全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (8): 811~816 811
收稿 2013-05-14　　修定 2013-07-07
资助 吉林省玉米产业技术体系(201203-1)和国家科技支撑计划
项目(2012BAD19B04)。
** 共同第一作者。
* 通讯作者(E-mail: panhongyu@jlu.edu.cn; Tel: 0431-
85167420)。
四翅滨藜AcERF1基因的克隆及其在酵母中的抗逆分析
孙新华**, 李敬涛**, 刘言志, 贾承国, 潘洪玉*
吉林大学植物科学学院, 长春130062
摘要: ERF (ethylene responsive factor)转录因子是植物AP2/ERF超家族转录因子中一个重要的亚家族, 其DNA结合域可与
多种病程相关基因启动子区的GCC-box特异性结合, 从而激发植物的抗逆应答反应。本研究通过筛选四翅滨藜(Atriplex
canescens) cDNA文库, 获得一个ERF的全长cDNA序列, 命名为AcERF1 (Genbank序列号为JN984931), AcERF1基因开放阅
读框为1 161 bp, 编码387个氨基酸, 其编码蛋白N端含有一个保守的类MCGGAI (I/L)基元。为了研究AcERF1基因的抗逆
功能, 将其转入酵母进行盐、碱、干旱、高温、冷冻和活性氧等胁迫, 结果表明, 重组酵母在多种胁迫下的抗逆水平明显
高于对照, 特别对高温、强碱和活性氧表现出明显抗性。推测该基因参与了四翅滨藜的抗逆调控过程。
关键词: 四翅滨藜; 酵母表达; AcERF1; 抗逆
Cloning and Functional Characterization of An AcERF1 Gene from Atriplex
canescens
SUN Xin-Hua**, LI Jing-Tao**, LIU Yan-Zhi, JIA Cheng-Guo, PAN Hong-Yu*
College of Plant Science, Jilin University, Changchun 130062, China
Abstract: The ethylene responsive factors (ERF) belong to a subfamily of the AP2/ERF superfamily in plants.
The ERF subfamily were shown to specifically bind the GCC-box presented in many promoters of pathogenesis
related protein (PR) genes, and implicated in various responses to environmental stimuli. In this study, a new
member (AcERF1) of ERF subfamily was isolated from an Atriplex canescens cDNA library. The AcERF1
contains an open reading frame of 1 161 bp which encodes a protein of 387 amino acid residues with a
conserved N-terminal MCGGAI (I/L) -like motif. To investigate its function associated with abiotic and biotic
stress, AcERF1 was transformed into Saccharomyces cerevisiae INVSc1 and treated with saline, alkali, drought,
high temperature, freezing, as well as paraquat, heterologous expression of AcERF1 in transgenetic yeast
showed a relatively higher stress resistance, particularly in high temperature, alkali and paraquat conditions
when compared with control. These results indicated that AcERF1 may involve in response to environmental
stress and exhibit multiple, complex and flexible expression patterns in A. canescens.
Key words: Atriplex canescens; yeast expression; AcERF1; stress tolerance
四翅滨藜(Atriplex canescens)又称灰毛滨藜,
属藜科滨藜属, 是世界干旱、半干旱地区的典型
植物, 有极强的耐干旱、低温、盐、碱等优良特
性。适生范围广泛, 可作为优良的的盐碱地改良
品种。在盐条件下, 它能将吸收的盐分积累到叶
片表面形成一层白色屑状物体, 从而提高对高盐
的抗性。四翅滨藜营养丰富, 体内胡萝卜素含量
较高, 植株平均粗蛋白含量为4%, 叶片的粗蛋白含
量可高达18%, 可以作为大部分牲畜的牧草, 特别
是在冬天为牲畜提供饲料, 是非常有潜力和应用
价值的牧草。目前, 四翅滨藜因其可作为荒漠改
良的绿化植被而受广泛关注, 但抗逆相关的分子
机制研究较少, 主要集中在基因克隆及转入酵母
进行相关功能验证等方面(李敬涛等2012; 余刚等
2012; 张勇等2012)。
AP2/ERF超家族转录因子是植物中广泛分布
的一大类转录因子, 其结构特征是含有由50~60个
氨基酸编码的AP2结构域, 该结构域通过与多种基
因启动子区的DRE/CRT元件(DRE: dehydration-
responsive element; CRT: C repeat; 上述2个元件均
植物生理学报812
包含保守序列CCGAC)或GCC-box特异结合而调
控下游相关基因的表达进而参与植物信号转导,
最终调控植物生长发育及胁迫应答过程(Nakano等
2006)。根据AP2保守功能域的数量, AP2/ERF可以
分成三大类: 第一类AP2 (APETALA2), 含有2个
AP2/ERF结合域; 第二类RAV, 含有1个AP2/ERF结
合域和1个B3结合域; 第三类ERF, 只含有1个AP2/
ERF结合域。根据AP2/ERF结合域的序列相似性,
ERF家族成员可分为ERF亚家族、DREB亚家族和
其他三个亚家族。其中ERF亚家族和DREB亚家
族又被分别分成了B-1~B-6和A-1~A-6六个亚类。
ERF亚家族和DREB亚家族在AP2保守功能域的第
14位和第19位氨基酸存在差异, ERF亚族AP2/
ERF功能域的第14位和第19位分别是丙氨酸和天
冬氨酸, DREB亚族分别是缬氨酸和谷氨酸, 这2个
氨基酸位点的差异性决定了它们分别与不同的顺
式元件结合, 即ERF和DREB转录因子参与不同的
信号转导途径(Sakuma等2002; Junya等2012)。
ERF转录因子的DNA结合域可以和多种病程相关
蛋白(pathogenesis related protein)基因启动子区的
GCC-box结合从而调控下游基因的表达(Ohme-
Takagi和Shinshi 1995)。研究表明ERF基因编码的
多功能转录因子通过参与信号转导途径响应多种
逆境胁迫, 其主要参与调控乙烯信号通路, 同时调
节水杨酸、茉莉酸、脱落酸、病原菌、低温、干
旱及盐害等的分子应答。目前, ERF基因是备受关
注的提高作物非生物抗性和生物抗性的候选基
因。将ERF转录因子基因转入植物进行过表达, 明
显提高了转基因植物对多种病原菌的抗性(见Xu
等2011的综述)。Gao等(2008)将番茄中的TERF1
基因转入水稻后, 增强了水稻对干旱和高盐的抗
性。Zhang等(2009)在烟草中过表达大豆GmERF3
基因, 提高了转基因烟草对盐、干旱及病原菌的
抗性。
然而, 在目前众多的研究中还没有关于四翅
滨藜ERF类转录因子功能研究的相关报道。本研
究采用盐生灌木植物四翅滨藜作为研究材料, 构
建低温(–10 ℃)和盐(400 mmol·L-1 NaCl)胁迫下四
翅滨藜的全长cDNA文库, 通过Gateway技术LR重
组到酵母表达载体pYES-DEST52中, 对文库质粒
进行测序和生物信息学分析后得到AcERF1, 将
pYES-AcERF1转化酵母菌株INVSc1, 模拟多种逆
境胁迫(盐碱、冻害、高温、SOS胁迫、干旱胁
迫)分析AcERF1基因的抗逆功能。为AcERF1作为
植物抗逆基因工程候选基因提供依据, 也为四翅
滨藜耐生物胁迫和碱、高温等非生物胁迫的分子
机制研究提供依据。
材料与方法
1 材料
四翅滨藜(Atriplex canescens) cDNA文库大肠
杆菌菌株DH10B由本实验室构建并保存; 大肠杆
菌E.coli DH5α由本实验室提供; 酿酒酵母菌株
INVSc1与表达载体pYES-DEST52购自Invitrogen
公司; 限制性内切酶购自TaKaRa公司。
2 方法
2.1 四翅滨藜AcERF1基因全长cDNA的获得及序
列分析
以四翅滨藜作为研究材料, 通过低温(–10 ℃)
和盐(400 mmol·L-1 NaCl)胁迫处理, 构建全长cDNA
文库, 通过Gateway技术LR重组到酵母表达载体
pYES-DEST52。以载体pYES-DEST52上游引物
T7 (5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)、下游引
物R (5′-AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3′)
为测序引物, 将片段长度超过1 000 bp的文库克隆
测序, 获得一个四翅滨藜编码AP2/ERF功能域的
EST序列。
2.2 AcERF1基因转化酵母及检测
运用醋酸锂法转化酿酒酵母INVSc1, 分别将
质粒pYES-AcERF1和空质粒pYES-DEST52转化酵
母, 涂布在SC-Ura+2%葡萄糖筛选培养基上, 以未
转化的酵母做对照, 30 ℃培养2 d后随机挑取单克
隆于液体培养基中摇培24 h, 把菌液煮沸6 min, 冰
上放置6 min破碎细胞, 以引物T7和R进行PCR
验证。
2.3 重组酵母胁迫处理
挑取验证正确的INVSc1 (pYES-AcERF1)和
INVSc1 (pYES-DEST52)酵母菌液, 进行盐胁迫处
理(5 mol·L-1 NaCl和4 mol·L-1 KCl)、碱胁迫处理
(6%、8% Na2CO3和6%、8% NaHCO3溶液)、干旱
胁迫处理(40% PEG 6000和5 mol·L-1山梨醇)、低
温胁迫(−20 ℃)处理、高温胁迫 (53 ℃)处理以及
孙新华等: 四翅滨藜AcERF1基因的克隆及其在酵母中的抗逆分析 813
活性氧胁迫处理(4 mmol·L-1百草枯)。每组实验重
复3次, 详细的实验方法参阅李敬涛等(2012)。
实验结果
1 AcERF1基因全长cDNA的获得及序列分析
经测序, 获得一个编码四翅滨藜ERF转录因
子的cDNA序列, 命名为AcERF1。序列分析表明
AcERF1基因由1 576 bp组成, 含有一个1 161 bp完
整的开放阅读框(open reading frame), 同时还提供
5′-UTR和3′-UTR序列, 开放阅读框的起始密码子
为ATG, 终止密码子为TAA。在ExPASY网站
(http://us.expasy.org/tools/pitool.htm)对其编码的氨
基酸序列进行分析, 表明其由387个氨基酸残基组
成, 其中含有88个疏水氨基酸, 298个亲水氨基酸,
亲水性极强; 45个碱性氨基酸, 60个酸性氨基酸,
蛋白质分子量为42.7 kDa, 等电点为4.61。运用
DNA MAN软件预测, 不含信号肽。用蛋白亚细胞
定位预测软件WoLF PSORT (http://wolfpsort.seq.
cbrc.jp/) 在线预测AcERF1蛋白定位在细胞核中。
利用Pfam (http://pfam.janelia.org/)及NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Stucture/cdd/)对
AcERF1蛋白序列进行比对分析: 该蛋白含有一个
由57个氨基酸编码的AP2/ERF结构域, 其第 14 位
和第19位氨基酸残基分别为A和D, 说明此基因编
码典型的ERF亚家族转录因子(图1)。利用BioEdit
和ClustalW程序对5种不同植物的ERF基因所编码
的蛋白质进行多序列比对分析, 结果表明该蛋白
与其他物种ERF转录因子的AP2/ERF结构域高度
保守, 其N端含有的序列MCGGAVI, 与第四类ERF
蛋白特有的N-端基元MCGGAII/L高度相似(图
1)。将AcERF1与已确定功能的其他物种的AP2/
ERF氨基酸序列进行进化分析和同源性分析, 并用
ClustalX和MEGA4软件绘制进化树, 结果表明
AcERF1与华北驼绒藜CeERF1编码的蛋白同源性
较高, 为75% (图2)。
2 转AcERF1基因重组酵母的鉴定与抗逆性分析
酿酒酵母菌株INVSc1是尿嘧啶营养缺陷型菌
株, 运用SC-U培养基初步筛选获得转化子, 再随机
挑取INVSc1 (pYES2-AcERF1)阳性克隆, 以引物T7
和R进行菌液PCR鉴定, 进一步表明重组质粒已成
功转化酵母细胞。
模拟各种逆境 , 对鉴定正确的重组酵母
(pYES-AcERF1)与转空载体(pYES-DEST52)酵母
进行胁迫处理(图3)。
用4 mmol·L-1 KCl、5 mmol·L-1 NaCl两种不同
浓度的盐处理24 h后两种酵母均能生长, 几乎没有
差异(图3-A、B)。
高温处理2 h后, 转pYES-AcERF1酵母比对照
存活率明显要高。从100倍、1 000倍的稀释菌液
来看, 重组酵母长势优于对照, 稀释10 000倍时, 对
照已完全不能生长, 而转pYES-AcERF1酵母仍能
正常生长(图3-C)。这说明AcERF1基因转入酵母
细胞后表达, 可能使酵母对高温的耐受力增强, 表
明AcERF1基因在耐高温方面可能有一定的作用。
低温处理后, 两种酵母均能生长, 几乎没有差
异(图3-D)。
用6%和8% NaHCO3分别进行碱处理后, 转
pYES-AcERF1酵母长势明显优于对照(图3-E、F),
6%和8% Na2CO3进行碱处理后, 两种酵母的生长
状况有轻微差异(图3-G、H), 表明AcERF1基因能
提高酵母对碱胁迫的抗性。
使用40% PEG 6000和5 mmol·L-1山梨醇分别
进行干旱处理后, 转pYES-AcERF1酵母的存活率
均高于对照(图3-I、J), 其中对山梨醇胁迫处理的响
应更为明显, 即5 mmol·L-1山梨醇处理后, 相比对照,
重组酵母的存活率更高, 表明AcERF1基因的转入
表达使重组酵母细胞对干旱胁迫的耐受力增强。
4 mmol·L-1百草枯处理后, 转pYES-AcERF1酵
母存活率明显高于转空质粒酵母(图3-K), 由于百
草枯可以产生活性氧模拟植物病原微生物侵染植
物过程中产生的活性氧物质从而模拟植物病原菌
等生物胁迫, 在当植物病原菌侵染植物时, AcERF1
基因可能提高植物抗氧化的能力, 进而增强植物
抵抗病原物侵染的能力。
结果表明INVSc1 (pYES-AcERF1)对不同的逆
境产生不同程度的抗性应答(图3), 其中对高温、
强碱和活性氧表现出明显抗性, 说明AcERF1基因
可能通过参与不同的信号转导途径来调节对高温、
强碱、活性氧、干旱等不同逆境的分子应答。
讨　　论
干旱、盐、碱、高温、低温、病原物和昆虫
植物生理学报814
图1 AcERF1蛋白与其他同源ERF蛋白多序列比对
Fig.1 The multiple sequence alignment of AcERF1 with homologous ERF proteins
6种植物ERF蛋白的多序列对比。蛋白名称和序列号如下: AcERF1 (四翅滨藜, Atriplex canescens, JN984931); CeERF1 (华北驼
绒藜, Ceratoides arborescens, ACI62768.1); FsERF1 (欧洲山毛榉, Fagus sylvatica, ACM49847.1); GhERF (棉花, Gossypium hirsutum,
1AAX07458.2); PsERF2a (李, Prunus salicina, ACM49847.1); AtERF3 (拟南芥, Arabidopsis thaliana, AEE32574.1)。下划线标记代表AP2功
能域, 星号标记为完全保守的氨基酸, 三角形表示ERF的特征氨基酸A14和D19, 黑色方框内为MCGGAII/L基元。
孙新华等: 四翅滨藜AcERF1基因的克隆及其在酵母中的抗逆分析 815
等环境中的胁迫因子均危害植物的生长及作物产
量, 植物在生长发育过程中不断接受这些刺激信
号, 引发一系列信号转导途径, 并做出相应的抗逆
应答。ERF转录因子是与植物抗逆应答密切相关
的一类转录因子家族, 可以整合ET、JA、SA等多
种信号分子介导的各种抗逆相关的信号通路从而
综合提高植物的抗逆性。自Ohme-Takagi和Shinshi
(1995)从烟草中分离出第一个可以与GCC-box特
异性结合的ERF蛋白以来, 已有大量ERF从拟南
芥、烟草、水稻、大豆等植物中分离出来。ERF
图3 酵母INVSc1 (pYES-AcERF1)和INVSc1 (pYES-DEST52)在不同胁迫条件下的生长
Fig.3 Growth of INVSc1 (pYES-AcERF1) and INVSc1 (pYES-DEST52) yeast under different stress conditions
100、10-1、10-2、10-3、10-4分别代表不稀释和稀释10、100、1 000、10 000倍的菌体。A: KCl胁迫; B: NaCl胁迫; C: 高温(53℃)胁迫;
D: 低温(−20℃)胁迫; E: 6% NaHCO3胁迫; F: 8% NaHCO3胁迫; G: 6% Na2CO3胁迫; H: 8% Na2CO3胁迫; I: PEG胁迫; J: 山梨醇胁迫; K: 百草
枯胁迫。WT: 指转空载体酵母(pYES-DEST52); TG: 指转AcERF1基因重组酵母(pYES-AcERF1)。
转录因子在植物应答生物胁迫与非生物胁迫过程
中发挥的重要作用也被深入研究(Xu等2011), 将编
码植物ERF转录因子的基因如烟草Tsi1、小麦
TaERF1和大豆GmERF3转入植物过表达后明显提
高了植物对生物胁迫及非生物胁迫的耐受力(Park
等2001; Tang等2005; Zhang等2009)。大量研究表
明在转基因植物获得抗逆性过程中, 伴随着植株
矮小、形态发生改变、或者生物量减少等不良性
状, 这样的遗传材料对于通过分子育种改变作物
性状没有直接的指导意义。而ERF转录因子是通
图2 AcERF1与其他植物AP2/ERF构建系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree of the AcERF1 protein and other AP2/ERF proteins
箭头代表AcERF1在进化树中的位置。
植物生理学报816
过提高光合效能, Rubisco活性以及光合作用进程
中关键磷酸糖类的合成等增强代谢的方式来增强
植物应对逆境胁迫的能力。Oh等(2009)把水稻中
的AP37基因转入水稻后不仅增强了水稻对干旱的
抗性, 还明显提高了水稻的灌浆率和产量(16%~
57%), 因此ERF基因在提高作物对干旱、低温、
盐、碱等胁迫耐受力的同时还提高了植物的产量,
故可以作为非常好的育种材料。
本研究通过筛选四翅滨藜的全长cDNA文库,
获得四翅滨藜抗性EST序列AcERF1, 该基因编码
的蛋白含有一个由57个氨基酸组成的AP2结构域,
其第14位和第19位氨基酸分别是丙氨酸和天冬氨
酸, 表明AcERF1基因的编码产物是典型的ERF类
转录因子。将AcERF1基因编码的氨基酸序列与华
北驼绒藜、欧洲山毛榉、李、棉花、模式植物拟
南芥的ERF蛋白进行多序列比对表明它们之间保
守功能域AP2的同源性为90%, 全序列同源性为
60.2%。Tournier等(2003)将ERF转录因子分为四
个亚类, N段含有MCGGAII/L基元的ERF转录因子
归为第四亚类。四翅滨藜AcERF1转录因子和华
北驼绒藜CeERF1转录因子的N段含有一段与该基
元极其相似的序列MCGGAVI, 它们之间的区别仅
是基元第6位氨基酸分别是异亮氨酸和缬氨酸, 这
可能是藜科植物在进化过程中为适应环境而发生
了选择性突变。
用酵母表达系统筛选植物抗逆基因具有原核
表达系统不可替代的优越性, 它可以体现目的基
因在真核细胞内的表达情况。Gao等(2011)将
ThVHAc1基因转入酵母, 对其进行抗盐、干旱、活
性氧、重金属、低温、高温等功能分析, 证明酵
母表达系统是研究抗逆基因功能的良好材料。此
研究将四翅滨藜AcERF1转入酵母INVSc, 进行一
系列逆境胁迫处理, 通过转AcERF1基因酵母与转
空载体酵母在逆境环境中的生长差异, 表明AcERF1
基因可以提高酵母INVSc1对高温、强碱和干旱的
抗性; 同时, 也明显增强了由百草枯引起的活性氧
抗性。通过酵母表达系统初步表明AcERF1参与抗
逆应答过程, 但其在植物中抗逆胁迫信号转导过
程中的作用及机制还需进一步验证。
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