全 文 ：研究报告
Research Report
适用于转录组测序的毛葡萄叶片总 RNA 提取方法筛选
张树伟 1 丁峰 1 黄羽 2 彭宏祥 3* 卢江 1*
1 广西农业科学院, 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室, 南宁, 530007; 2 广西农业科学院, 葡萄与
葡萄酒研究所, 南宁, 530007; 3 广西农业科学院, 园艺研究所, 南宁, 530007
*通讯作者, penghongxiang@126.com; jiang.lu.cau@gmail.com
摘 要 毛葡萄叶片中含有大量多糖、多酚等多种次生代谢物，严重影响 RNA 提取质量，筛选从毛葡萄
叶片中提取高质量 RNA 的方法是开展相关分子研究的基础。本研究采用改良 CTAB 法、改良 SDS/酚法和
三种试剂盒法，筛选适合转录组测序的提取毛葡萄叶片总 RNA 的方法。五种方法均可以获得毛葡萄叶片
总 RNA，但在纯度和完整性上差别较大。改良 CTAB 和改良 SDS/酚法提取的总 RNA OD260/OD230 比值小
于 1.8，试剂盒 A 法提取的总 RNA 在纯度和完整性上均可以满足转录组测序要求，试剂盒 B 法和试剂盒 C
法提取的总 RNA 降解严重。相比其他四种方法，试剂盒 A 法提取的毛葡萄叶总 RNA 质量更好，在纯度
和完整性上均能满足转录组测序及其他分子生物学实验的要求。
关键词 毛葡萄, 叶片, RNA 提取方法, 转录组测序
Screening of Methods to Isolate High-quality Total RNA from Vitis
quinquangularis Leaves for Transcriptome Sequencing
Zhang Shuwei1 Ding Feng1 Huang Yu2 Peng Hongxiang3* Lu Jiang 1*
1 Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory, Guangxi Academy of Agricultural
Sciences, Nanning, 530007; 2 Grape and wine research institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences,
Nanning, 530007; 3 Horticultural research institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, 530007
*Corresponding authors, penghongxiang@126.com; jiang.lu.cau@gmail.com
Abstract Leaves of Vitis quinquangularis were rich in polysaccharides, polyphenols and other secondary
metabolites, which influenced the quality of total RNA seriously. It was the basic of molecular research to screen
extraction methods for high-quality RNA from leaves of Vitis quinquangularis. In this study, modified
cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), modified SDS/phenol and three commercial kits extraction methods
were screened to isolate total RNA for transcriptome sequencing. These five methods all could obtain total RNA
from leaves of Vitis quinquangularis, but purity and integrity were quite different. OD260/OD230 ratio for RNA
samples prepared by improved CTAB and SDS/phenol methods was less than 1.80. Total RNA extracted with kit
A met the requirements of purity and integrity for transcriptome sequencing. Total RNA extracted with kit B and
kit C was seriously degraded. Compared with other four protocols, kit A method could generate high-quality total
RNA which could meet the request of transcriptome sequencing and other molecular biological experiments.
Keywords Vitis quinquangularis, Leaves, RNA extraction method, Transcriptome sequencing

网络出版时间：2016-11-22 13:41:03
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20161122.1341.006.html
毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd.)是广西野生葡萄中分布最广、蕴藏量最大及开发利用最多的种类，
不仅具有适应南方湿热气候的特性，而且具有对黑痘病等多种病害的抗性，是抗性育种的珍贵资源，开展
毛葡萄分子生物学方面的研究对南方葡萄种质创新具有重要意义，获得纯度高、完整性好的 RNA 是开展
毛葡萄分子生物学研究的关键基本环节之一。
目前，提取植物 RNA 的方法主要有 CTAB 法、SDS/酚法、Trizol 法、异硫氰酸胍法和热硼酸法等(王
春晖等, 2013; 安振宇等, 2015)。对于富含多糖、多酚类植物 RNA 的提取方法有很多报道，主要采用 CTAB
和 SDS 法(阮孟斌等, 2011)。王暑辉等(2012)对 SDS 酚法进行改进，从侧柏中提取 RNA，淦国英等(2009)
采用改良CTAB法从香蕉叶片中提取了高质量的RNA。葡萄RNA提取方法的报道也有很多，房经贵等(2003)
采用 CTAB 法从 Perlette 葡萄冬芽中提取 RNA，李红熙等(2012)采用 CTAB 结合 SDS 法从‘蛇龙珠’葡萄中
提取的 RNA 可以满足 RT-PCR 的要求，付阳等(2013)采用改良 CTAB 法从山葡萄提取了适用于 RT-PCR、
构建 cDNA 文库等研究的总 RNA。
转录组测序技术是利用深度测序分析基因表达的重要手段，已广泛应用于植物各类生物学性状的研
究。该技术对植物样本RNA的质量要求较高，通常RNA浓度≥100 ng/μL，OD260/OD280≥1.8，OD260/OD230≥1.8，
28S/18S≥1.0，样品质量不达标可能影响磁珠分离 mRNA 及文库随机性，甚至建库失败。毛葡萄组织中含
有大量的多酚、多糖，是影响提取高质量 RNA 的关键因素(Asif et al., 2000)。多酚类物质在提取过程中极
易被氧化形成醌类与 RNA 不可逆结合(Iandolina et al., 2004)，多糖的许多理化性质与 RNA 相似，在提取过
程中很容易与 RNA 形成胶状物而共沉淀(Carra et al., 2007)，从而影响 RNA 提取产量和质量。目前，对毛
葡萄高质量 RNA 提取方法的研究不多。通过比较常用的 CTAB 法、SDS 法和试剂盒法分别提取毛葡萄叶
片中的总 RNA，比较各方法的优缺点，筛选获得高质量 RNA 的提取方法，为毛葡萄转录组测序及相关分
子生物学的研究奠定基础。
1 结果与分析
1.1 RNA 凝胶电泳检测
分别采用 5 种方法提取毛葡萄叶片总 RNA，通过凝胶电泳方法评价 RNA 质量(图 1)，结果显示 5 种方
法均可以提取出毛葡萄叶片总 RNA。采用改良 CTAB 法提取的总 RNA，28S 亮度比 18S 略大，但是点样
孔附近有明显亮点，说明有残留蛋白质等污染。采用改良 SDS/酚法，28S 和 18S 条带清晰，28S 亮度比 18S
大，说明 RNA 未降解，但是背景较深。试剂盒 A 法提取的 RNA，28S 和 18S 条带清晰，无拖尾和降解等
现象，完整性好。试剂盒 B 和试剂盒 C 法提取的 RNA 条带亮度低，且 28S 和 18S 条带均有拖带现象，说
明提取的 RNA 完整性较差。
1.2 RNA 纯度和浓度检测
OD260/OD280 比值是衡量 RNA 纯度的指标，高质量的 RNA，OD260/OD280 比值在 1.8~2.2 之间，
OD260/OD230>1.8。5 种方法提取的 RNA 质量差别较大(表 1)，提取的 RNA 原液浓度分别是 501 ng/μL、710
ng/μL、723 ng/μL、102 ng/μL、122 ng/μL，均可以满足 RNA-seq 对样品浓度的要求，但是试剂盒 B 和 C
提取的总 RNA 浓度相对较低。5 种方法提取的毛葡萄叶片总 RNA OD260/OD 280 比值分别是 1.96、2.05、2.07、
1.61、1.52，OD260/OD230比值分别是 1.46、1.71、2.06、0.56、0.97；采用改良 CTAB、改良 SDS/酚和试剂
盒 A 法提取的 RNA OD260/OD280 比值介于 1.8~2.2 之间，说明没有蛋白质等有机物污染，改良 CTAB 和 SDS/
酚法提取的 RNA OD260/OD230 比值小于 1.8，说明有盐、多糖、多酚等污染，这种纯度的 RNA 可以满足普
通 RT-PCR 的试验需求，但不能满足 RNA-seq 测序要求。试剂盒 B 和试剂盒 C 提取的总 RNA OD260/OD280
和 OD260/OD230 均不在要求范围内，不满足 RNA-seq 测序要求。










图 1 5 种方法提取的总 RNA 电泳
Figure 1 Electrophoresis profile of total RNA with five methods.
为保证后续试验的准确性，采用 Agilent 2100 对改良 CTAB、改良 SDS/酚和试剂盒 A 法提取的 RNA
样品进行深度分析(表 1; 图 2)，28S/18S 值分别为 1.2、1.7、1.8，RIN (RNA integrity numbers)值分别为 7.0、
8.4、7.8。进一步说明试剂盒 A 提取的总 RNA 无降解、完整性好，完全可以满足 RNA-seq 测序要求。
表 1 5 种方法提取的 RNA 质量
Table 1 The quality of total RNA extracted with five methods
方法
Method
原液浓度(ng/μL)
Concentration (ng/μL)
总量(μg)
Quality (μg)
OD260/280 OD260/230 28S/18S RIN 值
RIN value
改良 CTAB
Modified CTAB
501 25.05 1.96 1.46 1.2 7.0
改良 SDS/酚
Modified SDS/phenol
723 36.15 2.05 1.71 1.7 8.4
试剂盒 A
Kit A
710 35.50 2.07 2.06 1.8 7.8
试剂盒 B
Kit B
102 5.10 1.61 0.56 － －
试剂盒 C
Kit C
122 6.10 1.52 0.97 － －
注: -: 未检测该值
Note: -: This value was not detected
图 2 Agilent 2100 RNA 检测提取总 RNA 质量
Figure 2 Profile measured using the Agilent 2100 Bioanalyzer
2 讨论
毛葡萄是我国原产的重要野生葡萄资源，具有优良的抗逆性，广西毛葡萄资源丰富，是南方葡萄种质
创新的基础，开展相关分子生物学研究，有利于合理利用该种质资源。而 RNA 提取是分子生物学研究的
技术基础，高质量的 RNA 是实验的前提。衡量 RNA 质量的标准主要是纯度和完整性，RNA 纯度主要依
据 OD260/OD280 和 OD260/OD230 比值，OD260/OD 280在 1.8~2.2 之间，OD260/OD230>1.8，完整性 RIN 值从 1~10，
RIN 值为 1 说明 RNA 完全降解，当 RIN 值为 10 说明 RNA 未降解，因此 RIN 值越大说明 RNA 越完整(Strand
et al., 2007; Schroeder et al., 2006)。
毛葡萄是多年生木本植物，叶片中富含多糖和酚类等物质，在提取过程中极易与 RNA 形成复合物或
共沉淀(李志能等, 2007; 杨占军等, 2009)，严重制约提取 RNA 的质量。有关植物总 RNA 提取方法很多，
但是不同物种，甚至不同品种的最适方法也存在差异。转录组测序技术对样品总 RNA 的质量要求较高，
因此，找到一种适合于毛葡萄的总 RNA 提取方法很有必要。
本研究选用 5 种方法提取毛葡萄 RNA，改良 CTAB 和改良 SDS/酚法，在提取液中加入了 PVP 和 β-
巯基乙醇。PVP 是多酚化合物的螯合剂，具有很强的酚结合能力，可以有效防止酚被氧化成醌类与 RNA
结合。β-巯基乙醇作为强还原剂可以打断多酚氧化酶的二硫键，防止多酚氧化(闫光照等, 2009; Chang 等,
1993)。改良 CTAB 和 SDS/酚法提取的 RNA OD260/OD230 比值小于 1.8，有杂质污染，而且两种方法耗时较
长，整个操作过程需要 4 h 左右。试剂盒 A 法，整个提取过程需要 1 h 左右，提取的总 RNA OD260/OD 280
比值介于 1.8~2.2 之间，OD260/OD230 比值大于 1.8，说明 RNA 纯度高无明显污染，RIN 值为 7.8，说明 RNA
完整性较好。试剂盒 B 和 C 在提取过程中极易形成胶状沉淀，严重影响 RNA 的质量和数量，OD260/OD280
和 OD260/OD230 比值均小于 1.8，电泳结果也显示这两种方法提取的 RNA 存在不同程度的降解，很难满足
后续实验要求，不适用与毛葡萄总 RNA 的提取。
对几种提取方法进行比较，可以发现试剂盒 A 法操作简单，可以快速有效的提取毛葡萄 RNA，并且
RNA 在纯度和完整性上均可以满足 RT-PCR，RNA-seq 等后续实验要求，是提取毛葡萄叶片总 RNA 的首
选方法。
3 材料与方法
3.1 材料
供试材料为毛葡萄(株系: 平山-1)成熟叶片，取自广西农业科学院明阳葡萄基地，采集的样品迅速放
入液氮速冻-80℃保存备用。
3.2 RNA 提取准备
RNA 提取中所用的溶液均用经高压灭菌的 DEPC 水直接配置，使用的研钵、药勺、移液枪头和离心
管等均用 0.1% DEPC 水处理并高温灭菌。
3.3 改良 CTAB 提取法
葡萄叶片加液氮迅速研磨至粉末状，称取 0.2 g 放入 1.5 mL 离心管中，加入 700 μL 65℃预热的 CTAB
Buffer (2%十六烷基三乙基溴化铵(CTAB), 2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP), 0.1 mol/L Tris-HCl, 0.25 mol/L 乙二胺
四乙酸(EDTA), 2.0 mol/L 氯化钠(NaCl), 0.5 g/L 亚精胺, 2% β-巯基乙醇)，65℃水浴 15 min 后加入等体积氯
仿/异戊醇(24:1)，震荡混匀，在 4℃下 12 000 r/min 离心 10 min，取上清；加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)重
复上一步；取上清加入 1/3 体积的 8 mol/L LiCl 混匀后 4℃过夜；在 4℃下 12 000 r/min 离心 30 min，弃上
清，加入 500 μL SSTE 溶液(5.0 mol/L NaCl, 20%十二烷基硫酸钠(SDS), 1.0 mol/L Tris (pH 8.0), 0.5 mol/L
EDTA)溶解沉淀，再加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混匀，在 4℃下 12 000 r/min 离心 10 min，取上清；加入等
体积预冷异丙醇，混匀后-80℃放置 1 h，在 4℃下 12 000 r/min 离心 30 min，沉淀用 75%乙醇洗两次，室温
干燥后加入 50 μL DEPC 水溶解沉淀，得到总 RNA 溶液。获得的 RNA 样品按照 DNase I (TaKaRa, Japan)
使用说明去除基因组 DNA。
3.4 改良 SDS/酚法
参照张今今等(2003)改良 SDS/酚法，取研磨好的样品 0.2 g，加入 80℃预热的提取缓冲液 850 μL (0.1
mol/L LiCl, 0.1 mol/L Tris, 0.05 mol/L EDTA, 1% SDS, 1% β-巯基乙醇, 16% PVP)，冰浴 15 min，在 4℃下 12
000 r/min 离心 15 min，取上清；加入 1/3 体积的 5 mol/L KAc (pH 4.8)，震荡混匀，冰浴 15 min，4℃下 12
000 r/min 离心 15 min，取上清；加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，冰浴 10 min，4℃下 12 000 r/min
离心 15 min，取上清；加入等体积预冷异丙醇，-20℃沉淀 2 h，4℃下 12 000 r/min 离心 15 min，弃上清；
用 600 μL 缓冲液(2 mol/L LiCl, 0.05 mol/L EDTA)重悬沉淀，4℃下 12 000 r/min 离心 15 min，弃上清，沉
淀用 75%乙醇洗两次，室温干燥后加入 50 μL DEPC 水溶解沉淀，得到总 RNA 溶液。获得的 RNA 样品按
照 DNase I (TaKaRa, Japan)使用说明去除基因组 DNA。
3.5 三种试剂盒法
试剂盒 A：RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen, China)；试剂盒 B：Takara MiniBEST Plant RNA Extraction
Kit (Takara, Japan)；试剂盒 C：SpectrumTM Plant Total RNA Kit (Sigma-Aldrich, USA)；具体操作步骤按试
剂盒使用手册(均取 100 mg 植物材料, 用 50 μL 洗脱液洗脱 RNA)。
3.6 RNA 质量检测
用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测提取总 RNA 的完整性(电压 150 V, 时长 15 min)，用超微量紫外分光光
度计检测 RNA OD260 /OD280 值和浓度。完整性检测方法：Agilent 2100 (Agilent Technologies, USA)芯片分
析仪自动计算。
作者贡献
张树伟是本研究的实验设计和实验研究的执行人；张树伟和丁峰完成数据分析，论文初稿的写作；黄
羽参与实验设计、实验结果分析；卢江和彭宏祥是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析以及
论文的写作和修改；全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由广西农业科学院博士后基金项目 (桂农科博 2014022)、广西自然科学基金项目
(2015GXNSFBA139099)、中国博士后科学基金项目(2015M582745XB)、广西作物遗传改良生物技术重点开
放实验室建设项目开放课题(15-140-33-1)、国家科技支撑计划课题(2014BAD16B05)和广西农科院园艺所科
技基金(001001026)共同资助。
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