全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (1): 45~50 45
收稿 2013-09-26　　修定 2013-11-07
资助 国家自然科学基金(31300223)、陕西省自然科学基金
(2012JQ3003)、高等学校博士学科点专项科研基金
(20126101120019)、教育部留学回国人员科研启动基金资
助项目(教外司留[2013]693号)和陕西省教育厅科研计划
(11JK0613)。
* 共同贡献作者。
** 通讯作者(E-mail: xuanhaung@nwu.edu.cn; Tel: 18202928217)。
明日叶叶片的丛生芽诱导和植株高频再生
刘梦昕*, 曾洁*, 黄凤智*, 易姝利, 黄萱**
西北大学生命科学学院, 西部资源与现代生物技术省部共建教育部重点实验室, 陕西省生物技术重点实验室, 西安710069
摘要: 明日叶(Angelica keiskei Koidzumi)是伞形花科当归属植物, 具有很高的药用价值。为解决生产上短时间快速获得大
量明日叶种苗的相关技术, 以明日叶叶片为外植体进行组织培养实验, 直接诱导产生丛生芽并且得到再生植株, 建立了明
日叶叶片离体再生快速繁殖体系。结果表明, 诱导丛生芽分化的最适培养基是MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-1 6-BA, 诱导
率可高达100%; 诱导生根的最适培养基是MS+1.0 mg·L-1 NAA, 诱导率可达90%, 将生长良好的再生植株进行移栽, 存活率
可达86%。
关键词: 明日叶; 叶片; 组织培养; 丛生芽; 快速繁殖
Buds Induction and High-Frequency Plant Regeneration of Angelica keiskei
Koidzumi Leaves
LIU Meng-Xin*, ZENG Jie*, HUANG Feng-Zhi*, YI Shu-Li, HUANG Xuan**
Provincial Key Laboratory of Biotechnology of Shaanxi, Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western
China, Ministry of Education, College of Life Science, Northwest University, Xi’an 710069, China
Abstract: Angelica keiskei Koidzumi belongs to Umbelliferae Angelica plant, which has a very high medicinal
value. In order to solve the related technologies of production to quickly obtain a great quantity of seedlings in
a short time, using leaves as explants for tissue culture experiments, directly induced clustered buds and get the
regenerated plant of Angelica keiskei Koidzumi were tested to set up its in vitro regeneration of rapid
propagation system. The results showed that the optimum medium for clustered buds multiplication was
MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-1 6-BA, the rate of differentiation of adventitious buds reached to 100%,
rooting induction was MS+1.0 mg·L-1 NAA, and the rate of rooting reached to 90%. Then transplant the well-
growing regeneration plant, the survival rate could reach 86%.
Key words: Angelica keiskei Koidzumi; leaf; tissue culture; clustered buds; rapid propagation
明日叶(Angelica keiskei Koidzumi)中文别名
八丈芹、长寿菜、灵草、海峰人参, 也被俗称为
强身草、伸长草, 属伞形花科(Umbelliferae)当归属
(Angelica)一至二年生或多年生草本植物, 三叶复
出, 叶缘有锯齿, 伞形花序顶生。明日叶性喜冷
凉、湿润、荫蔽环境, 能适应高冷环境, 最适生长
温度为12~22 ℃, 在中、高海拔地区可全年栽种,
低海拔或平原地区适于秋种, 原产于日本火山灰
地质的伊豆、八丈诸岛 , 日本称之为Ashitaba
(Toshihiro等2006), 在常食用明日叶的八丈岛上发
现有很多长寿者(邓良利等2003), 我国20多年前从
日本引进, 台湾地区有广泛种植(李佳等2006)。
明日叶含有丰富的叶绿素、高浓度天然有机
锗、人体所需20多种矿物质元素、维生素B12及微
量元素(Nobuwa等2008), 可以提高机体免疫力、
改善睡眠(孙赫等2011)、抗菌消炎(Tuchinda等
2002)。近些年来国内外研究发现, 明日叶有很高
的药用价值 , 它的茎叶中富含多种查尔酮
(chalcones)类化合物, 具有良好的抗溃疡(Edwards
等1990)、降低胆固醇、降血脂、降血糖、抗血
栓、抗癌(周先丽等2012)、抗肿瘤(Satomi 1993)、
抗艾滋病(Uchiumi等2003)、预防糖尿病及老年痴
呆、抗氧化剂清除氧自由基及延缓衰老(邓良利等
2003)、抑制磷酸二酯酶等功效, 能治疗和预防多
植物生理学报46
种疾病, 其中降血压、血糖效果明显(邓锐等2012),
并且有研究表明, 它含有的4-羟基查尔酮及当归
醇, 具有独特的疗效(郑洪伟等2007)。
通常明日叶植株在种植后1~2年便进入繁殖
期, 开花结实后立即死亡, 其果实是双悬果, 结实
率和种子发芽率均较低, 不易栽培(郭治友等2010),
而且种植明日叶的生产成本高, 随着种植时间的
推移, 植株本身的品质也会影响查尔酮的含量。
所以, 明日叶组织培养和快速繁殖技术的研究是
生产过程中一项亟待解决的问题, 用以生产足够
的种苗来满足开发的需要(Masatake等1997)。本
文以明日叶叶片作为外植体, 用MS培养基添加不
同配比的植物生长物质对其进行组织培养, 直接
诱导产生丛生芽, 建立高频离体再生体系, 为明日
叶进一步的遗传操作奠定了基础。
材料与方法
1 实验材料
西北大学生命科学学院植物园户外自然条件
培养的明日叶(Angelica keiskei Koidzumi), 取叶片
作为外植体。
2 实验方法
2.1 消毒
在长势良好的明日叶植株上取生长7~28 d的
完整叶片作为外植体, 将外植体用流水冲洗5~10
min, 洗去浮尘; 在超净工作台上用75%的酒精浸泡
60 s, 然后用无菌蒸馏水冲洗3次; 再用0.1%的
HgCl2浸泡灭菌5~7 min, 最后用无菌蒸馏水冲洗
4~5次, 洗去残余升汞。将消毒好的明日叶叶片剪
成适当大小的小块(0.5 cm×0.5 cm), 接种在MS培
养基上进行预培养。
2.2 培养基
以MS作为基础培养基(Murashige等1962), 根
据实验诱导目的不同, 添加不同配比的植物生长
物质2,4-D、6-BA、TDZ、NAA。
2.3 培养条件
材料接种于MS培养基后, (25±2) ℃先进行暗
培养 , 转入MS诱导培养基后进行光照培养(40
μmol·m-2·s-1, 16 h·d-1)。
2.4 丛生芽的诱导及增殖
选取MS培养基中预培养的外植体, 在超净工
作台上用灭菌过的剪刀剪去其边缘部分, 露出新
鲜伤口, 接种于不同生长物质配比的MS固体培养
基上诱导产生丛生芽, 定期观察生长情况, 统计丛
生芽的数目及诱导频率。30 d左右, 将长出丛生芽
的外植体块在超净台上剪成小块分离, 使其增殖,
从而得到大量的丛生芽。
2.5 诱导生根
将长至2~3 cm, 且丛生芽长势良好的外植体
移入至不同生长物质配比的生根培养基上诱导生
根, 温度(25±2) ℃, 光强40 μmol·m-2·s-1, 每天光照14
h, 观察并统计生根率。
2.6 炼苗与移栽
当明日叶外植体长出多条且长势良好的根后,
将再生苗取出, 用流水缓慢将根部培养基冲洗干
净(注意不要伤及根部), 移栽至土壤中炼苗1~7 d。
3 统计分析
每种植物生长调节剂配比实验至少接种3瓶
材料, 每瓶接种15~20块, 重复3次, 所得数据均用
Origin 8.0和Statist 6.0进行统计学分析。
实验结果
1 不同发育时间的外植体对丛生芽诱导的影响
本实验分别采摘7、10、14、18、21和28 d的
明日叶叶片为外植体进行丛生芽诱导。将灭菌好
的外植体剪成0.5 cm×0.5 cm的小块分别接种至MS
诱导培养基中, 4周后观察丛生芽诱导情况, 并统
计相关数据(以最适生长物质配比培养基为例)。
实验结果如图1所示, 在进行丛生芽诱导时, 选取
叶龄为14 d的明日叶叶片为外植体诱导率最高, 可
达100%, 并且诱导效果最好(图1)。
图1 不同外植体发叶龄对诱导明日叶丛生芽的影响
Fig.1 Influence of different growth periods of explants on
clustered buds induction of Angelica keiskei Koidzumi
* P≤0.05, ** P≤0.01。
刘梦昕等: 明日叶叶片的丛生芽诱导和植株高频再生 47
2 不同生长物质配比对丛生芽诱导的影响
本实验使用三种外源生长物质2,4-D、6-BA、
TDZ对明日叶进行丛生芽诱导。将外植体接种于
添加不同外源生长物质配比的24种MS培养基上,
每种不同生长物质配比平行接种3皿, 15~20块外植
体·皿-1, 先进行暗培养, 一周后移至光下培养, 每天
观察记录每皿上外植体的外观变化, 实验结果如表
1所示。3~5 d后培养基上的外植体开始出现不同
程度的卷曲膨胀, 20 d后可以产生大量绿色的芽点和
少量透亮的愈伤组织, 随后, 芽点发育为丛生芽, 透亮
的愈伤组织上也分化出少量丛生芽(图2-A、B)。
结果显示在MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-1
6-BA的培养条件下, 外植体可以分化产生大量芽
点, 并且丛生芽粗壮, 呈绿色, 长势良好, 基本无愈
伤组织产生, 诱导分化率可到达100% (图2-C)。且
有结果发现, 凡添加TDZ植物生长物质的培养基
中, 外植体的诱导率均不高, 且丛生芽细瘦, 呈黄
绿色, 并易出现褐化或玻璃化现象。
3 不同生长物质配比对丛生芽诱导生根的影响
将直接诱导产生的丛生芽分成小块, 在MS+
1.0 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-1 6-BA培养基上继续培
养, 到丛生芽长至2~3 cm时转入生根培养基。根
据李佳等(2006)、郭治友等(2010)的研究结果, 单
独使用NAA作为外源生长物质诱导生根, 将再生
芽转接到梯度浓度的MS+NAA培养基中进行生根
培养, 15 d时开始生根(图2-D)。在解剖镜下观察,
表1 不同生长物质配比对丛生芽诱导的影响
Table 1 Influence of phytohormone ratio on clustered buds induction
序号
生长物质浓度/mg·L-1
丛生芽数/个 诱导率/% 生长状况

2,4-D 6-BA TDZ
1 0 0 0 0 0k 基本无分化现象
2 0 1.0 0 12 13.8±1.2i 芽较为细瘦, 色黄, 长势一般
3 0 0 0.02 7 7.4±1.2j 基本未分化
4 0.2 0.5 0 68 79.9±0.4c 芽较为细瘦, 黄绿色, 长势一般, 分化产生芽点和
愈伤组织, 一段时间后芽点明显多于愈伤组织
5 0.2 1.0 0 55 65.1±1.0de 芽较为细瘦, 淡黄色, 长势不好
6 0.5 0 0.02 47 55.2±0.8f 芽细瘦, 黄绿色, 有轻度玻璃化出现
7 0.5 0 0.05 28 32.8±0.2gh 叶边缘有少量愈伤组织产生, 但会逐渐褐化,
且不分化产生丛生芽
8 0.5 0 0.1 8 9.6±1.4j 基本未分化
9 0.5 0.2 0 82 86.3±0.3bc 分化产生大量粗壮的丛生芽, 绿色, 长势较好,
并且产生少量品质较好的愈伤组织
10 0.5 1.0 0 80 94.5±0.3ab 芽较为粗壮, 浅绿色, 长势较为良好
11 0.5 1.5 0 61 71.2±2.1d 芽较为细瘦, 淡黄色, 长势一般
12 1.0 0 0 13 14.4±0.5i 芽细瘦, 枯黄
13 1.0 0 0.02 54 63.5±1.6e 芽较为细瘦, 黄绿色, 长势不好
14 1.0 0 0.05 34 39.7±1.1g 芽细瘦, 色黄, 长势不好
15 1.0 0 0.1 11 11.6±1.8j 基本未分化
16 1.0 0.2 0 85 100±0.6a 分化产生很多芽点, 且丛生芽粗壮, 绿色, 长势
良好, 基本未见愈伤组织
17 1.0 0.5 0 81 90.1±1.1b 芽较为粗壮, 浅绿色, 长势较为良好
18 1.0 1.5 0 73 85.4±1.2bc 芽较为细瘦, 黄绿色, 长势一般
19 1.0 2.0 0 55 63.9±1.4e 芽较为细瘦, 淡黄色, 长势不好
20 1.5 0.2 0 40 46.4±1.3g 芽细瘦, 枯黄
21 1.5 0.5 0 45 53.5±1.4f 芽较为细瘦, 黄绿色, 长势一般
22 1.5 1.0 0 30 34.7±2.3gh 芽细瘦, 发黄, 长势不好
23 1.5 2.0 0 9 10.3±2.3j 基本未分化
24 2.0 0.2 0 16 18.8±1.9i 芽较细瘦, 枯黄
25 2.0 0.5 0 27 31.5±1.6h 芽较为细瘦, 淡黄色, 长势不好
26 2.0 1.0 0 12 15.4±1.7i 芽细瘦, 枯黄
27 2.0 1.5 0 8 7.8±2.4j 基本未分化
植物生理学报48
对再生根的长度做粗略测量, 并对生根数量做准
确的计数, 计算生根率, 实验结果如表2所示。结
果显示, 随着NAA浓度的升高, 根长及生根率逐渐
升高, 当浓度升至1.0 mg·L-1时, 生根率达到最高,
为90%, 此浓度最易促进再生芽生根(图2-E); 当
NAA浓度超过1.0 mg·L-1后, 再生根的诱导率开始
明显下降, 并且根变得粗短。
4 炼苗与移栽
当生根苗在锥形瓶中长至4 cm左右且长出
15~18条根时, 将生根苗移栽至土中, 浇足水并用
保鲜膜封盖盆口, 早晚各喷1次水, 放置于人工气
候室进行炼苗。3 d后逐步打开保鲜膜, 7 d后统计
图2 明日叶叶片的丛生芽诱导和植株再生
Fig.2 Buds induction and plant regeneration of Angelica keiskei Koidzumi leaves
A和B: 以叶片作为外植体诱导产生丛生芽; C: 在MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-1 6-BA的培养条件下分化产生大量绿色芽点; D: 在
MS+NAA培养基中诱导生根, 15 d时开始生根; E: 在MS+1.0 mg·L-1 NAA的培养条件下诱导生根; F: 移入盆土7 d的明日叶再生苗。
刘梦昕等: 明日叶叶片的丛生芽诱导和植株高频再生 49
表2 不同NAA浓度对丛生芽诱导生根的影响
Table 2 Effects of different NAA concentrations on rooting induction
序号 NAA/mg·L-1 根数/个 根长/cm 生根率/% 生长状况
1 0.1 0 0f 0 不生根
2 0.2 2 0.2±0.1e 10 基本不生根
3 0.4 4 1.1±0.1d 33.2 根细弱且短, 生长缓慢
4 0.6 6 2.5±0.3c 45.6 根较细, 无主侧根之分, 生长缓慢
5 0.8 11 4.5±0.2b 60.7 根较粗壮, 生长速度较快
6 1.0 18 6.8±0.4a 90.0 根粗壮, 主侧根明显, 生长快
7 1.2 9 4.1±0.1b 45.2 根粗, 几乎无法区分主侧根
8 1.4 4 2.1±0.3c 23.4 根粗且短, 无法区分主侧根
成活率可达86% (图2-F)。
讨　　论
本实验以明日叶叶片作为外植体, 建立了明
日叶叶片离体再生快速繁殖体系, 省略了脱分化
产生愈伤组织的过程, 成功诱导丛生芽和再生根,
得到了生长状态良好的再生植株, 初步建立了明
日叶植株再生体系。目前已知的明日叶组织培养
和快速繁殖技术的报道, 多采用带芽茎段作为外
植体 , 叶片与叶柄难以产生愈伤组织 (李佳等
2006)。本实验首次成功建立了以叶片为外植体,
直接诱导丛生芽分化的再生体系, 有效的降低了
组织培养及快速繁殖的工作量, 为进一步的遗传
操作研究和开发明日叶的经济利用价值打下良好
基础。
实验结果显示, 14 d叶龄的外植体为最适外植
体; 在MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-16-BA的培养
条件下, 外植体会直接产生大量芽点, 丛生芽粗壮,
呈绿色且长势良好, 诱导率可高达100%; 在MS+
1.0 mg·L-1 NAA的培养条件下, 丛生芽诱导生根状
态良好, 生根率高达90%。
现有的对于植物组织培养与快速繁殖技术的
研究, 多数为6-BA和NAA组合使用, 如康联伟等
(2010)对菱叶红景天组织培养技术的研究。而本
实验主要为2,4-D和6-BA组合使用, 并且取得了很
好的诱导效果。根据王玉华等(2009)的研究结果,
2,4-D与6-BA组合使用可以显著提高草莓不定芽
的再生频率, 这与本试验的发现相一致。王娟等
(2012)对小叶龙竹的研究结果表明, 2,4-D的浓度对
愈伤组织分化能力的影响存在差异, 而适于不定
芽分化的最适培养基是2,4-D、6-BA、KT三者组
合。在曹雅琴等(2009)的研究中发现, 2,4-D与TDZ
组合, 苎麻再生芽分化率高于其他几种植物生长物质
组合。也有发现草莓弗吉尼亚品种在TDZ、2,4-D、
IBA组合使用时不定芽再生频率最高(柏锡等2012)。
根据康大力等(2012)的研究表明, TDZ在喜树
组织培养过程中可同时发挥生长素和细胞分裂素
的作用, 保持愈伤组织生长旺盛, 提高植物分化率,
且1.0 mg·L-1 TDZ相较于传统植物生长物质培养可
明显增高喜树愈伤组织的叶绿素含量。也有研究
发现, TDZ与NAA组合使用可影响植物愈伤组织
的色泽、品质(曾静等2010)。Pasqua等(2005)研究
发现, TDZ与2,4-D组合使用可明显促进愈伤组织
内细胞花青素的积累, 有利于愈伤组织生长。本
实验采用TDZ与2,4-D组合使用, 结果发现在MS+
0.5 mg·L-1 2,4-D+0.05 mg·L-1 TDZ培养条件下, 明日
叶外植体会少量分化出愈伤组织, 但愈伤组织会逐
渐褐化, 且不会分化产生丛生芽。而当TDZ浓度高
于0.1 mg·L-1时, 植株再生能力降低甚至不分化。
本实验过程中, 在含有不同浓度2,4-D培养基
中诱导丛生芽形成时发现, 随着2,4-D浓度的升高,
外植体直接分化产生丛生芽的能力有所增强, 但
当2,4-D浓度升高至2.0 mg·L-1时, 植株分化能力反
而下降。这与李文静等(2012)对荠菜的研究结果
相一致, 说明2,4-D浓度过高会抑制植株的再生能
力。与徐涌等(2011)对于吴茱萸组织培养体系的
研究结果相比较, 诱导植株生根的NAA浓度有明
显增高, 这一差别可能是由于不同植株外植体对
于外源生长物质刺激的反应能力不同而造成的。
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