全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (4): 479–486　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0473 479
收稿 2015-08-31　　修定 2016-03-15
资助 国家自然科学基金(31272154)。
* 通讯作者(E-mail: hyqiaaa@126.com)。
接种枯萎病菌对甜瓜脂氧合酶活性及基因表达的影响
邵琪, 解群杰, 刘贺娟, 齐红岩*
沈阳农业大学园艺学院, 设施园艺省部共建教育部重点实验室, 辽宁省设施园艺重点实验室, 沈阳 110866
摘要: 本文研究薄皮甜瓜脂氧合酶(lipoxygenase, LOXs)及其基因家族成员(CmLOXs)在接种枯萎病后的响应。以薄皮甜瓜
‘玉美人’幼苗为试材, “三叶一心”时, 灌根法接种枯萎病菌-尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. melonis), 在接种后不同时
间测定了幼苗电解质渗透率、根系活力、LOX活性及CmLOXs基因相对表达量。接种枯萎病菌后甜瓜叶片中有13个Cm-
LOXs基因在接种枯萎病菌后上调表达。其中除CmLOX02和CmLOX11在第3天显著升高外, 其他11个基因(CmLOX03、Cm-
LOX07~10、CmLOX12~17)均在第5天时相对表达量达到最大值。甜瓜根部有5个CmLOXs基因上调表达, 其中CmLOX03、
CmLOX16和CmLOX17在处理1 d后有显著升高, CmLOX05和CmLOX06在接种3 d时与对照有显著差异。薄皮甜瓜幼苗在接
种枯萎病菌时, 根系活力显著下降, 电解质渗透率升高, 叶片和根中LOX活性升高, 叶片和根中分别有13个和5个CmLOXs成
员上调表达, 但响应时间不同, 这些结果表明CmLOXs可能参与防御反应, 本研究为后续通过转基因技术研究其在生物胁迫
中的作用奠定基础。
关键词: 薄皮甜瓜; 尖孢镰刀菌; 脂氧合酶活性; 基因表达
甜瓜属于葫芦科, 甜瓜属, 一年生蔓性草本植
物, 在我国有着悠久的栽培历史。近年来, 随着设
施栽培面积的扩大及连作等原因, 设施甜瓜枯萎
病发生频繁, 严重影响甜瓜的产量和品质。脂氧
合酶(lipoxygenase, LOXs, EC 1.13.11.12)又名脂肪
氧化酶, 是生物体内特别是高等植物中广泛存在
的一类含有非血红素铁蛋白(Brash 1999; Porta和
Rocha-Sosa 2002)。现已有大量研究表明, 以亚油
酸(linoleic acid, LA)和亚麻酸(linolenic acid, LeA)
等不饱和脂肪酸为前体的LOX途径不仅通过下游
的氢过氧化物裂解酶(hydroperoxidelyase, HPL)分
支产生短链醛、醇, 在抗逆中起作用, 并且可以通
过丙二烯氧合酶(allene oxide synthase, AOS)分支
产生的茉莉酸类(jasmonic acid, JA)物质在抵御逆
境胁迫中起作用(Feussner和Wasternack 2002; Prost
等2005; Hu等2013)。因此, 通过接种甜瓜枯萎病
菌, 研究LOX活性及其基因家族是否发生响应, 进
而深入研究甜瓜CmLOXs基因家族在感染枯萎病菌
中的作用, 对于提高甜瓜抗病能力有重要意义。
1932年在大豆中首次发现了LOX (Andre和
Hou 1932), 其催化含有顺, 顺-1, 4-戊二烯结构的多
不饱和脂肪酸加氧反应, 从而形成具有共轭双键
的脂肪酸氢过氧化物, 后者普遍存在于动物、植
物和真菌中(Brash 1999; Porta和Rocha-Sosa 2002;
Liavonchanka和Feussner 2006)。已有研究表明, 植
物LOX蛋白分子量为94~104 kDa, 是双加氧酶单
体蛋白(Liavonchanka和Feussner 2006)。LOX启动
合成的一系列氢过氧化脂肪酸及其代谢产物统称
为氧脂(oxylipins), 它们在种子萌发(Feussner等
2001)、块茎发育(Kolomiets等2001)、果实成熟
(Chen等2004)、性别决定(Acosta等2009)、衰老
(Seltmann等2010)及病菌防御(Wang等2008)中起重
要作用。尤其在生物胁迫中, 前人做了大量相关
研究: 在感染叶斑病的玉米中, ZmLOX10表达量升
高(Chirstensen等2006); 接种‘花壳’病毒后辣椒
LOX活性显著升高(郑文宇等2013); CaLOX1沉默
的辣椒植株更易感染黄单胞菌叶斑病和炭疽病
(Hwang和Hwang 2010); 番茄感染叶霉病后Tom-
LoxD明显升高(Hu等2015); 受真菌侵染的葡萄
VvLOXO转录水平显著升高(Podolyan等2010); 受
褐飞虱侵袭的水稻OsLOX1迅速积累 (Wang等
2008); 受线虫侵染的豌豆LOXN2参与寄主抗性的
后期机制(Veronico等2006)。可见, 不同植物中
LOXs成员在生物胁迫中发生的响应不同。
近年来, 越来越多的植物: 拟南芥(AtLOX1~
AtLOX6)、番茄(TomLoxA-TomLoxF)以及猕猴桃
(AdLox1~AdLox6)等成功鉴定和克隆出LOXs基因
(Bannenberg等2009; Mariutto等2011; Zhang等
2009), 它们在生长发育过程中有不同的时空表达
模式和生理功能。我们课题组已经从甜瓜基因组
植物生理学报480
数据库中搜索并鉴定出18个CmLOXs基因, 分别命
名为CmLOX01~CmLOX18 (Zhang等2014), 并且完
成了时空表达模式等相关研究, 但是LOX基因家
族各成员在生物胁迫中的作用及响应机制尚不明
确(曹嵩晓等2014)。本研究通过接种枯萎病菌, 对
LOX活性及CmLOXs进行实时荧光定量分析, 以期
明确甜瓜CmLOXs基因家族成员对接种枯萎病菌
的响应。另外, 参考了前人(李小玲等2015; 赵娟等
2010)的研究结果, 认为病菌接菌后5 d内, 相对电
导率、丙二醛及相关酶活性达到最大值, 这些研
究只测定到病菌感染后的第5天数据, 所以本试验
也只测定到接种后5 d各项指标的变化。本研究为
进一步深入了解CmLOXs基因在生物胁迫中的作
用机制, 提高甜瓜抗病能力有重要意义。
材料与方法
1 试验材料与处理
以薄皮甜瓜(Cucumis melo L. var. makuwa
Makino) ‘玉美人’为试材, 2014年8~10月在沈阳农
业大学园艺科研基地日光温室内进行。8月初, 进
行温汤浸种, 催芽, 采用50孔穴盘基质育苗, 幼苗
长至三叶一心时分苗至12 cm×13 cm的营养钵中,
缓苗1周后, 采用灌根法[每株10 mL, 浓度为106 (个
孢子)·mL-1]对甜瓜苗接种枯萎病菌[尖孢镰刀菌
(Fusarium oxysporum Schl.), 菌株为单孢菌株JIE-4,
由沈阳农业大学植物保护学院提供], 分别于接种
后第0、1、3和5天对甜瓜根部和叶片进行取样,
测定电解质渗透率、根系活力、LOX活性及Cm-
LOXs基因相对表达量。
2 测定项目与方法
2.1 枯萎病菌孢子悬浮液的制备
PDA培养基的制备如下: 将马铃薯洗净去皮,
称取200 g, 切成小块。加水煮沸20 min后, 用纱布
过滤装入1 000 mL的三角瓶中, 加入葡萄糖和琼脂
粉各4 g, 充分溶解后加水定容到1 000 mL。然后
在121°C下进行灭菌, 20 min后取出。在超净工作
台上分装倒入培养皿中, 冷却后封口, 放入冰箱中
备用。
尖孢镰刀菌孢子悬浮液的制备如下: 挑取小
块保存于PDA培养基中的菌丝块, 接种到灭过菌
的固体培养基中, 密封后在30°C烘箱中培养5~7 d,
用无菌水冲洗培养基, 以双层纱布过滤去菌丝, 将
滤液浓度调整为106 (个孢子)·mL-1, 用于接种(刘朋
义等2011)。
2.2 电解质渗透率
用天平准确称取洗净的根和叶各0.2 g (根和
叶应尽量完整, 以消除伤口的影响), 处理和对照各
进行3次重复, 加去离子水在室温条件下自然浸泡
2 h, 摇匀后测定电导率, 然后再放入沸水中煮沸15
min, 冷却至室温后再测一次总电导率值, 参考赵
世杰等(1998)文献。
直接用电导率值表示电解质外渗量, 根据公
式: 电解质渗出率(%)=浸泡液电导率值/煮沸后电
导率值×100。计算结果 , 其中温度校正 : X 25=
At[1+0.02(t–25)]; X25为校正成25°C时的电导率, At
为在温度t (°C)下实测电导率值。
2.3 根系活力
参考《现代植物生理学实验指南》(1999), 用
TTC法测定, 四氮唑还原强度[mg·g-1 (FW)·h-1]=四
氮唑还原量(mg)/[根重(g)×时间(h)]。
2.4 LOX酶活性
取0.5 g不同处理的叶片(根), 加50 μL反应底
物亚油酸(0.1 mol·L-1)、2.85 mL磷酸盐缓冲液(pH
6.8, 0.1 mol·L-1)、100 μL粗酶液至3 mL, 在室温下
反应15 s开始在分光光度仪上测量在234 nm下的
光密度值, 根据酶活性单位的定义, 以在25°C下,
每分钟增加1吸光度所需的活性作为甜瓜叶片脂
氧合酶的1个活性单位(U) (陈巧等2013)。
2.5 CmLOXs的实时荧光定量表达(Real-time qPCR)
分析
利用Real-time PCR分析甜瓜在接种枯萎病菌
处理后叶片和根中18个LOX基因的表达情况(Cm-
LOX01~CmLOX18), 以稀释后的cDNA为模板, 以
甜瓜18srRNA基因作为内参基因, 实时定量PCR体
系按照SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) (Cat.
FP205, 天根, 北京, 中国)试剂盒说明书进行。各引
物序列参照Zhang等(2014)文献。Real time-PCR仪
器为ABI PRISM7500荧光定量PCR仪。
3 数据处理
采用Origin 8.0软件进行数据处理, DPS进行
统计分析, 差异显著性比较使用Duncan新复极差
法(α=0.05)。
邵琪等: 接种枯萎病菌对甜瓜脂氧合酶活性及基因表达的影响 481
实验结果
1 接种枯萎病菌后甜瓜植株表型的变化
从图1可以看出, 接种后1~5 d中, 对照组长势
良好, 而处理组随着接种时间的延长出现轻微萎
蔫现象。第15天时, 子叶出现不均匀黄化, 萎蔫下
垂, 根和茎基部腐烂变褐缢缩或呈立枯状, 植株萎
蔫枯死, 表现出明显的枯萎病症状。
2 接种枯萎病菌后甜瓜叶片和根中电解质渗透
率、根系活力及LOX酶活性的变化
从表1可以看出, 叶片和根中电解质渗透率呈
先升高再下降趋势, 而接种后叶片和根中电解质
渗透率均呈升高趋势, 并高于对照组。且接种后
根部电导率值高于叶片, 在第5天达到最大值, 与
对照差异显著, 甜瓜电解质渗透率的升高表明甜
瓜受到枯萎病菌侵染。
图1 接种枯萎病菌后甜瓜植株的变化
Fig.1 Changes of oriental melon seedlings after infecting with fusarium oxysporum
表1 接种枯萎病菌对甜瓜幼苗叶片和根中电解质渗透率、根系活力、LOX活性的影响
Table 1 Effects of fusarium oxysporum on electrolytic leakage ratio, roots vigor,
LOX activities of leaves and roots in oriental melon seedlings
电解质渗透率/% 根系活力/mg·g-1 (FW)·h-1 　LOX活性/U·mg-1 (蛋白)
处理时间/d 叶片 根 根 叶片 根
对照 病菌 对照 病菌 对照 病菌 对照 病菌 对照 病菌
0 18.82 18.63 40.30 40.20 24.94 24.60 26.30 25.76 28.06 28.49
1 19.66 20.67 40.41 42.17 25.31 22.12 28.10 29.99 26.76 28.25
3 19.82 22.67 40.82 43.53 25.35 20.93* 33.27 35.78 28.97 30.38*
5 19.39 28.59* 40.74 49.67* 25.95 13.13* 35.14 42.67* 27.85 32.97*
　　*表示同一时间不同处理间差异显著。下表同此。
接种枯萎病菌后根系活力与对照相比有显著
差异, 明显下降, 并在第5天时最低, 表明甜瓜根部
受到枯萎病菌侵染后根系活力下降。
接种枯萎病菌后, 甜瓜幼苗叶片和根部LOX
活性升高, 第5天时上升到最大值, 与对照组差异
显著。说明甜瓜幼苗在枯萎病菌侵染后, 均促进
了叶片和根部LOX活性上调表达。
3 接种枯萎病菌后甜瓜叶片和根中CmLOXs相对
表达量的变化
3.1 甜瓜叶片中CmLOX01~LOX18相对表达量的
变化
从图2可以看出, 接种枯萎病菌后, 甜瓜叶片中
13个CmLOXs基因(CmLOX02、CmLOX03、CmLOX07~
CmLOX17 )均呈上调表达 , 其中CmLOX02和
植物生理学报482
CmLOX11在第3天显著升高, CmLOX03、CmLOX07~
10、CmLOX12~17在第5天时相对表达量最高。
在这13个上调表达的基因中, 有6个基因(Cm-
LOX03、CmLOX07、CmLOX11、CmLOX12、Cm-
图2 接种枯萎病菌对甜瓜叶片CmLOX01~CmLOX18相对表达量的影响
Fig.2 Effects of fusarium oxysporum on CmLOX01–CmLOX18 relative expressions in oriental melon leaves
邵琪等: 接种枯萎病菌对甜瓜脂氧合酶活性及基因表达的影响 483
LOX15和CmLOX16)在接菌后表达量明显高于其
他基因, 分别是对照的21倍、8倍、40倍、20倍、
16倍和7倍, 推测这些基因可能响应或参与了甜瓜
幼苗的防御机制, 在防御病原菌中起作用。
而其他5个基因(CmLOX01、CmLOX04、Cm-
LOX05、CmLOX06和CmLOX18)则在接菌后没有
响应或者表达量很低, 可能不参与防御反应。
3.2 接种枯萎病菌后甜瓜根部LOX01~LOX18相对
表达量的变化
与叶片中大部分基因接菌后上调表达不同的
是, 接种枯萎病菌后仅诱导了甜瓜根部的5个Cm-
LOXs基因(CmLOX03、CmLOX05、CmLOX06、
CmLOX16和CmLOX17)的表达, 并呈现不同的变化
趋势(图3)。
图3 接种枯萎病菌对甜瓜根部CmLOX01~CmLOX18相对表达量的影响
Fig.3 Effects of fusarium oxysporum on CmLOX01~CmLOX18 relative expressions in oriental melon roots
植物生理学报484
其中, CmLOX03、CmLOX16和CmLOX17在接
种1 d时表达量显著升高, 分别是对照组的9倍、4
倍和3倍, 而CmLOX05和CmLOX06在接种3 d时上
调表达。说明CmLOXs在接种枯萎病菌后, 叶片和
根中表达存在时空差异。
18个CmLOXs基因中, CmLOX05和CmLOX06
仅在根中受诱导而上调表达 , CmLOX02、Cm-
LOX07~15仅在叶片中受诱导而上调表达, 而接种
后CmLOX03、CmLOX16和CmLOX17在叶片和根
中均上调表达。
讨　　论
本试验接种枯萎病菌后, 处理组植株叶片和
根部的电解质渗透率与对照相比均上升, 并且在
第5天达到显著差异, 表明生物胁迫会严重影响甜
瓜植株的生长发育, 损伤膜系统。在接种褐腐病
和轮纹病的梨果实愈伤组织中相对电导率持续增
加, 膜系统遭到损失, 膜透性的变化与受害程度呈
正相关(赵娟等2010)。本试验中甜瓜接种枯萎病
菌后根系活力显著低于对照, 这与黄瓜感染枯萎
病后根系活力明显下降的研究结果一致(黄奔立等
2007)。本试验中这些生理指标变化表明甜瓜的确
受到枯萎病菌的侵染, 为下一步测定LOX活性及
基因表达提供基础。
已有研究表明, LOX在植物对病原体感染的
防御反应中起关键作用。如玉米受大斑病菌侵染
后, 能诱导LOX活性增加(张建成等2003)。黄瓜感
染褐斑病后, 叶片中的LOX酶活性及JA含量都明
显上升 , 用LOX的专一抑制剂甲二氢愈创木酸
(NDGA)喷施叶片后再接种褐斑病菌, 叶片中的
LOX活性及JA含量明显降低, 植株更易感病, 而用
NDGA处理后外加JA处理可以使植株的抗病性与
正常植株一样, 这说明植株感染病原菌后LOX酶
活性的增加会导致JA的积累, 促进抗病反应的发
生(石延霞2008)。甜菜受黄脉坏死病毒(BNYVV)
侵染后, 能显著提高甜菜根和叶内LOX活性, 进而
影响JA的合成(白朕卿等2012)。本试验中接种枯
萎病菌后导致的LOX活性升高, 是否会影响下游
的JA含量, 进而起到防御作用, 是我们下一步要开
展的工作。
有研究表明, 在番茄中, TomLoxF能够编码13-
LOX并被恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) BTP1
激活(Mariutto等2011), 而感染叶霉病后TomLoxD
明显升高(Hu等2013), TomLOXD沉默的转基因株
系与野生型相比TomLOXD基因表达量下降, LOX
酶活性降低, JA含量也随之降低, TomLOXD基因通
过AOS支路产生茉莉酸进而在防御病原菌中起作
用(Hu等2015)。在辣椒中, 有研究表明CaLOX1沉默
的植株更易感染黄单胞菌叶斑病和炭疽病(Hwang
和Hwang 2010); 而感染疫霉菌的辣椒中CaLOX2
明显升高, 可能通过水杨酸和茉莉酸信号途径参
与辣椒对疫霉菌等逆境条件的防卫反应(贾庆利等
2012)。感染叶斑病的玉米叶片中ZmLOX10表达
量升高(Nemchenko 2006), 玉米受食草动物侵袭后,
ZmLOX10沉默突变体植株与野生型相比, 绿叶挥
发物含量明显降低, ZmLOX10通过HPL支路产生
绿叶挥发物GLV来抵御害虫侵害(Christensen等
2013)。大白菜受根肿病侵染后LOX2升高, 主要通
过JA途径参与抗病过程(韩之琪等2015)。
从以上国内外研究可以看出, 同一作物不同
LOX家族成员对病原菌的响应不同。本试验中,
接种枯萎病菌后, 叶片和根中LOX基因家族成员
表达存在时空差异, CmLOX05和CmLOX06仅在根
中受诱导而上调表达, CmLOX02、CmLOX07~15
仅在叶片中受诱导而上调表达, 而CmLOX03、
CmLOX16和CmLOX17接种后, 叶片和根中均上调
表达。推测这些基因可能在病原菌防御反应中起
作用, 但具体是通过AOS还是HPL途径还有待进一
步研究。
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Effects of LOX activity and gene expression of Cucumis melo var. makuwa inoc-
ulated by Fusarium oxysporum
SHAO Qi, XIE Qun-Jie, LIU He-Juan, QI Hong-Yan*
Key Laboratory of Protected Horticulture of Liaoning Province, Key Laboratory of Protected Horticulture, Ministry of Education,
College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China
Abstract: The effects of lipoxygenase (lipoxygenase, LOXs) and gene family members (CmLOXs) in the orien-
tal melon inoculated with Fusarium oxysporum f. sp. melonis were studied. The oriental melon cultivar ‘Yu-
meiren’ were used as the experimental materials, they were inoculated with Fusarium oxysporum at the period
of three leaves, then the conductivity, root vigor, LOX activity and real-time fluorescent quantitative PCR anal-
ysis of CmLOXs gene expressions were determined in different days. There were 13 CmLOXs up-regulated in
leaves after inoculating with Fusarium oxysporum f. sp. Melonis. CmLOX02 and CmLOX11 were significantly
higher at 3 days after inoculation, while other 11 CmLOXs (CmLOX03, CmLOX07–10, CmLOX12–17) reached
peak value at 5 days. Meanwhile, there were 5 CmLOXs up-regulated in roots after inoculation. CmLOX03,
CmLOX16 and CmLOX17 were significantly increased at 1 days, CmLOX05 and CmLOX06 were significantly
higher than the control at 3 days. In addition, LOX activity and conductivity in leaves and roots increased,
while root vigor decreased when melon seedlings infected Fusarium oxysporum. The results suggested that
LOX gene family might participate in response and will be helpful in transgenic experiment to understand their
precise roles of melon in biotic stress.
Key word: oriental melon (Cucumis melo var. makuwa); Fusarium oxysporum f. sp. melonis; LOX activity;
gene expression
Received 2015-08-31 Accepted 2016-03-15
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31272154).
*Corresponding author (E-mail: hyqiaaa@126. com).