全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (6): 565~570 565
收稿 2012-02-27　　修定 2012-04-05
资助 山东省农业良种工程(2011LZ-005-03)、转基因生物新品
种培育重大专项(2011ZX08005-003-04)和农业科技成果转
化专项(2011GB2C600005)。
* 通讯作者(E-mail: scrcwlm@saas.ac.cn; Tel: 0531-83179424)。
陆地棉HB红花性状特异SCAR分子标记的开发
赵军胜, 陈莹, 高明伟, 王家宝, 王秀丽, 杨静, 王留明*
山东省农业科学院棉花研究中心, 济南250100
摘要: 利用Operon系列引物筛选到1个与HB红花性状基因连锁的RAPD标记OPA15-1160, 对差异条带进行克隆与核苷酸测序,
根据测序结果设计SCAR引物, 在HB红花近等基因系及其白花轮回亲本中进行PCR扩增程序优化和鉴定, 筛选出一对引物
可稳定扩增出与HB红花性状基因连锁的特异片段, 获得了与HB红花性状基因紧密连锁的SCAR标记HB-330。利用具黄色
花瓣紫红色基斑的海岛棉与粉红花瓣的红叶棉等种质材料以及HB红花近等基因系与白花轮回亲本杂交的F1、BC1F1、F2
群体, 对该SCAR标记的特异性与准确性进行了鉴定与验证, 在红花植株中扩增出了330 bp大小的片段而在白花植株中未
扩增出, 证明该标记准确性高、重复性好。HB红花是通过远缘杂交转自野生二倍体比克氏棉的性状, 已成功地应用于性
状标记杂交棉育种。该SCAR标记不仅为HB红花标记杂交种的纯度鉴定提供了有效技术手段, 也为新品种保护提供了技
术支持, 促进了红花性状杂交种的分子标记辅助育种进程。
关键词: 棉花; HB红花; 标记性状; SCAR标记
Development of a SCAR Marker Linked to HB Red-Corolla Gene in Cotton
ZHAO Jun-Sheng, CHEN Ying, GAO Ming-Wei, WANG Jia-Bao, WANG Xiu-Li, YANG Jing, WANG Liu-Ming*
Cotton Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China
Abstract: In this study, a RAPD marker (OPA15-1160) was screened from the Operon RAPD primers, which
showed linkage relation with HB red-corolla gene. The specific amplified fragment was extracted and purified
for sequencing. According to the sequence, specific primers of sequence characterized amplified region (SCAR)
were designed and screened. The SCAR primers were amplified in island cotton (with yellow petals and purple
base spot), red leaf cotton (with pink petals), HB red-corolla near-isogenic lines and recurrent parent with white
corolla as well as their hybrid F1, BC1F1, F2 populations. There was a specific fragment about 330 bp in red-corolla
plants and no PCR amplification in white corolla plants, which proved that the HB-330 was a specific SCAR marker
of HB red-corolla traits with high accuracy and repeatability. The HB red-corolla trait was transferred from the
wild diploid Gossypium bickii via distant hybridization, and this trait has been successfully applied to hybrid cot-
ton breeding. Development of this SCAR marker provides an effective technical method of protecting HB red-co-
rolla cotton varieties and germplasm sources and identifying quality of hybrid cotton seeds. This SCAR marker
accelerates the process of marker-assisted selection for breeding of hybrid cotton with HB red-corolla trait.
Key words: cotton; HB red-corolla; marker trait; SCAR marker
比克氏棉(Gossypium bickii)是野生二倍体棉
种, 花瓣粉红色, 具大基斑, 具有许多独特的优良农
艺性状, 如抗旱、抗黄萎病、抗棉蚜及红蜘蛛等
(梁正兰等1996; 何鉴星等2000)。本课题组利用陆
地棉(Gossypium hirstum)与比克氏棉进行远缘杂交
后选育出的HB (hirstum-bickii)红花系, 转育成功了
一批综合性状良好的陆地棉HB近等基因系, 丰富
了棉花育种资源库(高明伟等2008), 该红花性状在
标记杂交棉育种中具有重要应用价值(Birchler等
2003; Wang和Wang 2008)。研究发现转自野生二
倍体比克氏棉的基因渐渗对陆地棉杂种优势有一
定的正向影响(赵军胜等2011), 并筛选出多个HB
红花标记品种间杂交新组合参加国家或山东省区
域试验。其中‘鲁HB标杂-1’、‘鲁05H9’两个HB红
花标记杂交棉新品种于2010年通过国家审定, 由
于其独特的HB红花性状标记和优良的农艺性状而
迅速在农业生产中推广应用。对HB红花性状的鉴
定主要是在田间的开花期, 时间偏晚且费时费工。
为了对其提供更加完善和便捷的技术支持和品种
植物生理学报566
保护, 需要开发在棉花生长发育早期进行的快速
简便的鉴定手段(纪家华等2005; 高明伟等2008)。
随着分子生物学技术的发展, 以DNA为基础
的PCR (聚合酶链式反应)方法目前已应用于农作
物品种鉴定与纯度鉴定。RAPD (random amplified
polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA技术,
具有简便、快速的特点, 被广泛应用于各种作物
的分子标记研究(Williams等1990; Li等2005; Rana
等2011; Khan等2011)。但由于其随机引物序列较
短, PCR扩增产物的重复性不理想。SCAR (se-
quence characterized amplified region)序列特定扩
增区域标记, 是一种可靠、稳定、可长期利用的
标记技术, SCAR标记基于常规PCR反应且扩增区
域为特定位点, 稳定性好、重复性高(徐安毕和王
文泉2007; 赵兴华等2011; 温志强等2011)。本文报
道将筛选出的与HB红花性状基因紧密连锁的
RAPD标记转换成SCAR标记, 为特异性鉴定HB红
花种质、有效弥补对现有性状标记材料及品种保
护工作的不足, 并为种子纯度快速鉴定提供高效
准确的分子标记。
材料与方法
1 材料
陆地棉(Gossypium hirstum L.)品系HB118、
HB16、HB22、HB28红花近等基因系及其白花轮
回亲本SCRC118、SCRC16、SCRC22、SCRC28,
红花近等基因系与白花轮回亲本杂交F1、BC1F1、
F2群体, 红花标记杂交棉新品种‘鲁05H9’, 海岛棉
(Gossypium barbadense L.)品系S6662 (花瓣黄色,
紫红色基斑), 红叶棉(花瓣粉红色, 无基斑), HB红
花夏棉品系。实验所用材料均为本课题组培育或
引进, 种植于山东棉花研究中心临清试验站。
2 方法
2.1 棉花叶片DNA的提取
采用简化的CTAB法提取: 预热CTAB提取液
(NaCl 1.4 mol·L-1、2% CTAB、Tris·Cl 100 mmol·L-1、
EDTA 20 mmol·L-1、0.2%巯基乙醇)至65 ℃, 取叶
片200~300 mg, 液氮研磨成粉末后迅速转移至预
冻的1.5 mL Eppendorf管中, 加入适量CTAB提取液
混匀(600~750 µL, 叶片与提取液比例为1:2.5~3.0),
65 ℃水浴1~2 h; 冷却至室温后加入等体积的氯仿/
异戊醇(24:1), 颠倒混合, 室温放置20 min, 12 000
r·min-1离心15 min, 吸取上清; 加入等体积氯仿/异
戊醇, 颠倒混合, 12 000 r·min-1离心15 min, 吸取上
清; 加入0.8~1倍体积预冷的异丙醇, 颠倒混匀, 形
成絮状沉淀; 70%乙醇洗涤DNA后真空浓缩干燥;
加入适量TE缓冲液或超纯水溶解DNA备用。
2.2 RAPD标记的筛选
以HB红花近等基因系和白花轮回亲本DNA
为模板 , 利用Operon公司(美国)系列引物进行
RAPD扩增, 筛选与HB红花性状基因紧密连锁的
RAPD标记。RAPD反应体系为1×PCR Buffer, 1.5
mmol·L-1 MgCl2、200 µmol·L
-1 dNTP, 1.2 µL引物
(10mer Operon primer), 0.5 U Taq酶、50~200 ng模
板, 反应体积20 µL。PCR程序为: 94 ℃预变性5
min; 94 ℃变性30 s, 36 ℃复性45 s, 72 ℃延伸1
min, 45个循环; 72 ℃延伸7 min; 10 ℃保存。扩增
产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳, 经EB染色后在
紫外光下进行观察照相。
2.3 RAPD产物的回收、克隆、鉴定和测序
利用DNA纯化回收试剂盒(TIANGEN公司)从
琼脂糖凝胶中回收、纯化与HB红花性状基因连锁
的RAPD差异条带。按照以下体系进行连接反应:
回收片段30~40 ng, pBS-T II载体(TIANGEN公司)
40 ng, 2×T4 DNA ligation buffer 5 µL, ddH2O补齐
至10 µL, 22~26 ℃连接反应5~10 min。连接产物
热激法转化大肠杆菌(E. coli) DH5α感受态细胞, 涂
布在含100 µg·mL-1氨苄青霉素、16 µL IPTG (50
mg·mL-1)、40 µL X-gal (20 mg·mL-1)的LB平板培
养基上, 37 ℃培养, 筛选蓝白斑。利用M13引物进
行阳性克隆的菌体PCR鉴定, 反应体系为1×PCR
Buffer, 1.5 mmol·L-1 MgCl2、200 µmol·L
-1 dNTP, 1.2
µL引物(10 µmol·L-1), 0.5 U Taq酶, 反应体积20
µL。PCR反应条件如下: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃
40 s, 50 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 35个循环; 72 ℃延
伸10 min; 10 ℃保存。PCR产物用1.0%琼脂糖凝
胶电泳鉴定。选择阳性克隆进行振荡培养后提取
质粒DNA, 进行EcoRI酶切鉴定插入片段, 最终鉴
定的阳性克隆委托上海博亚公司进行测序。
2.4 SCAR引物的设计和PCR鉴定
根据差异条带的序列信息, 利用Primer 5.0软
件设计长度在18~24 bp的正、反向引物, 以HB红
赵军胜等: 陆地棉HB红花性状特异SCAR分子标记的开发 567
花近等基因系和白花轮回亲本为模板, 进行PCR反
应条件优化, 然后在红花近等基因系与白花轮回
亲本杂交F1、BC1F1、F2群体以及海岛棉、红叶棉
等材料中进行验证。
实验结果
1 引物筛选
利用RAPD分子标记分别对红花近等基因系
HB22、HB16及其白花轮回亲本SCRC22、SCRC16
以及红花近等基因系与白花轮回亲本杂交F1的混
合DNA模板进行RAPD引物初步筛选, 在150个
RAPD引物中确定了OPA15能够扩增出与HB红花
性状密切相关的差异扩增条带(图1)。在HB红花
近等基因系和白花轮回亲本的F1、BC1F1和F2群体
中利用该RAPD标记鉴定与田间花色验证结果关
联比对, 发现该引物差异扩增条带与HB红花性状
密切相关。
图1 利用引物OPA15进行RAPD扩增的结果
Fig.1 The result of random amplification with primer OPA15
1: HB22; 2: (HB22×SCRC22) F1; 3: SCRC22; 4: HB16; 5:
(HB16×SCRC16) F1; 6: SCRC16; M: 分子量标准; 箭头所示为差异
谱带。
图2 pBS-T II重组子PCR鉴定
Fig.2 PCR assay of pBS-T II plasmid
1、2: 不同阳性克隆; M: 分子量标准; 箭头所示为目标条带。
设计5对特异SCAR引物, 引物序列信息如表1所
示。
利用这5对SCAR引物对HB红花近等基因系
和白花轮回亲本进行PCR扩增程序优化和鉴定, 经
多次重复验证 , 可以利用其中一对SCAR引物
(HB3-3)扩增出与HB红花性状基因连锁的特异片
段(330 bp) (图4), 即与HB红花性状基因连锁的
2 特异片段的回收、克隆及测序
回收与HB红花性状连锁的特异扩增条带, 克
隆到pBS-T II载体并转化DH5α感受态细胞。通过
M13引物进行阳性克隆的菌体PCR鉴定(图2), 选择
阳性克隆进行振荡培养后提取质粒DNA, EcoRI酶
切鉴定插入片段(图3), 最终鉴定的阳性克隆委托
上海博亚公司进行测序。
3 SCAR引物的设计和PCR反应条件的优化
根据特异片段测序结果, 利用Primer 5.0软件
图3 pBS-T II重组子酶切鉴定
Fig.3 pBS-T II plasmid digested by EcoRI
1、2: 不同阳性克隆; M: 分子量标准; 箭头所示为目标条带。
植物生理学报568
SCAR标记。优化后的PCR扩增反应体系为20 µL,
其中含基因组DNA 50~200 ng, 10×PCR Buffer (含
20 mmol·L-1 MgSO4) 2 µL, 200 µmol·L
-1 dNTP, 0.3
µmol·L-1引物PF, 0.3 µmol·L-1引物PR, 0.5 U Taq
酶。PCR扩增程序为: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 55
℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃ 10 min; 扩
增产物经1×TAE琼脂糖凝胶电泳, 利用凝胶成像仪
观察并拍照。凡是扩增出330 bp大小谱带的鉴定
为来源于陆地棉HB红花种质材料, 而未扩增出330
bp谱带的鉴定为非陆地棉HB红花种质材料。
4 SCAR引物的验证与应用
用HB3-3引物检测HB22与SCRC22杂交后代
F2以及HB16与SCRC16杂交后代F2的单株群体进
行了鉴定与花色验证 , 结果表明SCAR标记和
RAPD标记的连锁性完全一致, 红花单株都扩增出
一条330 bp的片段, 而白花单株都未扩增出任何条
带(图5、6), 这样就顺利地将RAPD标记转化成重
复性好的SCAR标记。
表1 SCAR引物序列信息
Table 1 The SCAR primer sequences
编号 上游引物序列 下游引物序列
HB2-1 5-GAGAAGACCCAAACCAGA-3 5-ACAGCACGGAGTAAGACG-3
HB2-2 5-AGACCCAAACCAGAAAGT-3 5-ACAGCACGGAGTAAGACG-3
HB3-3 5-GCCGAAACTTCCCATCTC-3 5-CACCAAAGCGAACTAACG-3
HB4-3 5-ACCCAAACCAGAAAGTAA-3 5-ACAGCACGGAGTAAGACG-3
HB4-4 5-ACAGCCTTGAGTTGAGC-3 5-CATTTAGGGTTTGGATT-3
图4 HB118、HB28红花近等基因系及其白花轮回亲本SCRC118、SCRC28的SCAR标记验证
Fig.4 The amplified profiles by the SCAR primer in red corolla near isogenic lines HB118, HB28 and their recurrent parents
SCRC118, SCRC28
1~4: HB118系不同红花品系单株; 5: SCRC118白花单株混合; 6~13: HB28系不同红花品系单株; 14: SCRC28白花单株混合; NC: 阴性
PCR对照; M: 分子量标准; 箭头所示为目标谱带, 约330 bp。
图5 HB22与SCRC22杂交后代F2的单株群体的SCAR标记验证
Fig.5 The amplified profiles by the SCAR primer in individuals of F2 progeny of HB22×SCRC22
1、4~6、9~16: 红花单株; 2、3、7、8: 白花单株; NC: 阴性PCR对照; M: 分子量标准; 箭头所示为HB红花性状的特异性谱带, 约330 bp。
图6 HB16与SCRC16杂交后代F2的单株群体的SCAR标记验证
Fig.6 The amplified profiles by the SCAR primer in individuals of F2 progeny of HB16×SCRC16
2、4~7、9~11、13、14: 红花单株; 1、3、8、12: 白花单株; NC: 阴性PCR对照; M: 分子量标准; 箭头所示为HB红花性状的特异性谱
带, 约330 bp。
赵军胜等: 陆地棉HB红花性状特异SCAR分子标记的开发 569
利用HB3-3引物在红花基斑分离材料、海岛
棉、红叶棉、HB红花夏棉等种质材料中针对红花
性状进行了鉴定与验证(图7), 证明该SCAR标记只
对HB红花性状有特异性, 且准确性高、重复性好。
在HB红花标记杂交棉品种‘鲁05H9’的F1代幼
苗中随机取样, 利用HB3-3引物针对红花性状进行
了纯度鉴定(图8), 结果与田间调查完全一致, 且同
时证明了该批杂交种子纯度较高。
讨　　论
由于RAPD标记的稳定性及重复性较差, 将
RAPD标记转换成稳定性和重复性好的SCAR标
记 , 可提高扩增反应的特异性和稳定性。目前
SCAR标记已在棉花、小麦、玉米、花生、大
豆、番茄等作物的遗传育种中广泛应用(陈其军等
2001; 雷永等2006; 赵晓彦等2007; 丁国华等2007;
孟凡娟等2008; 刘慧民等2009; 李瑞莲等2011; 贾
举庆等2010; 史利玉等2011)。本研究把HB红花基
因的RAPD标记转换成SCAR标记, 通过特异的
PCR扩增反应进行鉴定, 既保持了原RAPD分子标
记的鉴别功能, 又有了常规PCR稳定可靠的特点。
该SCAR标记也是国内首次报道的与陆地棉
HB红花标记性状连锁的标记, 在应用上具有迅
速、简便、低成本的特点 , 在分子标记辅助育
种、种质资源鉴别等方面有着巨大的应用前景。
利用该SCAR标记通过PCR方法进行快速鉴定HB
红花种质, 准确性高、结果稳定、不受环境条件
和发育时期的影响, 可以有效地对陆地棉HB红花
来源的品种和种质资源进行保护, 为HB红花性状
标记杂交棉的种子质量鉴定提供技术手段。同时
有助于在早期对育种材料进行选择, 提高选择效
率, 为HB红花性状标记杂交棉育种开辟一条新的
途径。
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图7 不同花色性状种质材料的SCAR标记验证
Fig.7 The amplified profiles by the SCAR primer in cotton materials of different corolla color traits
1: 红花无基斑材料; 2: 红花深基斑材料; 3: 红花带基斑材料; 4: 红花浅基斑材料; 5: 红花标记杂交种‘鲁05H9’的白花母本; 6: 红花标记
杂交种‘鲁05H9’F1代; 7: 红花标记杂交种‘鲁05H9’的红花父本; 8: 夏棉红花材料RX2; 9: 夏棉白花材料RX1; 10: 红叶材料R1176; 11、12: 海
岛棉S6662; M: 分子量标准; 箭头所示为HB红花性状的特异性谱带, 约330 bp。
图8 ‘鲁05H9’不同单株的SCAR标记验证
Fig.8 The amplified profiles by the SCAR primer in individuals of SCRC 05H9
1~15: 红花标记杂交种‘鲁05H9’F1代; NC: 阴性PCR对照; M: 分子量标准。
植物生理学报570
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