全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月 775
收稿 2009-04-27 修定 　2009-06-19
资助 黑龙江省重点科技攻关项目(GB06B303-5)。
* 通讯作者(E-mail : 634 7284 07@qq.com; Tel : 04 51-
8 2 1 9 0 6 0 7 )。
用AFLP标记构建白桦遗传连锁图谱
吕澈妍, 周博如, 王雷, 吴丽丽, 姜廷波 *
东北林业大学, 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 用AFLP的方法分析中国白桦×欧洲白桦的78个F1个体, 并按照拟测交作图策略, 建立了中国白桦和欧洲白桦遗传
连锁图谱。从群体的 45对引物组合中分离出 343个分离位点, χ2检验表明, 其中有 311个符合 1:1拟测交分离位点。在这
些位点中 168个来自中国白桦, 143个来自欧洲白桦。软件分析表明, 中国白桦的 168个位点构成 9个连锁群, 11个三联体
和14个连锁对, 55个为非连锁位点, 连锁标记覆盖的总距离为1 909.2 cM, 平均图距为16.9 cM; 来自欧洲白桦的143个位点
构成 12个连锁群, 4个三联体和 9个连锁对, 21个为非连锁位点, 连锁标记覆盖的总距离为 1 857.3 cM, 平均图距为 15.2
cM。
关键词: AFLP; 遗传连锁图谱; 中国白桦; 欧洲白桦
Construction of Genetic Linkage Maps of Silver Birch Based on AFLP Markers
LÜ Che-Yan, ZHOU Bo-Ru, WANG Lei, WU Li-Li, JIANG Ting-Bo*
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University,
Harbin 150040, China
Abstract: Based on the inheritance and segregation of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers,
the first middensity linkage map for silver birch was constructed by using a pseudotestcross mapping strategy.
A segregating population including 78 progenies from the cross between Betula platyphylla and B. pendula was
obtained. 45 primer pair combinations were selected to generate AFLP markers within a sample of 78 F1 prog-
enies and 343 segregating sites were identified. Among the identified sites, 311 segregating sites belonged to 1:1
segregating site including 143 sites for B. pendula and 168 sites for B. platyphylla. The resulting linkage maps
were consisted of 168 marker sites in 9 groups, 11 triples, 14 pairs and 55 mon-linkage sites for B. platyphylla,
which covered the map distance about 1 909.2 cM (Kosambi units). The average map distance between adja-
cent markers was 16.9 cM. 143 linked marker-sites of B. pendula were mapped onto 12 groups, 4 triples, 9
pairs and 21 mon-linkage sites, which covered the map distance about 1 857.3 cM. The average map distance
between adjacent markers was 15.2 cM.
Key words: amplified fragment length polymorphism (AFLP); genetic linkage map; Betula pendula Roth; Betula
platyphylla Suk
扩增的限制性内切酶片段长度的多态性标记
(amplified fragment length ploymorphism, AFLP)是
20世纪 90年代发展起来的一种分子标记技术, 它
是限制性片段长度多态性(restriction fragment length
ploymorphism, RFLP)和随机扩增多态性 DNA
(random amplified polymorphic DNA, RAPD)两项技
术的结合, 它综合了这两个标记的优点, 方便、快
捷、稳定而可靠(张镝和丁毅 2007; Liang等 2007),
而且DNA的用量少, 稳定性高, 重复性好, 多态性
丰富(王婷等 2008)。这项技术已在许多领域中广
泛应用, 如农作物品种鉴定、基因定位和遗传连锁
图谱的构建等。AFLP技术在多种植物的研究中,
如美洲黑杨(Wu等2000)和火炬松(Remington 1999)
中也有应用, 但用于树木中白桦研究的报道还比较
少。因此我们用此技术初步分析和构建了白桦的
遗传连锁图谱。
材料与方法
母本为中国白桦(Betula platyphylla Suk), 来自
中国帽儿山种源, 父本为欧洲白桦(Betula pendula
Roth), 来自芬兰种源。两个亲本的选择和人工授
粉在本校白桦强化育种园内进行。RAPD标记检
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测表明, 两亲本间存在较高的遗传多态性。2005
年4月中旬控制授粉, 8月上旬采集成熟果穗, 次年
5月播种育苗, 共获得 400株生长发育正常的个体,
随机挑选出 78个个体作为待测植株。
分离DNA采用CTAB法与试剂盒相结合的方
法, 即先将研磨碎的叶片用2×CTAB高盐溶液洗涤,
以去除多糖, 然后结合Universal Genomic DNA Ex-
traction Kit (Ver.3.0, TaKaRa, Dalian)试剂盒的膜技
术提高 D N A 的提取质量。用模板准备试剂盒
(Template Preparetion Kit, LincoIn, Nebraka, USA)
制备预扩增模板: 酶切反应体积为12.5 μL, 含有100
ng基因组 DNA, 限制性内切酶 EcoRI和MseI各
1.25 U, 在 37 ℃条件下消化 2 h; 75 ℃加热 15 min
后转移至冰块中, 加入 25 μL接头和 T4 DNA连接
酶混合液, 20 ℃下保温连接 2 h; 用具有一个选择
性碱基的引物对连接产物进行预扩增。预扩增程
序为: 94 ℃变性 30 s, 56 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1
min, 20个循环。选择性扩增用AFLP选择扩增试
剂盒(AFLP Selective Amplification Kit, LincoIn,
Nebraka, USA)进行。以稀释 10~20倍的预扩增产
物为模板, 用 700 nm红外染料标记的含 3个选择
性碱基的选择性扩增引物进行选择性扩增。扩增
程序为: 第一次循环为94 ℃变性30 s, 65 ℃退火30
s, 72 ℃延伸 1 min, 随后每次循环退火温度降低
0.7 ℃, 共 12个循环; 以后继续 23个循环: 94 ℃变
性 30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min; 72 ℃延伸
7 min。预、选择性扩增均以ABI 9700型 PCR仪
进行。选择性扩增产物加入 2.5 μL的凝胶加样缓
冲液混匀, 94 ℃变性 3 min, 然后迅速置于冰块中,
取 1 μL, 用 7%的标准测序胶, 凝胶电泳和数据分
析均用 LI-COR 4300 DNA分析系统。电泳结束
后图像信息均可自动保存, 或直接读取多态性数
据。先用 2个亲本的DNA为模板, 从 64个引物对
中筛选出45对存在双亲间的多态性的引物组合, 然
后用这些多态性引物组合检测杂种分离群体。
电泳结束后, 图像会自动保存在电脑中, 78个
模板DNA分 2次运行。图像保存后, 可在电脑上
读取多态性条带, 有条带的记为 1, 没有条带的记
为 0, 模糊不清的记为 “-”。这些数据输入Excel表
上, 再根据孟德尔定律检验 χ2 (χ20.05(1)=3.84), 确定
分离类型。大于 3.84的去掉, 小于 3.84的保留。
保留下的数据再进行分析, 将数据中的1替换为A,
0替换为H, “-”不替换。用软件MAPMAKER/EXP
(Version 3.0b) (Lander等1987)确定连锁群体, 然后用
Kosambi函数将重组率转换成图距单位(centimorgan,
cM) (Kosambi 1944), 再用Map Draw Ver. 2.0绘制
图谱(刘仁虎和孟金陵 2003)。
本文中用的LI-COR 4300 DNA电泳仪通过红
外荧光检测技术分析AFLP标记, 仪器运行结束后,
电泳图像会自动保存在电脑中, 可直接读取多态性
条带, 既减少了染色和暴光等步骤, 又减少了污染,
从而大大提高了实验效率。
结果与讨论
1 AFLP引物组合的扩增
从图 1和表 1可见, 45对引物组合在 2个白桦
亲本中共扩增出 2 729个位点。不同引物对的扩
增效果有很大差异, M-CAA/E-ACA的扩增位点最
丰富, 引物组合M-CTA/E-AGG和M-CTC/E-AAC扩
增效果最差, 45对引物的平均扩增位点为 61个。
多态性位点数不同的引物组合其扩增效果的差异也
很大, 与E-ACA或M-CAA组合的引物扩增效果最
好, 这2个引物产生的多态性位点分别是62个和51
个; 而与 E-ACG组合的较差, 其多态性位点为 17
个。
2 连锁图谱的构建
在中国白桦和欧洲白桦扩增出的2 729个位点
中(表1), 两个亲本和不同的杂种个体所扩增出的多
态性分离位点为343个, 占扩增位点总数的12.6%。
χ2检验(χ20.05(1)=3.84)表明, 分离位点符合拟测交1:1
分离的位点为 311个, 占分离位点的 90.7%。按照
拟测交作图策略, 符合1:1分离的多态位点, 据此认
为可用于白桦分子标记连锁图谱的构建。中国白
桦的 168个标记构成 9个连锁群(4个以上标记)、
11个三连体和14个连锁对, 55个为非连锁位点, 连
锁标记覆盖的总图距为 1 909.2 cM, 平均图距为
16.9 cM (图 2)。而欧洲白桦的 143个连锁标记构
成 12个不同的连锁群(4个以上标记)、4个三连体
和 9个连锁对, 21个为非连锁位点, 连锁标记覆盖
的总图距为 1 857.3 cM (图 3), 平均图距为 15.2
cM。
由于白桦叶片中含有大量的糖分, 常常影响
DNA的分离, 因此能否提取到高质量的白桦基因组
DNA是十分关键的一步。用传统的DNA提取方
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法, 根本无法分离出白桦叶片基因组DNA, 这样就
会影响酶切反应、接头连接、预扩增和选择性扩
增等一系列 PCR反应的效果。为此我们用 CTAB
法与试剂盒相结合的方法, 提取出的DNA纯度较
高, 质量较好, 符合实验的要求。还有, 图谱的构
件常直接依赖于数据分析, 数据分析不准确, 图谱
的构建会出现偏差。所以读取多态性条带时, 条带
有时不十分清晰, 这样会导致读取的偏差, 从而影
响作图结果。更有在读取多态性条带时, 常出现许
多的“-”, 即不清楚的条带, 这种情况的出现可能有
3种原因: ①提取的白桦个体DNA含有杂质, 纯度
不够, 从而影响PCR反应的结果; ②选择性扩增时,
加入的模板DNA量过少, 没有发生反应; ③模板长
期冻溶, 会导致降解失效。
图 1 白桦 F1群体中引物M-CTG/E-ACG组合中AFLP标记的分离
Fig.1 Segregation of AFLP markers amplified with primer M-CTG/ E-ACG in the F1 families of silver birch
泳道 1 和 44 为分子量标记; 泳道 2 为中国白桦; 泳道 3 为欧洲白桦; 泳道 4~43 为中国白桦和欧洲白桦的杂种 F1代个体。
表 1 白桦中AFLP引物组合的筛选
Table 1 The selection of primer combinations of AFLP for silver birch
引物名称(代码) E-AGG E-ACA E-AAC E-AAG E-AGC E-ACT E-ACG E-ACC 合计
(E1) (E2) (E3) (E4) (E5) (E6) (E7) (E8)
M-CTC (M1) 6 (49) - 6 (37) 15 (53) - 12 (55) - - 39 (194)
M-CAC (M2) 6 (60) 13 (57) 4 (57) 4 (48) 7 (59) 7 (44) 4 (56) 4 (79) 49 (460)
M-CTA (M3) 5 (37) 7 (67) 6 (39) 8 (58) - 10 (46) - - 36 (247)
M-CTG (M4) - 7 (58) - 5 (45) 5 (66) 13 (45) 8 (75) 9 (61) 47 (350)
M-CAG (M5) 7 (84) - 2 (62) 7 (57) 2 (62) 7 (53) 5 (54) 7 (60) 37 (432)
M-CTT (M6) 6 (47) 11 (48) - 14 (72) - - - 12 (87) 43 (254)
M-CAT (M7) 9 (44) 13 (82) 10 (55) - 5 (67) 4 (81) - - 41 (329)
M-CAA (M8) - 11 (94) 15 (84) 4 (73) 11 (86) 6 (52) - 4 (74) 51 (463)
合计 39 (321) 62 (406) 43 (334) 57 (406) 30 (340) 59 (376) 17 (185) 36 (361) 343 (2 729)
　　表中的数字为白桦双亲中扩增出的多态性片段的引物组合数, 括弧中为扩增片段总数。
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RAPD和AFLP分子标记技术已广泛用于林木
遗传图谱的构建。但 RAPD和AFLP标记在林木
杂种 F1中普遍发生偏分离和异常分离(李绍臣等
2008)。本文结果表明AFLP标记在 F1杂种中必有
偏分离和异常分离现象。偏分离的原因有多种, 作
图群体小可能是造成偏分离现象发生的原因之一。
偏分离位点能否用于作图, 还不清楚。早期的遗传
图谱大多将偏分离位点用于遗传图谱的构建
(Bradshaw和 Stettler 1994; Grattapaglia和 Sederoff
1994; 苏晓华等 1998)。但是偏分离位点会影响作
图的准确性, 以致作图出现偏差。本文按照拟测交
策略, 由于分析软件的限制, 未曾用 3:1, 而仅以符
合 1:1分离的位点用于连锁分析。到目前为止, 白
桦密度最高的遗传连锁图谱是姜廷波等发表的用
图 2 中国白桦中AFLP标记的连锁图谱
Fig.2 The AFLP linkage maps of Betula platyphylla
右侧为分子标记名称, 左侧为遗传距离(cM)。
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图 3 欧洲白桦中AFLP标记的连锁图谱
Fig.3 The AFLP linkage maps of Betula pendula
右侧为分子标记名称, 左侧为遗传距离(cM)。
RAPD 分子标记技术构建的白桦遗传连锁图谱
(Jiang等 2007)。本文在 2个白桦亲本及杂种群体
中检测到 343个多态性分离位点, 其中 311个符合
1:1分离。如果将该图谱与之前来自不同群体的
RAPD遗传连锁图谱加以整合, 就会在很大程度上
提高白桦遗传连锁图谱的密度。
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