全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 8期, 2010年 8月 779
巴戟天离体苗不定根发育的观察
林美珍 1, 郑松 2, 邓炜 2, 田惠桥 2,*
1漳州卫生职业学院药学系, 福建漳州 363000; 2厦门大学生命科学学院, 福建厦门 361005
提要: 以巴戟天幼嫩种子中的胚为外植体进行组织培养诱导出愈伤组织, 继而诱导分化出芽, 长成小苗。将小苗转入生根
培养基中, 从茎基部诱导出不定根, 再生植株。对离体苗的不定根发育进行结构观察, 发现巴戟天组培苗的不定根是由形
成层细胞先分裂分化形成根原基后发育而成的。
关键词: 巴戟天; 组织培养; 不定根
Observation on the Development of in vitro Adventitious Roots of Morinda
officinalis How.
LIN Mei-Zhen1, ZHENG Song2, DENG Wei2, TIAN Hui-Qiao2,*
1Department of Pharmacy, Zhangzhou Health Vocational College, Zhangzhou, Fujian 363000, China; 2School of Life Sciences,
Xiamen University, Xiamen, Fujian 361005, China
Abstract: Callus was induced from immature embryo of Morinda officinalis and then buds were induced from
the callus. When the buds grew up, the stems were transplanted in a rooting medium to induce adventitious
roots. The generation and the growth of adventitious roots were observed with paraffin method. The in vitro
adventitious roots came from the cambial cells in culture.
Key words: Morinda officinalis; tissue culture; adventitious root
收稿 2010-02-02 修定 　2010-04-13
资助 福建省卫生厅医学创新课题(09-CXB-43)和福建省漳州
市科技局课题(Z20 0 8 0 38 )。
* 通讯作者(E-mai l : hqt ia n@xmu.edu .cn; T el : 0 5 92 -
2 1 8 6 4 8 6 )。
巴戟天是茜草科(Rubiaceae)巴戟天属多年生
攀援性木质藤本, 别名巴戟、巴吉、鸡肠风, 以
肉质根入药, 和槟榔、益智、砂仁并称为我国四
大南药, 具有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿、增强
免疫系统、抗衰老和抗肿瘤等功效(中华人民共和
国药典委员会 2010)。巴戟天现已人工大面积种
植, 主要采用扦插繁殖和种子繁殖, 以产生根多、
根粗、成活率高为佳(林美珍和陈伟绩 2009)。对
巴戟天组织培养的研究目前仅有以芽为外植体诱导
再生植株的报道(吴昭平等 1985; 黄宁珍等 2007)。
不同的植物由于内部结构的差异, 再生苗离体根发
生的方式不同。本研究以巴戟天幼胚为外植体, 诱
导愈伤组织, 再分化出苗和根, 建立巴戟天的离体
实验体系。在此基础上, 对巴戟天组培苗不定根的
发育进行显微观察, 探索巴戟天不定根的发生和发
育规律, 为巴戟天的无性繁殖提供理论依据。
材料与方法
实验材料取自福建省漳州南靖县聚善堂中药
材基地种植的巴戟天(Morinda officinalis How.)幼
嫩种子中的胚。8月中旬摘取巴戟天幼嫩的果实,
先用自来水冲洗5 min, 再用洗衣粉水轻洗果实, 而
后再用自来水冲洗 3次。洗干净的果实在超净台
上用70%酒精消毒30~60 s, 0.1% HgCl2浸泡10~15
min, 无菌水冲洗 5次。将灭菌的果实放在无菌滤
纸上, 吸干水分后, 用无菌解剖刀切开果实, 挑出杆
状的幼胚。通常 1个果实中含有 4个幼胚。将幼
胚接种到含不同浓度 2,4-D和 6-BA的MS愈伤组
织诱导培养基中, 暗培养 4~6周。将长出的愈伤组
织转移到含不同浓度6-BA和NAA的MS分化培养
基中光照培养。6~8周后, 愈伤组织分化出芽。将
1~3 cm的茎苗转入到含 1/2MS+1.0 mg·L-1 IBA的
生根培养基中光照培养。外植体接种数均为 50
个。上述培养基均加 30 g·L-1蔗糖、6.5 g·L-1琼
脂粉, pH 5.8; 培养温度为(25±1) ℃, 每天光照16 h,
光强为 30 μmol·m-2·s-1。
茎苗在生根培养基中生长3 d后每隔1 d 取样
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1 次, 剪取 0.5~0.7 cm茎段, 放入卡诺固定液中固
定 24 h, 用 80% 和 60%酒精各换洗 1次, 之后用爱
氏苏木精染色 3 d。染色后的茎段先用蒸馏水冲洗
1 d, 再用自来水换洗 1 d, 然后脱水和石蜡包埋。
包埋茎段切成10 μm的切片, 脱蜡后封片, 用Leica-
DML显微镜观察并照相。
结果与讨论
1 巴戟天愈伤组织诱导
用幼胚为外植体有其优点: 第一, 幼胚在果皮
的包被下处于无菌状态; 第二, 消毒液只对果实进
行消毒, 对幼胚基本没有伤害; 第三, 由幼胚产生的
愈伤组织较容易分化出苗。
若将幼胚接种在含0.2~3.0 mg·L-1 6-BA的培养
基上进行光照培养, 4周后, 幼胚都可发育成再生
苗, 再生率达到 100%。其中在 1.0 mg·L-1 6-BA+0.2
mg·L-1 NAA的培养基中, 可长出 3~5 个健壮的再生
苗, 若培养时间延长, 还可以分化出更多的新生苗。
若将幼胚接种在含有2,4-D的培养基上进行暗
培养(图1-A), 4~6周后部分幼胚长出黄色的愈伤组
织(图 1-B), 其中在附加 2.0 mg·L-1 2,4-D和 0.5 mg·L-1
6-BA的培养基中愈伤组织的诱导率最高, 达74%。
过高或过低2, 4-D都会降低愈伤组织的诱导率。在
含2,4-D的基础上, 加入低浓度的6-BA可使愈伤组
织的诱导率提高。而不含 2,4-D的培养基则无法
诱导出愈伤组织(表 1)。
图 1 巴戟天离体不定根的发生
Fig.1 Development of in vitro adventitious roots of Morinda officinalis
A: 刚接种的巴戟天幼胚; B: 以幼胚为外植体诱导产生的愈伤组织; C: 愈伤组织分化出茎苗; D: 茎苗再生出不定根; E: 组培苗茎
段横切解剖结构, 在皮层和髓之间有一环形维管组织, ×70; F: 环状维管束的内部为较厚细胞壁的木质部, 外部为韧皮部(星印处为木质
部), ×140; G: 茎苗培养 3 d时的不定根原基(箭头示形成层; 星印处为木质部), ×280; H: 茎段的纵切, 示根原基的基部为茎的导管(星印
处), ×280; I: 较大不定根原基的顶端仍保持分生细胞状态, 基部的细胞逐渐分化(星印处为茎木质部), ×140; J: 同一部位形成 2个不定
根原基, ×140; K: 不定根突出皮层和表皮, ×70; L: 不定根内部已分化出的维管组织与茎维管组织相连, 左边竖向排列的 3个星印为茎
木质部, 右边 2 个星印为不定根的导管, ×280。
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2 巴戟天愈伤组织的分化
将在含有 2.0 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA的
MS培养基中诱导的愈伤组织转到只含 6-BA的培
养基上进行光照培养, 诱导愈伤组织分化。6~8周
后, 部分愈伤组织分化出芽(图 1-C)。其中附加 1.0
mg·L-1 6-BA的培养基中愈伤组织的分化率最高, 达
34.4%。过高或过低的 6-BA都会降低愈伤组织的
分化率。在培养基中添加 NAA后, 诱导的效果反
而下降; 而不含6-BA的培养基则无法诱导愈伤组织
分化(表 2)。
3 巴戟天生根与移栽
将 1~3 cm 的巴戟天组培苗转移到含 1.0 mg·L-1
IBA的 1/2MS生根培养基中培养, 接种 10 d 后, 从幼
苗基部长出白色的不定根, 继而长成完整的根系(图
1-D)。巴戟天组培苗比较容易生根, 生根率可达
95%以上。每苗生根3~7条。当不定根长到3~5 cm,
打开瓶盖, 室温炼苗1周, 取出试管苗, 洗净其根部培
养基, 移栽到蛭石混合土中, 再生植株很容易成活。
4 巴戟天组培苗茎的横切面结构
取巴戟天组培苗的嫩茎做石蜡切片, 观察其组
织结构, 从外到内分别是表皮、皮层、韧皮部、
木质部和髓。表皮由一层近长方体细胞组成, 细胞
相对较小, 扁平, 排列整齐而紧密, 表皮细胞向外突
起形成表皮毛。皮层由多层类球状的薄壁细胞构
成, 细胞向心方向的体积逐渐增大, 排列疏松而不
规则。皮层薄壁细胞细胞质较稀。维管组织中的
韧皮部和木质部区分不明显。髓占茎横切面较大
的比例, 细胞形态与皮层细胞相似。巴戟天组培苗
的茎中维管组织在横切面上呈环状, 难以区分出髓
射线结构, 也没有根原基(图 1-E)。放大后可看到,
细胞壁较厚的导管分布在维管组织的内侧, 体积较
小, 细胞质浓的韧皮部细胞分布在维管组织的外侧
(图 1-F)。
5 巴戟天不定根的发生
将接种在生根培养基上3 d的茎基部做横切片
观察, 可看到不定根原基已在茎的形成层处形成。
这些根原基细胞进行平周分裂和垂周分裂, 形成一
个分生细胞团。这些细胞与周围的薄壁细胞相比,
细胞呈等径多边形, 细胞较小, 细胞核大, 细胞质
浓, 排列紧密并向皮层组织突起, 形成根原基轮廓
表 1 植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effect of plant growth regulators on the callus induction
培养基成分 愈伤组织数 /个 诱导率 / %
MS 0 0
MS+0.5 mg·L-1 2,4-D 1 0 2 0
MS+1.0 mg·L-1 2,4-D 2 6 5 2
MS+2.0 mg·L-1 2,4-D 3 1 6 2
MS+2.0 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-1 6-BA 3 5 7 0
MS+2.0 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA 3 7 7 4
MS+5.0 mg·L-1 2,4-D 2 4 4 8
表 2 植物生长调节剂对愈伤组织分化的影响
Table 2 Effect of plant growth regulators on the callus differentiation
培养基成分 愈伤组织数 /个 茎苗数 /个 分化率 / %
MS 3 0 0 0
MS+0.5 mg·L-1 6-BA 3 0 5 16.7
MS+1.0 mg·L-1 6-BA 3 2 1 1 34.4
MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA 3 2 9 28.1
MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA 3 2 6 18.8
MS+2.0 mg·L-1 6-BA 3 1 8 25.8
MS+3.0 mg·L-1 6-BA 3 0 6 20.0
MS+5.0 mg·L-1 6-BA 2 1 2 9.5
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(图 1-G)。在根原基的基部, 是几层扁平细胞。从
茎的纵切面上可看到不定根原基止于导管处(图1-
H)。由此推测, 巴戟天组培苗的不定根发生于形成
层细胞。
6 巴戟天不定根的发育
不定根原基细胞继续分裂, 根的细胞数目和体
积不断增加, 根尖一边伸入皮层一边开始分化: 最
前端的一列细胞成为根冠细胞, 包围根尖分生区; 其
后为分生区, 该部位的细胞具有典型的分生组织细
胞学特征, 是不定根的生长点; 中后部的细胞质变
淡, 染色较浅, 细胞体积较大, 沿根原基纵轴方向延
长。这些细胞将逐渐分化出维管组织并与茎中的
维管组织相连(图 1-I)。有时, 在茎的同一个部位
可形成 2个大小类似的根原基(图 1-J)。随着不定
根原基继续伸长, 最后突破茎的皮层和表皮(图 1-
K)。此后, 不定根内部的组织分化更加明显: 根原
基前部细胞继续分裂, 形成生长点和根冠; 中部细
胞的体积扩大, 细胞沿根原基长轴方向伸长, 逐渐
形成伸长区; 不定根基部细胞分化出维管分子, 中
央出现导管(主要为螺纹导管和环纹导管)并与母体
维管系统的导管相连(图 1-L)。因此, 在不定根突
出皮层和表皮时, 其内部的维管组织已和与茎中的
维管系统连通。
以巴戟天带芽茎段为外植体的组织培养已有
报道(吴昭平等 1985; 黄宁珍等 2007)。但这种组
织培养结果只能达到快速繁殖的目的。另外, 从野
外采集的茎段外植体, 其表面有茸毛, 易附着菌类
和病毒, 不易彻底消毒, 外质体的染菌率高。通过
诱导愈伤组织、再生植株的实验技术可为进一步
的基因工程和细胞工程研究奠定基础, 也可通过愈
伤组织培养过程消除病毒, 获得无病毒苗。以巴戟
天种子的幼胚为外植体, 由于其被果皮包裹, 易消
毒, 因而染菌率低。另外, 幼胚基本为分生组织,
细胞的分生能力强, 诱导愈伤组织较容易。而由幼
胚产生的愈伤组织也比较容易分化。因此幼胚是
巴戟天进行组织培养较好的外质体。
除了外植体外, 植物激素和生长调节剂也是影
响巴戟天愈伤组织诱导、分化及植株再生的主要
因素。在无植物激素的MS培养基上, 不能从幼胚
诱导出愈伤组织。一定浓度的 2,4-D能促进巴戟
天幼胚产生愈伤组织, 以 2.0 mg·L-1 2,4-D+MS效
果较好(表1)。6-BA能有效诱导巴戟天愈伤组织的
分化, 以1.0 mg·L-1 6-BA+MS最为适合。附加NAA
反而显示抑制了愈伤组织的分化(表 2)。
不定根原基按其形成时间分为潜伏根原基和
诱导根原基。潜伏根原基是在植株发育早期产生,
然后处于休眠状态, 直到在适宜环境条件下才继续
发育形成不定根; 诱导根原基是在外植体接种到生
根培养基后才形成的根原基。在我们的试验中, 没
有发现潜伏的根原基, 说明巴戟天不定根属于诱导
根原基型。植物不定根发生的部位较复杂, 维管射
线细胞、韧皮薄壁细胞、形成层细胞、皮层细
胞、髓射线细胞等均可能形成不定根(Ginzburg
1967; 王清民等 2006; 李校雨等 2009)。巴戟天属
多年生的藤本植物, 其内部结构比较特殊, 维管组
织没有束状结构, 而呈环状, 木质部在内侧, 韧皮部
在外侧。通过木质部和韧皮部之间形成层细胞
的有限分裂使茎缓慢加粗生长(林美珍和陈伟绩
2009)。在本试验中, 由巴戟天离体茎很容易形成
不定根。通过切片发现: 在培养 3 d时就有不定根
原基产生, 其发生可能源于形成层细胞。另外, 有
2个不定根原基紧密相挨, 一并生长的现象, 也说明
巴戟天组培苗的根原基很可能起源于形成层细胞,
属于不定点发生。巴戟天组培苗容易产生不定根
与巴戟天茎中具有形成层的特征有关, 形成层细胞
的分化程度低, 在培养诱导条件下容易恢复分生能
力形成根原基。因此, 巴戟天组培苗的不定根发生
早, 频率高与其特殊结构密切相关。
参考文献
中华人民共和国药典委员会(2010). 中华人民共和国药典(一部).
北京: 中国医药科技出版社, 75~76
黄宁珍, 付传明, 赵志国, 唐凤鸾, 李锋(2007). 巴戟天组织培养和
快速繁殖研究. 广西植物, 27 (1): 127~131
李校雨, 吕成群, 黄宝灵, 吴庆梅, 张明环(2009).马尾松组培苗不
定根诱导及不定根解剖观察. 西北林学院学报, 24 (3): 80~84
林美珍, 陈伟绩(2009). 巴戟天的生物学特性和繁殖方式对其品
质的影响. 亚热带农业研究, 5 (1): 22~25
王清民, 彭伟秀, 吕保聚, 裴东(2006). 核桃试管不定根的组织学
研究. 西北植物学报, 26 (4): 719~724
吴昭平, 黄子复, 卢丽芬(1985). 巴戟天芽体培养. 植物生理学通
讯, (3): 31~32
Ginzburg C (1967). Organization of the adventitious root apex in
Tamarix aphylla. Am J Bot, 54: 4~8