全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (11): 1064~10681064
收稿 2011-05-12　　修定 2011-09-15
资助 国家自然科学基金(90917005)。
* 通讯作者(E-mail: jsliang@yzu.edu.cn; Tel: 0514-87971690)。
过表达抗miR398的OsmCSD2基因提高水稻的重金属抗性
鲁玉柱1, 封振1, 边黎颖1, 谢虹1, 鲁晓红2, 梁建生1,*
1扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州225009; 2陕西中医学院附属医院, 陕西咸阳712000
摘要: CSD (Cu/Zn superoxide dismutases)基因在拟南芥中参与多种胁迫应答, 而miR398是CSD基因响应胁迫的原因。此处,
我们成功克隆出了水稻的OsCSD2基因, 并根据密码子的兼并性, 突变了miR398作用的位点, 但不改变其氨基酸序列, 得到
新的抗miR398的OsmCSD2, 构建过表达载体并转入水稻中。对阳性转基因株系的分子鉴定表明, 过表达植株的OsmCSD2
基因获得了高表达。在重金属铜胁迫下, 转基因株系表现出良好的抗逆性, H2O2含量显著低于野生型。
关键词: CSD; 铜胁迫; miR398; 氨基酸; H2O2
Over-Expression of miR398-Resistant Version of OsCSD2 Gene in Rice En-
hance Tolerance to Heavy Metal Stress
LU Yu-Zhu1, FENG Zhen1, BIAN Li-Ying1, XIE Hong1, LU Xiao-Hong2, LIANG Jian-Sheng1,*
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009, China; 2Affiliated Hospital of Shaanxi
University of Chinese medicine, Xianyang, Shaanxi 712000, China
Abstract: CSD (Cu/Zn superoxide dismutases) genes in Arabidopsis involve in multiple stress responses, and
miR398 is the cause of CSD gene response to stress. Here, we have successfully cloned OsCSD2 gene, and
mutated the sequence of sites targeted by miR398 according to the degeneracy of codons, but didn’t change the
amino acid sequence in OsCSD2. Thus, we got new anti-miR398-version of CSD2 (named as OsmCSD2), built
an expression vector and transferred to the rice. Positive molecular identification of transgenic plants showed
that over-expression of plant obtained a high expression of OsmCSD2 gene. Under the Cu stress, transgenic
plants showed good resistance, and H2O2 content was significantly lower than that of wild type.
Key words: CSD; Cu stress; miR398; amino acid; H2O2
植物野外生育时会遭受各种非生物因素的胁
迫, 致使植物体内的活性氧(reactive oxygen spe-
cies, ROS)含量升高(Mittler 2002)。少量的ROS可
有助于植物的免疫, 但过高的ROS含量会对植物造
成多种生理伤害, 包括氧化核酸、蛋白以及油脂
等(Mittler 2002)。因此, ROS含量的升高被认为是
植物遭受胁迫的指示剂, 并且是植物响应胁迫的
第二信号(Tuteja和Sopory 2008)。
CSD1 (Cu/Zn superoxide dismutases)、CSD2
和CSD3是以Cu/Zn作为辅基的超氧化物岐化酶
(superoxide dismutase, SOD), 分别定位于细胞质、
叶绿体和过氧化酶体中(Kliebenstein等1998)。研
究发现, CSD1和CSD2在臭氧、紫外和强光等胁迫
下表达增强(Sharma和Davis 1997; Kliebenstein等
1998)。拟南芥CSD2功能丧失的突变体csd2在自然
条件下生长缓慢且光合能力低下(Rizhsky等2003),
进一步表明它在植物正常生育中的重要功能。
Sunkar等(2006)研究表明, CSD基因正响应胁
迫是因为一个植物小分子RNA miR398负响应胁
迫所致。miR398是陆生植物中高度保守的一个
microRNA, 它的靶基因为CSD1和CSD2 (Bonnet等
2004; Jones-Rhoades和Bartel 2004; Sunkar和Zhu
2004; Axtell和Bartel 2005; Sunkar等2005)。mi-
croRNA和其靶基因的表达模式往往是负相关的,
在动物中, microRNA往往抑制靶基因的翻译, 而植
物中的microRNA因为和其靶基因高度互补而以切
割mRNA的方式来沉默靶基因(Bartel 2004; 鲁玉柱
等2009a)。miR398及其相同的靶基因在多种植物
研究报告 Original Papers
鲁玉柱等: 过表达抗miR398的OsmCSD2基因提高水稻的重金属抗性 1065
的高度保守性暗示了它在植物正常发育中的重要
功能。以往由于忽略了miR398的存在, 采用过表
达C S D基因来提高植物抗性的目的难以实现
(Sunkar等2006)。
目前, 对CSD基因的研究成果主要集中于拟南
芥中, 而对水稻CSD基因的研究鲜有报道。因此,
我们以OsCSD2基因为研究对象, 采用位点突变的
方法, 突变miR398对CSD2的作用位点序列, 但不
改变氨基酸序列 , 用Ubi1启动子驱动突变后的
CSD2基因, 转化水稻, 获得转基因植株; 用重金属
Cu2+胁迫, 发现转基因植株显著提高重金属耐性。
材料与方法
1 材料
本研究所用水稻(Oryza satival L.)品种为‘日本
晴Nipponbare’。该品种的基因组序列已被测序。
2 方法
2.1 OsmiR398与OsCSD基因序列的比较
miR398 (基因ID为MI0001051)取自microRNA
database (http://www.mirbase.org/cgi-bin/browse.
pl)。OsCSD1 (基因ID为TC307228)从数据库(http://
compbio.dfci.harvard.edu/tgi/)中查得。OsCSD2 (基
因ID为D85239)从NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/)中查得。序列同源性及互补性比较采用软件
DNASTAR分析。
2.2 OsCSD2基因的克隆、定点突变及过表达载体
的构建
为了克隆OsCSD2基因, 根据其CDNA全序列,
设计引物(正向引物为: 5′ AAGAGCTCTATCAT-
CGTCAGGTCAGGCA 3′, 反向引物为: 5′ CCG-
GATCCGCTCAACTAAATTTTATTACT 3′; 引入的
BamHI和SacI位点用下划线表示), 采用RT-PCR克
隆。用Trizol提取水稻幼苗总RNA, 经反转录后用
PCR扩增获得全长OsCSD2 cDNA序列。为了获得
具有miR398抗性的突变基因, 利用位点突变试剂
盒(购自Stratagene公司), 通过引物设计导入预期突
变位点,所采用的正向突变引物为5′ CCAGAA-
GATGAAGTCCGTCATGCAGGGGATCTAGG-
GAATATTGTTGCCAATGCTGA 3′, 反向引物为5′
TTGGCAACAATATTCCCTAGATCCCCTGCAT-
GACGGACTTCATCTTCTGGTGCACCGTG 3′。
第一轮PCR产物经纯化后作为第二轮PCR扩增的
模板。终产物经消化后导入pUC18质粒, 经测序无
误后即获得突变的OsCSD2 (命名为OsmCSD2)基
因, 然后将目的突变基因导入表达载体pCAMBIA
1301中。
2.3 水稻组织培养及根癌农杆菌介导的转化
水稻愈伤组织所用系列培养基分别为: 组织
培养基为N6D, 共培养基为N6-2AS, 选择培养基为
N6D (含50 mg·L-1潮霉素和400 mg·L-1头孢霉素),
分化培养基为MS培养基。供试的愈伤组织是以水
稻种子萌发后的外植体用于愈伤组织的诱导及随
后的转化。研究所使用的根癌农杆菌为菌株EHA
105。根癌农杆菌的培养及水稻转化步骤依照鲁
玉柱等(2008)报道。
2.4 转化植株的Northern分析
将T1代转化植株的种子在含有潮霉素的培养
基上萌发, 筛选抗性植株。然后检测抗性植株的
外源基因是否过量表达, 采用Northern分析。用
PCR标记法制备探针, OsCSD2基因探针长度为320
bp, OsCSD1的探针长度为340 bp。制备探针时,
OsCSD2所用引物为: 正向5′ GCAGATTCCTCT-
GAGTGGCCCA 3′, 反向5′ GCTCAACTAAATTTT-
ATTACTGT 3′; OsCSD1所用引物为: 正向5′ ACTC-
TAGATTCTACAATAAGA 3′, 反向5′ CTAGCT-
GTAGTGCGCGTGCGT 3′, 探针用α-32P-dCTP标
记。 PCR时, 4种dNTP中含有α-32P标记的dCTP。
将制备好的探针煮沸5 min, 加入杂交液中(含
6×SSC、5×Denhardt’s溶液、0.5% SDS和0.1 mg
mL-1鲑鱼精DNA)。将20 µg RNA用1%琼脂糖凝胶
电泳后转入N+尼龙膜中(Amersham Pharmacia Bio-
tech, UK), 65 ℃杂交液中杂交。之后65 ℃用洗膜
液洗膜2次。第1次用含2×SSC/0.1% SDS洗脱液洗
脱30 min, 第2次用含0.2×SSC/0.1% SDS洗脱10
min。然后放射自显影。
2.5 铜胁迫下转基因株系生长与H2O2检测
制备1×N6液体培养基, 并添加CuSO4至终浓
度为200 µmol·L-1, 选取生长10 d幼苗, 置于培养基
中, 放置于光照培养箱中室温培养并观察表型变
化。光照强度为720 µmol·m-2·s-1, 光暗培养为16
h/8 h。铜胁迫4、8、16、24和48 h时检测H2O2含
量, 方法参考Patterson等(1984)。
植物生理学报1066
结果与讨论
1 miR398与OsCSD的序列比较
在水稻基因组中, 有2个miR398位点, 分别位
于第7和第10染色体上, 即miR398a和miR398b
(Jones-Rhoades和Bartel 2004)。两者序列高度同
源, 仅有2个碱基的差异。miR398a和miR398b与2
个OsCSD基因序列比较, 发现miR398和2个OsCSD
基因高度互补配对(图1)。其中, 在miR398和OsC-
SD1的5个不配对的碱基中, 有3个为G:U, 但G:U被
认为也是一种弱的Watson-Crick配对(图1-A)。而
miR398和OsCSD2的配对程度较低一些, 但也有5
个G:U配对(图1-B)。因此, 在水稻中miR398的靶
基因同样是2个CSD基因。
2 OsCSD2基因的克隆、定点突变及过表达载体
的构建
由图1可知, OsCSD2基因和miR398的互补配
对程度较低, 我们以OsCSD2 (基因ID为D85239)为
研究对象。OsCSD2基因的cDNA预期长度为863
bp, 采用RT-PCR, 获得符合预期大小的目的条带
(图2-A)。将目的产物纯化后, 构建入克隆载体
pUC18质粒中, 经测序, 与数据库中的序列完全一
致, 表明我们成功克隆出了该基因。研究表明, 随
着microRNA和其靶基因互补程度的大幅降低, 可
消除microRNA对其抑制(Tang等2003)。为了避免
miR398对OsCSD2的干扰, 根据阅读框密码子的兼
并性, 我们在miR398作用OsCSD2的位点引入了5
个突变碱基, 但没有改变氨基酸的顺序(图2-B)。
采用试剂盒成功诱变后, 我们将获得的突变目的
基因(称为OsmCSD2)导入由Ubi1启动子驱动的表
达载体pCAMBIA 1301中 , 成功获得过表达抗
miR398的OsCSD2的表达载体(图2-C)。如同35S在
双子叶植物中一样, Ubi1启动子是单子叶植物最有
力的一个组成型启动子(Comejo等1993)。
3 转化植株的获得
将构建好的OsmCSD2过表达载体导入农杆菌
EHA105, 转化新鲜的水稻胚性愈伤, 经潮霉素筛
选, 得到很多新的愈伤组织, 在含有潮霉素的N6D
培养基上多次继代后, 愈伤组织长出绿点, 移入同
样含有潮霉素的分化培养基上分化小苗, 成功获
得系列转基因小苗。将再生的小苗在生根培养基
上生根壮苗, 之后转入网室, 进行盆栽, T0代转Os-
mCSD2植株在自然状况下生长良好。
4 转化植株的分子鉴定
T0代转化株系在长日照下完成生育期, 并开
图1 OsmiR398与OsCSD1和OsCSD2序列比较
Fig.1 Comparion of the sequencs of OsmiR398
with OsCSD1 and OsCSD2
A: OsmiR398a、OsmiR398b与OsCSD1的序列比较; B: Os-
miR398a、OsmiR398b与OsCSD2的序列比较。同源序列和互补序
列用黑色阴影表示, G:U配对用灰色阴影表示, 错配和不同源的没
有阴影。
图2 OsCSD2基因的克隆、诱变及过表达载体的构建
Fig.2 Cloning, mutation and construction of over-expressional victor of OsCSD2
A: RT-PCR扩增OsCSD2基因; 0泳道为分子量对照; 1泳道为克隆的靶基因。B: 定点突变OsCSD2基因, 根据其密码子的兼并性, 引入
突变碱基, 突变基因为OsmCSD2, 突变碱基用灰色字母表示。C: 突变基因嵌入由Ubi1启动子驱动的表达载体中。
鲁玉柱等: 过表达抗miR398的OsmCSD2基因提高水稻的重金属抗性 1067
花结子, 得到T1代转化种子。用潮霉素筛选具有抗
性的T1代转基因植株, 作为潜在的阳性植株。进一
步获得通过PCR可扩增出潮霉素基因片段的株系,
表明确有外源片段的进入。待阳性转基因株系生
长10 d后, 选取其中4个株系(编号为5、8、15和18)
的幼苗提取总RNA进行Northern分析, 以野生型作
对照。结果(图3)表明, 转基因株系中OsCSD2的
mRNA表达强度均高于野生型。有趣的是, OsC-
SD1的mRNA表达强度比野生型的有所下降, 说明
OsCSD2基因的过表达同时抑制了另外一个同源
基因的表达。这表明, 我们获得了一系列OsCSD2
基因的过表达植株。
含量显著升高, 而OsmCSD2过表达植株的H2O2含
量并未明显变化; 胁迫24 h内, 野生型H2O2含量急
剧上升, 之后缓慢上升, 而OsmCSD2过表达植株在
48 h内只有轻微的上升(图4-B)。这进一步说明Os-
mCSD2过表达植株具有良好的清除铜胁迫下活性
氧的能力。
随着工农业的现代化发展, 土壤重金属污染
日益严重。因而通过定向改良作物品性来提高作
物忍耐重金属胁迫的能力已成为分子育种的紧迫
课题。CSD基因的功能在拟南芥中已得到深入的
研究, 发现它们在多种胁迫下具有清除ROS的能力
(Tsang等1991; Scandalios 1993; Kim等1996; Klie-
benstein等1998)。近年来, 关于CSD基因受miR398
调节的机制已得到深入的研究(Abdel-Ghany和Pi-
lon 2008; Sunkar等2006; Dugas和Bartel 2008; Jag-
adeeswaran等2009; Yamasaki等2007)。
我们已经进行了多年的水稻microRNA转基
图4 野生型和OsCSD2过表达植株对铜胁迫的响应
Fig.4 Response to copper stress of wild type and transgenic
lines of over-expression of OsCSD2
A: 铜胁迫1周后野生型和OsmCSD2过表达植株的表型; B: 铜
胁迫下野生型和OsmCSD2过表达植株的H2O2含量。
图3 转基因株系的Northern分析
Fig.3 Northern analysis of transgenic lines
野生型(WT)作为表达对照, rRNA作为上样量对照, 5、8、15
和18为转基因株系的编号。
5 铜胁迫下转基因水稻株系的生长与H2O2含量测定
铜胁迫是土壤各类重金属胁中具有代表性的
一种。铜胁迫3 d后, 野生型幼苗叶片开始发黄, 而
OsmCSD2过表达植株仍然生长正常。1周后, 野生
型植株枯萎, 而OsmCSD2过表达植株仅仅叶片外
部边缘稍稍发黄(图4-A)。该结果表明OsmCSD2过
表达植株具有良好的抗重金属能力。
植物在各种胁迫下, ROS含量的升高可能是
植物遭受伤害的原因(Mittler 2002)。业已证明拟
南芥CSD基因具有清除活性氧的能力(Sharma和
Davis 1997; Kliebenstein等1998)。生物体内的活性
氧包括H2O2(过氧化氢)、O2¯·
(超氧离子)、OH- (羟
自由基)等(Bartels和Sunkar 2005)。在铜胁迫4、
8、16、24和48 h分别检测野生型和转基因株系的
H2O2含量。结果表明, 铜胁迫4 h时, 野生型的H2O2
植物生理学报1068
因工作 , 并获得了一些转基因株系 (鲁玉柱等
2009b)。尽管在过表达OsmCSD2株系中OsCSD1
的表达受到了抑制, 但转基因株系和野生型在自
然状况下没有明显的差异 , 说明在自然状况下
OsCSD1表达的降低不影响水稻的生长发育; 在重
金属胁迫下, 转基因株系体现出良好的抗重金属
能力(图4), 说明OsCSD1表达的降低没有影响到转
基因株系的抗性, 这可能是由于OsCSD2的过表达
幅度大大高于OsCSD1表达的降低所致(图3), 因而
它弥补了OsCSD1功能的衰减。
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