s; 95 ℃
变性5 s, 60 ℃退火31 s, 40次循环。反应程序结束
后由仪器自动生成熔解曲线。使用2−ΔΔCT法计算在
Excel中计算各检测基因相对于内参基因TEF2的
表达量(Livak和Schmittgen 2001)。
结果与讨论
1 桃PpNST1和PpSND1基因的克隆
通过BLASTP程序检索桃基因组, 初步确定了
分别与拟南芥NST1/2和SND1同源度最高的桃基
因位点ppa020746m和ppa006801m (表2)。在基因
组预测的编码区两侧设计基因特异性引物对反转
录cDNA进行RT-PCR扩增, 获得2条大小约为1 200
bp的PCR产物。测序结果表明其长度均为1 188
bp, 与两者的桃基因组预测长度完全一致, 其中
ppa020746m的碱基组成与基因组预测组成完全一
致, 而ppa006801m则存在2个碱基的差异。我们将
两者分别命名为PpNST1和PpSND1。
2 PpNST1和PpSND1的生物信息学与系统进化分析
PpNST1和PpSND1的基因编码区全长均为
1 188 bp, 可编码396个氨基酸, 且两者氨基酸序列
的相似度为67%。根据Pfam蛋白质结构域预测分
析, 两者的N端均含有高度保守的、由165个氨基
酸组成的NAC结构域, 为DNA结合功能区(Olsen等
2005), 多重序列比对还确认两者的NAC结构域中
都包含5个保守的亚结构域A~E (图1)。PpNST1和
PpSND1的C端虽然差异较大, 但仍然含有NST/
SND1类转录因子所特有的结构域LP-box和WQ-
box (Ko等2007) (图1), 为转录激活功能区(Yamaguchi
和Demura 2010)。ProtParam预测PpNST1和PpSND1
编码蛋白的分子量分别为45 537.5和44 687.4 Da,
等电点分别为5.94和5.86。SignalP和TMHMM预
测显示两者均不含信号肽和跨膜区。亚细胞定位
表1 荧光实时定量PCR所使用的引物
Table 1 Primers for quantitative real-time PCR
基因名称 引物序列 (5→3)
PpNST1 正向引物: GGAAGAAGAGAATGAAGGCAACA
反向引物: TGGTGGAGTTTGGGCTGTCT
PpSND1 正向引物: AAGATGGGTGGGTGGTATGC
反向引物: TCAAGCACCCCATCGTTTC
PpMYB63 正向引物: GATGTTCCATTAGTGCCATTTCAG
反向引物: AAGCCACTTCTCATTTTCATGTTG
PpMYB85 正向引物: CTCATCAAGCTCACCACCAGAA
反向引物: GAGTTTCATCCACCCACAGGTT
PpMYB46 正向引物: CCTCGGAGCCTAAAGATCATCA
反向引物: CACCAACCGTAGACTGCATCA
PpMYB83 正向引物: CAGGACGAACGGACAATGAA
反向引物: CTCTAGGCTCTGATGAATCACTATCG
PpTEF2 正向引物: GTTGCCTTGGTCGGTCTTGA
反向引物: CAGAAGCCACCTTGCATTGA
表2 拟南芥与桃的同源基因分析
Table 2 Analysis of homologous genes between Arabidopsis thaliana and Prunus persica
拟南芥基因位点 拟南芥基因位点注释 同源桃基因位点 BLASTP得分 E值
AT2G46770 ANAC043; NST1 ppa020746m 371 1e-103
AT3G61910 ANAC066; NST2 ppa020746m 323 7e-89
AT1G32770 ANAC012; SND1; NST3 ppa006801m 345 3e-95
植物生理学报592
预测表明两者均定位于细胞核，这与已报道的拟
南芥SND1 (Zhong等2006)和杨树PtrWND1B/2B
(Zhong等2010a)亚细胞定位试验结果一致。
参考并重建Shen等(2009)的关于11种植物中
1 232个NAC转录因子的聚类分析, 表明PpNST1、
PpSND1与AtNST1/2、AtSND1均属于NAC-c亚家
族中c-3亚组的NST/SND1亚分支(图2-A)。提取该
亚分支中的相关蛋白序列与PpNST1和PpSND1进
行系统进化分析。结果(图2-B)表明PpNST1和
PpSND1的进化符合植物分类学的种属特征, 两者
与葡萄(Vitis vinifera)和毛果杨(Populus trichocar-
pa)的相似度较高, 分别为67%~73%和62%~78%,
其中PpSND1与苹果(Malus domestica) MdNAC
6/12的相似度达92%, 而与拟南芥(Arabidopsis thal-
iana)和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的相似度较
低, 分别为49%~67%和33%~47%。
3 PpNST1、PpSND1及其可能的下游转录因子在
硬核期内果皮和中果皮的表达分析
为了准确确定桃果实发育的硬核期, 我们采
用组织化学染色方法检测木质素的沉积动态, 并
图1 PpNST1、PpSND1及其它植物NAC蛋白的多重序列比对分析
Fig.1 Multiple sequence alignment analysis of PpNST1, PpSND1 and NAC domain proteins from other plants
苹果(Malus domestica): MdNAC6 (ADL36808.1)、MdNAC12 (ADL36793.1); 毛果杨(Populus trichocarpa): PtrWND1A (ADR00330)、
PtrWND1B (ADR00331)、PtrWND2A (ADR00332)、PtrWND2B (ADR00333); 拟南芥(Arabidopsis thaliana): AtNST1 (AEC10750)、At-
NST2 (AEE80278)、AtSND1 (AEE31527)。
胡昊等: 桃PpNST1和PpSND1转录因子基因的克隆与表达分析 593
对内果皮木质素进行定量分析。通过间苯三酚-盐
酸染色法对内果皮木质素进行染色观察, 确认盛
花期后35~59 d内果皮开始逐渐出现明显的木质素
沉积(图3-A)。同时, 木质素定量分析结果也表明
此期间内果皮木质素含量呈较为明显的线性增长
的趋势(图3-B)。根据以上两个特点可以判断盛花
期后35~59 d属于桃果实发育的硬核期。
分别提取盛花期后28、35、45、52和59 d的
内果皮和中果皮的总RNA并反转录为cDNA, 以
TEF2基因作为内参照, 采用荧光实时定量PCR方
法对PpNST1和PpSND1进行相对表达量检测分
析。熔解曲线分析显示TEF2、PpNST1和PpSND1
均具有单一的特征峰, 其Tm值分别为83、82.5和
81.5, 表明所用引物具有良好的特异性。
分别将盛花期后28 d内果皮和中果皮的表达
量为设定为“1”, 采用2−ΔΔCT法进行作图分析。结果
表明, 随着内果皮的发育, PpNST1表达量逐渐上
升, 并在盛花期后59 d达到最大值(45.2倍), 而其在
中果皮的表达量也有少许上升, 但远低于其内果皮
中的表达量(图4)。在盛花期后52 d内果皮PpSND1,
出现极其显著的上调表达, 其表达量由之前的3倍
突然增加至325.2倍, 达到最大值, 之后在59 d下降
至96倍, 而其在中果皮中则无显著变化(图4)。Mit-
suda和Ohme-Takagi (2008)报道了NST1和SND1可
图2 PpNST1、PpSND1及其同源序列的系统进化分析
Fig.2 Phylogenetic analysis of PpNST1, PpSND1 and their homologs
A: NAC-c亚家族的系统进化树; B: c-3亚组NST/SND1亚分支的系统进化树。苹果(Malus domestica): MdNAC6 (ADL36808.1)、
MdNAC12 (ADL36793.1); 葡萄(Vitis vinifera): VvNAC002 (XP_002279545)、 VvNAC055 (XP_002267383); 毛果杨(Populus trichocarpa):
PtrWND1A (ADR00330)、PtrWND1B (ADR00331)、PtrWND2A (ADR00332)、PtrWND2B (ADR00333); 拟南芥(Arabidopsis thaliana): At-
NST1 (AEC10750)、AtNST2 (AEE80278)、AtSND1 (AEE31527); 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula): MtNST1 (ADK23700)。
图3 桃内果皮木质素沉积过程及木质素含量的检测
Fig.3 Assay of lignin deposition process and lignin content in peach endocarp
A: 使用间苯三酚-盐酸对桃果实进行染色; B: 桃内果皮木质素含量测定。
植物生理学报594
以冗余调控拟南芥长角果内果皮层b和胎座框周
围维管束的木质化, 且发现它们的启动子活性都
会随着木质化程度的发展而逐渐增强。虽然拟南
芥长角果与桃的核果在解剖结构上存在较大差异,
但这一报道与我们有关PpNST1和PpSND1的表达
分析结果类似。
图4 桃果实发育过程中PpNST1和PpSND1相对表达水平的比较
Fig.4 Comparison of relative expression levels of PpNST1 and PpSND1 during peach fruit development
图5 桃果实发育过程中PpMYB63、PpMYB85、PpMYB46和PpMYB83相对表达水平的比较
Fig.5 Comparison of relative expression levels of PpMYB63, PpMYB85, PpMYB46 and PpMYB83 during peach fruit development
胡昊等: 桃PpNST1和PpSND1转录因子基因的克隆与表达分析 595
大量研究证据显示NST1和SND1可能是次生
细胞壁形成和木质化信号途径的“总开关” (Zhong
等2008, 2010b; Zhong和Ye 2007, 2009), 两者都可
以直接作用于下游一系列转录因子的启动子区,
并激活它们的表达, 它们的具体作用机制大致包
括两种类型: (1) NST1和SND1直接调控可以作用
于木质素单体生物合成途径相关酶类基因的转录
因子, 如MYB58/63/85等; (2) NST1和SND1直接调
控第二级转录因子(如MYB46/83等), 并由这些转
录因子进一步调控第三级转录因子(如MYB42/
43/52/54/69/103、SND2、KNAT7等)的表达, 最后
由这些第三级转录因子调控次生壁形成相关酶类
基因。
为了检测这些NST1和SND1直接调控的下游
基因是否被激活表达, 我们通过搜索桃基因组, 寻
找到了分别与拟南芥MYB58/63、MYB85、MYB46、
MYB83基因同源的ppa026315m (PpMYB63)、ppa-
021568m (PpMYB85)、ppa009566m (PpMYB46)、
ppa016923m (PpMYB83), 并对它们进行了荧光实
时定量PCR分析。结果表明这些基因的表达量均
在盛花期后52或59 d出现显著的上调表达(图5)。
这些结果与先前在拟南芥和杨树中的报道基本一
致, 表明尽管不同种属的植物在形态解剖学上大
相径庭, 但它们在次生壁形成和木质化的转录调
控机制上却相当高度保守, 并且很有可能起源自
同一祖先。此外，我们还发现内果皮中PpNST1和
PpSND1分别与PpMYB63/85和PpMYB46/83的表达
模式类似，即它们的表达峰值分别出现于盛花期
后59和52 d (图5)，由此推测它们之间的表达可能
存在一定关联。但有关它们的具体作用机制和调
控网络尚需进一步的突变体互补和转基因试验进
行验证。
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