全 文 ：植物营养与肥料学报 ２０１６，２２（３）：７３６－７４３ ｄｏｉ牶１０１１６７４／ｚｗｙｆ．１４５５４
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｎｕｔｒｉｆｅｒｔ．ｏｒｇ
收稿日期：２０１４－１２－０８ 接受日期：２０１５－０５－２８ 网络出版日期：２０１５－０９－２９
基金项目：福建省大宗蔬菜产业体系（２０１２Ｋ８３１３９２９４）；福建省自然科学基金（２０１２ｊ０１０８２）；福建农林大学校重点建设项目（６１１２ｃ０４０９）资助。
作者简介：叶丽萍（１９８９—），女，福建浦城人，硕士研究生，主要从事蔬菜遗传育种方面的研究。Ｅｍａｉｌ：ｙｅｌｉｐｉｎｇ１２０２＠１６３ｃｏｍ
通信作者 Ｅｍａｉｌ：ｌｙｚ２００３００７＠１６３ｃｏｍ
外源 ＮＯ对铜胁迫下小白菜 ＳＢＰａｓｅ基因
表达特性及其光合速率的影响
叶丽萍，钟凤林，林义章，林琳琳
（福建农林大学园艺学院，福州 ３５０００２）
摘要：【目的】本研究通过克隆小白菜光合暗反应中限制核酮糖－１，５－二磷酸（ＲｕＢＰ）再生的关键酶景天庚酮糖
－１，７－二磷酸酶（ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅ１，７ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＳＢＰａｓｅ）基因，分析铜胁迫及添加外源一氧化氮（ＮＯ）供体硝普
钠（ＳＮＰ）缓解铜胁迫时该基因的表达情况，并将其与对应处理下小白菜净光合速率（Ｐｎ）的变化情况结合在一起进
行分析，以期为全面了解外源ＮＯ缓解铜胁迫植物光合作用机理提供理论依据。【方法】以小白菜品种“上海青”３
４片真叶大的幼苗为材料，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆小白菜ＳＢＰａｓｅ基因，铜处理浓度为２００μｍｏｌ／Ｌ，外源 ＮＯ供
体ＳＮＰ浓度为３００μｍｏｌ／Ｌ，同时设置相关的４个对照组排除其他可能因素的干扰，在添加处理液后的０、４、８、１２
ｄ上午九点测定各处理小白菜相同节位叶片的净光合速率，并利用实时荧光定量ＰＣＲ技术检测在对应的处理时间
及对应节位小白菜叶片中ＳＢＰａｓｅ基因的表达情况。试验环境条件为光照强度２００μｍｏｌ／（ｍ２·ｓ），光周期１２ｈ，温
度２５℃／１８℃。【结果】１）克隆得到小白菜ＳＢＰａｓｅ基因（Ｇｅｎｂａｎｋ登录号：ＡＨＹ１８９７４１），开放阅读框为１１８２ｂｐ，编
码３９３个氨基酸，蛋白质分子量为４２３４ｋＤ，理论等电点为５８５。２）序列分析表明其含有氧化还原活性位点，包含
一个具有５９个氨基酸残基的叶绿体转移肽序列。小白菜 ＳＢＰａｓｅ基因推导的氨基酸序列与其他物种中已分离的
ＳＢＰａｓｅ编码的氨基酸序列具有很高的同源性。３）实时荧光定量 ＰＣＲ分析表明，ＳＢＰａｓｅ基因在铜胁迫下的小白菜
叶片中表达量下降，且随着胁迫时间的延长下降程度加剧；而在铜胁迫的基础上添加外源ＮＯ可以在一定程度上缓
解铜胁迫引起的小白菜叶中ＳＢＰａｓｅ基因表达量的下降。４）铜胁迫下小白菜叶片Ｐｎ显著下降，且随着胁迫时间的
延长，Ｐｎ下降加剧，施加外源ＮＯ后Ｐｎ的下降得到一定程度的缓解，各处理下 Ｐｎ的变化与 ＳＢＰａｓｅ基因表达量变
化趋势一致。【结论】铜胁迫及在铜胁迫的基础上添加外源ＮＯ后小白菜叶片中ＳＢＰａｓｅ基因表达量的变化，可能是
影响对应条件下小白菜叶片的净光合速率变化的原因之一。
关键词：小白菜；铜胁迫；一氧化氮；景天庚酮糖－１，７－二磷酸酶；实时荧光定量ＰＣＲ
中图分类号：Ｓ６３４３６０１；Ｑ９４５７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－５０５Ｘ（２０１６）０３－０７３６－０８
ＥｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎＳＢＰａｓｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄ
ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｒａｔｅｏｆＢｒａｓｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｕｎｄｅｒｃｏｐｐｅｒｓｔｒｅｓｓ
ＹＥＬｉｐｉｎｇ，ＺＨＯＮＧＦｅｎｇｌｉｎ，ＬＩＮＹｉｚｈａｎｇ，ＬＩＮＬｉｎｌｉｎ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０００２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ】Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆ
ａｄｄｉｎｇｅｘｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ（ＮＯ）ｔｏａｌｅｖｉａｔｅｔｈｅｄｅｃｌｉｎｅｏｆｎｅｔｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｒａｔｅ（Ｐｎ），ｔｈｅｇｅｎｅｏｆ
ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅ１，７ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＢＰａｓｅ）ｗｈｉｃｈｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓｔｏｒｅｓｔｒｉｃｔＲｕＢＰｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎ
ｃａｌｖｉｎｃｙｃｌｅｗａｓｃｌｏｎｅｄ，ａｎｄｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＳＢＰａｓｅｇｅｎｅｉｎＢｒａｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｌｅａｖｅｓｕｎｄｅｒ
ｃｏｐｐｅｒｓｔｒｅｓｓａｎｄａｄｄｉｎｇｔｈｅＳＮＰｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｅｔｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｒａｔｅｃｈａｎｇｅｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】
ＴｈｅＳＢＰａｓｅｇｅｎｅｏｆＢｒａｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ，ａｎｄｓｅｅｄｌｉｎｇｓｏｆＢｒａｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．（ｎａｍｅｄ
Ｓｈａｎｇｈａｉｇｒｅｅｎ）ｗｉｔｈｔｈｒｅｅｔｏｆｏｕｒｒｅａｌｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｃｏｐｐｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ２００μｍｏｌ／Ｌ，ａｎｄ
ｔｈｅＳＮＰｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ３００μｍｏｌ／Ｌ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｆｏｕｒｒｅｌａｔｅｄｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｓｅｔｔｏｅｘｃｌｕｄｅｔｈｅｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ
３期 叶丽萍，等：外源ＮＯ对铜胁迫下小白菜ＳＢＰａｓｅ基因表达特性及其光合速率的影响
ｆａｃｔｏｒｓ．ＴｈｅＰｎａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＢＰａｓｅｇｅｎｅｏｆＢｒａｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｌｅａｖｅｓａｔｔｈｅｓａｍｅｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｍｏｍｅｎｔ
ａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ０，４，８ａｎｄ１２ｄａｙｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗｅｒｅ
ｌｉｇｈｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，２００μｍｏｌ／（ｍ２·ｓ）；ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ，１２ｈ；ａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，２５℃／１８℃．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】１）Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆＳＢＰａｓｅｇｅｎｅｉｓ１１８２ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ３９３ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅ
ｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓ４２３４ｋＤａｎｄｔｈｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｉｓ５８５２）Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｔｈａｔｉｔ
ｃｏｎｔａｉｎｓａｒｅｄｏｘａｃｔｉｖｅｓｉｔｅａｎｄａ５９－ａｍｉｎｏａｃｉｄｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｔｒａｎｓｆｅｒｐｅｐｔｉｄｅ．Ｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｈａｓｈｉｇｈ
ｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｏｔｈｅｒＳＢＰａｓｅｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ．３）ＴｈｅｑＲＴ－ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅＳＢＰａｓｅｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＢｒａｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｌｅａｖｅｓｉｓｄｅｃｌｉｎｅｄｕｎｄｅｒｃｏｐｐｅｒｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄｗｉｔｈｔｉｍｅｅｘｔｅｎｄｉｎｇｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆ
ｄｅｃｌｉｎｅｉｓａｇｇｒａｖａｔｅｄ．Ｂｅｓｉｄｅｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＢＰａｓｅｇｅｎｅｉｓｉｎｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆＮＯ．４）Ｔｈｅ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓＮＯｉｎｃｒｅａｓｅｓｔｈｅＰｎｏｆＢｒａｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｌｅａｖｅｓｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｐｐｅｒｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄｔｈｅ
ｖａｒｉａｔｉｏｎｔｅｎｄｅｎｃｙｏｆＰｎａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＢＰａｓｅｇｅｎｅａｒｅｉｎａｇｏｏｄａｇｒｅｅｍｅｎｔ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ】Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆＳＢＰａｓｅｇｅｎｅｉｎＢｒａｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｌｅａｖｅｓｉｓｃｈａｎｇｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｐｐｅｒｓｔｒｅｓｓａｎｄｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆＮＯ，ｗｈｉｃｈ
ｍａｙｂｅｏｎｅｏｆｔｈｅｃａｕｓｅｓｏｆｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆＰｎｉｎＢｒａｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｐｐｅｒｓｔｒｅｓｓａｎｄｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎ
ｏｆＮＯ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ牶ＢｒａｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．牷ｃｏｐｐｅｒｓｔｒｅｓｓ牷ＮＯ牷ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅ１牞７ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ牷ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ
光合作用是植物生长发育的基础，它的强弱对
于植物的生长、产量及抗逆性有着重要的影响。光
合暗反应又称为卡尔文循环，是高等植物碳固定的
基本途径，其反应过程由ＲｕＢＰ为起点至ＲｕＢＰ再生
结束。景天庚酮糖 －１，７二磷酸酶（ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅ
１，７－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）是限制光合作用卡尔文循环
中ＲｕＢＰ再生速率的关键酶，也是植物光合作用途
径的主要限速酶之一［１］。ＣＯ２受体 ＲｕＢＰ由景天庚
酮糖－７－磷酸转变而来，景天庚酮糖 －７－磷酸由
ＳＢＰａｓｅ酶不可逆地催化景天庚酮糖 －１，７－二磷酸
去磷酸化生成［２］。前人研究表明［３－５］，将 ＳＢＰａｓｅ基
因反向导入烟草中，发现ＳＢＰａｓｅ活性的微小下降即
可导致反义转基因植株碳同化速率的显著下降，植
株生长受到抑制。Ｌａｗｓｏｎ等［６］研究表明，当 ＳＢＰａｓｅ
活性或ＳＢＰａｓｅ基因表达量下降时，植物的光合能
力，生长速度以及生物量的积累均下降。可见
ＳＢＰａｓｅ酶对光合作用强弱起着重要的调控作用。
铜是植物生长发育所必需的微量元素，但是过
量的铜却会对植物产生毒害作用［７］。近年来随着
农业生产上含铜杀菌剂的频繁使用、铜矿的过度开
采及工业生产中含铜污染物的大量排放，使得土壤
中的铜含量越来越高，影响着蔬菜的品质和产
量［８－１１］。植物受到铜胁迫后叶绿体结构发生明显变
化，光合速率明显下降［１２］。外源 ＮＯ是一种生物活
性气体分子［１３］，研究表明其在保护植物抵抗重金属
毒害等非生物胁迫引起的植物光合作用的下降方面
有着重要的作用［１４－１６］。
目前，关于外源 ＮＯ缓解铜胁迫下植物光合作
用的相关研究主要集中在植物形态及生理生化指标
变化方面，研究表明［１４，１７－１８］施加适宜浓度的外源
ＮＯ可以显著提高番茄、玉米、黄瓜、油菜在铜、镉
胁迫下的净光合速率，但关于外源 ＮＯ对铜胁迫下
植物光合碳同化过程重要酶对应基因的表达是否产
生影响，及其变化情况与光合作用变化的对应关系
研究较少。小白菜（ＢｒａｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．）为十字花
科芸薹属蔬菜，营养丰富、味道鲜美，适应性强，四
季均有，栽培周期短，广泛栽培，备受人们喜爱。本
研究以小白菜为试验材料，克隆小白菜的ＳＢＰａｓｅ基
因序列，并研究外源 ＮＯ对铜胁迫下小白菜 ＳＢＰａｓｅ
基因表达量的变化与小白菜光合速率的对应关系的
影响，为全面了解外源 ＮＯ缓解铜胁迫植物光合作
用机理提供一定的理论依据。
１ 材料与方法
１１ 试验材料
试验在福建农林大学园艺学院温室内进行。供
试小白菜品种为“上海青”，采用穴盘育苗，待幼苗
长到３ ４片真叶时，选取生长一致、健壮的幼苗将
其移至装有１２Ｌ通用叶菜类水培营养液的塑料盆
中，每盆１８株，缓苗５ｄ后移入处理液中。ＮＯ供体
ＳＮＰ购自 Ｓｉｇｍａ公司。处理条件为光照强度 ２００
μｍｏｌ／（ｍ２·ｓ）、光周期１２ｈ、温度２５℃／１８℃。
１２ 试验设计
试验共设 ６个处理：１）对照，完全营养液
（ＣＫ）；２）２００μｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４·７Ｈ２０（Ｃｕ）；３）２００
μｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４·７Ｈ２０＋３００μｍｏｌ／ＬＳＮＰ（Ｃｕ＋Ｓ）；
７３７
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２２卷
４）２００μｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４·７Ｈ２０＋３００μｍｏｌ／ＬＮａＮＯ２
＋３００μｍｏｌ／ＬＮａＮＯ３（Ｃｕ＋Ｎ）；５）２００μｍｏｌ／Ｌ
ＣｕＳＯ４·７Ｈ２０＋３００μｍｏｌ／ＬＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］（Ｃｕ＋
Ｆ）；６）２００μｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４·７Ｈ２０ ＋３００μｍｏｌ／Ｌ
ＳＮＰ＋２５μｍｏｌ／ＬＮｉｔｒｏＬａｒｇｉｎｉｎｅ（ＮＯ抑制剂）（Ｃｕ
＋Ｓ＋Ｌ）。每个处理设３次重复，每４ｄ更换一次营
养液（每次取样后更换营养液），在处理后的０、４、
８、１２ｄ上午九点测定各处理植株第３片完全展开
的功能叶的净光合速率，并取相同节位的功能叶用
液氮速冻后保存于－８０℃的冰箱中备用。
１３ 测定项目与方法
１）小白菜叶片净光合速率测定 采用美国生
产的ＣＩ３４０便携式光合测定仪，于上午九点测定植
株第３片完全展开的功能叶的净光合速率（Ｐｎ）。
２）小白菜叶片总 ＲＮＡ提取与 ｃＤＮＡ合成 采
用 Ｔｒｉｚｏｌ法提取小白菜叶片总 ＲＮＡ（Ｔｒｉｚｏｌ购于
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司），并对所获得的总 ＲＮＡ进行电泳检
测和 ＯＤ值的测定。利用 ＲｅｖｅｒｔＡｉｔＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ试剂盒（Ｔｈｅｒｍｏ公司），将所提取
的质量较高的ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ，作为模板。
３）ＳＢＰａｓｅ基因的克隆 ＲＴＰＣＲ引物序列为，
ＳＢＰａｓｅＦ： ５′ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＣＧＴＧＣＴ３′；
ＳＢＰａｓｅＲ：５′ＡＧＴＴＴＣＴＡＡＧＣＧＧＴＡＡＣＴＣＣ３′。
ＲＴＰＣＲ反应体系为：反应体系为１μＬｃＤＮＡ、
１μＬＳＢＰａｓｅＦ、１μＬＳＢＰａｓｅＲ、２５μＬ１０×Ｅｘ
ｔａｑｂｕｆｅｒ、０２μＬＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）、０５μＬｄＮＴＰ
（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、加ｄｄＨ２Ｏ至体积２５μＬ。ＲＴＰＣＲ反
应步骤：９４℃ ５ｍｉｎ；９４℃ ４５ｓ，５２℃ ４０ｓ，７２℃ ７５
ｓ，共３５个循环；７２℃ １０ｍｉｎ。
４）ＳＢＰａｓｅ基因的生物信息学分析 利用相关
软件分析小白菜 ＳＢＰａｓｅ编码的氨基酸序列，即用
Ｂｌａｓｔ（ｈｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）进
行同源序列搜索；用ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．
ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）预测基本的理化性质；用 ＰｒｏＳｃａｌ
（ｈｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／） 默 认 算 法
（Ｈｐｈｏｂ．／Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｌｅ）预测该蛋白的疏水性；用
ＳｉｇｎａｌＰ４１ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／
ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）预测信号肽；应用ＤＮＡＭＡＮ进行
序列比对；用ＭＥＧＡ５２构建系统进化树。
５）ＳＢＰａｓｅ基因的特异性表达分析 分别提取
处理０、４、８、１２ｄ的小白菜叶片总ＲＮＡ，控制用于
逆转录的 ＲＮＡ起始浓度相同，用 ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭШ
ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴＰＣＲ试剂
盒合成ｃＤＮＡ。利用小白菜 ａｃｔｉｎ为内参基因（引物
为ａｃｔｉｎｑＦ５′ＧＴＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＧＴＴＣ３′，ａｃｔｉｎ
ｑＲ５′ＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＣＧＴＣ３′）。根据
已得到的小白菜ＳＢＰａｓｅ基因的ＯＲＦ序列设计ｑＲＴ
ＰＣＲ特异性引物（ＳＢＰａｓｅｑＦ：５′ＡＧＧＴＧＧＧＴＴＴＡＧＴ
ＧＴＧＧＣＡＴＴＴＧ ３′，ＳＢＰａｓｅｑＲ：５′ＣＴＴＧＡＴＣＴＣＣ
ＴＣＣＣＧＴＧＡＣＴＣＣ３′）。用ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ试剂
盒进行ｑＲＴＰＣＲ检测该基因在不同处理、相同处
理不同处理时长的表达情况。
ｑＲＴＰＣＲ反应体系为：１μＬｃＤＮＡ、０４μＬ上
游引物、０４μＬ下游引物、１０μＬＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ
ＥｘＴａｑＴＭ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨＰｌｕｓ）、加 ｄｄＨ２Ｏ２至体积２０
μＬ。ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ反应步骤采用两步法，９５℃ １０
ｍｉｎ，９５℃ １５ｓ，５８℃ ３０ｓ（回到第二步共４０个循
环）。
２ 结果与分析
２１ 外源 ＮＯ对铜胁迫下小白菜叶片净光合速率
的影响
由图１可看出，与 ＣＫ相比，２００μｍｏｌ／Ｌ（Ｃｕ）
铜胁迫４ｄ后小白菜叶片 Ｐｎ出现明显的下降，且
随着胁迫时间的延长，Ｐｎ下降加剧。在铜胁迫的
基础上添加外源 ＳＮＰ后（即 Ｃｕ＋Ｓ），由铜胁迫引
起的小白菜 Ｐｎ的下降得到一定程度的缓解，但仍
低于 ＣＫ处理的小白菜叶片的 Ｐｎ。在添加外源
ＳＮＰ的同时添加 ＮＯ抑制剂处理（Ｃｕ＋Ｓ＋Ｌ）后，
ＳＮＰ的缓解效果被消除。在铜处理液中加入 ３００
μｍｏｌ／ＬＮａＮＯ２／ＮａＮＯ３（Ｃｕ＋Ｎ）或 ３００μｍｏｌ／Ｌ
Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］（Ｃｕ＋Ｆ），与只添加铜胁迫处理差
异不显著。说明外源 ＮＯ可以在一定程度上缓解
铜胁迫引起的小白菜 Ｐｎ的下降。ＳＮＰ分解的产
物除 ＮＯ外，还有 ＮＯ－２ ／ＮＯ
－
３ 和 Ｆｅ（ＣＮ）
２－
５ 等阴离
子，故在试验对照组中加入与 ＳＮＰ相同浓度的
ＮａＮＯ２／ＮａＮＯ３和Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］作为对照，二者在
本试验条件下均不能产生 ＮＯ。
２２ ＳＢＰａｓｅ基因的克隆及序列分析
利用ＲＴ－ＰＣＲ技术获得ＳＢＰａｓｅ基因开放阅读
框的ｃＤＮＡ序列（图２），长为１１８２ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登录
号：ＡＨＹ１８９７４１），推测其编码３９３个氨基酸，含有
起始密码子ＡＴＧ和终止密码子ＴＡＧ（表１）。
２３ 生物信息学分析
用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 软件预测结果显示，小白菜
ＳＢＰａｓｅ基因编码的蛋白质分子量为４２３４ｋＤ，理论
８３７
３期 叶丽萍，等：外源ＮＯ对铜胁迫下小白菜ＳＢＰａｓｅ基因表达特性及其光合速率的影响
图１ 外源ＮＯ对铜胁迫下小白菜叶片净光合速率的影响
Ｆｉｇ．１ ＥｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎｔｈｅｎｅｔｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｒａｔｅｉｎｌｅａｖｅｓｏｆＢｒａｓｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｐｐｅｒｓｔｒｅｓｓ
［注（Ｎｏｔｅ）：柱上不同字母表示处理间差异达５％显著水平Ｄｉｆｅｒｅｎｔｌｅｔｅｒｓａｂｏｖｅｔｈｅｂａｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｔｔｈｅ５％ｌｅｖｅｌ．］
表１ 小白菜ＳＢＰａｓｅ基因核苷酸序列及推导氨基酸序列
Ｔａｂｌｅ１ ＮｕｃｌｅｏｔｉｏｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＢｒａｓｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ＳＢＰａｓｅ
序号 ＳＢＰａｓｅ基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列
９３７
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２２卷
图２ ＳＢＰａｓｅ基因ＯＲＦ区段扩增结果
Ｆｉｇ．２ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆＳＢＰａｓｅ
［注（Ｎｏｔｅ）：Ｍ—ＤＬ２０００；Ａ—ＳＢＰａｓｅ］
等电点为 ５８５，所带的正电荷总数（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为
３９，负电荷总数（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）为４３为碱性蛋白。理
论推导半衰期是３０ｈ，不稳定指数为３４１９，为稳定
蛋白。
利用 Ｅｘｐａｓｙ对蛋白质亲水性、疏水性进行分
析，结果显示，疏水性氨基酸占４２４４％，亲水性氨
基酸占５７５６，该蛋白为亲水性蛋白。由图３可以
看出，在图中所有的 ＳＢＰａｓｅ氨基酸序列中，有５个
Ｃｙｓ是保守的，其中的２和３形成ＣＧＧＴＡＣ结构，这
一结构被认为是很多酶的氧化还原活性位点，参与
光的调节反应［１９－２０］。由图３还可以发现，不同植物
的ＳＢＰａｓｅ氨基酸序列的Ｎ－末端同源性较低，但它
们都具有叶绿体蛋白转移肽的共同特征，即含有较
图３ 小白菜ＳＢＰａｓｅ基因推测的氨基酸序列与其他植物中该序列的同源性比对
Ｆｉｇ．３ ＡｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＢｒａｓｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ＳＢＰａｓｅｗｉｔｈｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ
［注（Ｎｏｔｅ）：ＮＰ００１２６７６５８１—黄瓜Ｃｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓ；ＸＰ００６３５５６５４１—马铃薯Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ；
ＮＰ１９１１３９１—拟南芥Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ；ＸＰ００２２６３０４９１—葡萄Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ；ＡＨＹ１８９７４１—小白菜 ＢｒａｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．］
多的丝氨酸，较少的天冬氨酸、谷氨酸。利用
ＣｈｌｏｒｏＰ１１ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎＳｅｒｖｅｒ分析发现，由小白菜
ＳＢＰａｓｅ基因推导的氨基酸序列含有一个包含５９个
氨基酸残基的叶绿体转移肽序列，这与前人的研究
结果一致［２，２１］。
将小白菜 ＳＢＰａｓｅ编码的蛋白与 ＧｅｎＢａｎｋ中登
录的１２个物种的 ＳＢＰａｓｅ蛋白进行聚类分析，构建
ＳＢＰａｓｅ进化树。结果如图４所示，小白菜ＳＢＰａｓｅ推
测的氨基酸序列与同为十字花科的拟南芥 ＳＢＰａｓｅ
的亲缘关系最近，同源性为 ９５６７％。同玉米的
ＳＢＰａｓｅ的亲缘关系最远，同源性为７３７５％。
２４ 外源ＮＯ对铜胁迫下小白菜叶片中ＳＢＰａｓｅ基
因表达特性的影响
由图 ５可以看出，２００μｍｏｌ／Ｌ的铜处理小白
菜，胁迫４ｄ时小白菜叶片中ＳＢＰａｓｅ基因的表达量
显著下降，且随着处理时间的延长小白菜叶片中
ＳＢＰａｓｅ基因的表达量下降程度加剧，而在铜胁迫的
基础上同时外施３００μｍｏｌ／Ｌ的ＳＮＰ处理（Ｃｕ＋Ｓ），
能提高铜胁迫下小白菜叶片ＳＢＰａｓｅ基因的表达量，
但其表达量仍低于对照处理。在添加ＮＯ抑制剂处
理后（Ｃｕ＋Ｓ＋Ｌ），ＳＮＰ的缓解效果被消除。在铜处
理液中加入３００μｍｏｌ／ＬＮａＮＯ２／ＮａＮＯ３（Ｃｕ＋Ｎ）或
０４７
３期 叶丽萍，等：外源ＮＯ对铜胁迫下小白菜ＳＢＰａｓｅ基因表达特性及其光合速率的影响
图４ 小白菜ＳＢＰａｓｅ氨基酸序列与其他物种ＳＢＰａｓｅ氨基酸序列的系统进化树分析
Ｆｉｇ．４ ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＢｒａｓｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ＳＢＰａｓｅｗｉｔｈｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ
图５ 外源ＮＯ对铜胁迫下小白菜叶片中ＳＢＰａｓｅ基因表达的影响
Ｆｉｇ．５ ＥｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＢＰａｓｅｉｎｌｅａｖｅｓｏｆＢｒａｓｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｐｐｅｒｓｔｒｅｓｓ
［注（Ｎｏｔｅ）：柱上不同字母表示差异达５％显著水平Ｄｉｆｅｒｅｎｔｌｅｔｅｒｓａｂｏｖｅｔｈｅｂａｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｔｔｈｅ５％ｌｅｖｅｌ．］
３００μｍｏｌ／ＬＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］（Ｃｕ＋Ｆ），与只添加铜胁
迫处理的差异不显著。说明外源ＮＯ可以在一定程
度上缓解铜胁迫引起的小白菜叶片中 ＳＢＰａｓｅ基因
表达量的下降。
３ 讨论
前人研究表明，在烟草、番茄、水稻中 ＳＢＰａｓｅ
基因表达量下降及酶活下降时，其净光合能力、生
长速度及生物量的积累都会明显下降［３－６］，表明
ＳＢＰａｓｅ基因表达量及酶活的变化会对植物光合作
用的变化产生相应的影响。Ｗａｎｇ等［１５］研究表明低
温胁迫下，番茄叶片的ＳＢＰａｓｅ基因表达量及ＳＢＰａｓｅ
酶活性降低，且番茄叶片的 Ｐｎ出现同样的变化趋
势，表明部分非生物胁迫引起的植物叶片中的
ＳＢＰａｓｅ基因表达量下降，是植物在对应胁迫下光合
速率下降的原因之一。本研究结果表明，铜胁迫４ｄ
就会引起小白菜叶片中的 ＳＢＰａｓｅ基因表达量出现
显著的下降，且随着胁迫时间的延长，ＳＢＰａｓｅ表达
量下降加剧；在铜胁迫４ｄ时小白菜叶片的Ｐｎ也降
低，且随着胁迫时间的延长 Ｐｎ下降加剧，即小白菜
受到铜胁迫时ＳＢＰａｓｅ表达量与Ｐｎ的值均呈下降趋
势。在铜胁迫的基础上施加适宜浓度的 ＳＮＰ处理
后小白菜叶片的ＳＢＰａｓｅ的表达量增加，且小白菜叶
片中Ｐｎ也出现同样的升高趋势。崔金霞［２２］研究也
表明适宜浓度的ＳＮＰ处理，可以提高黄瓜叶片中多
个参与卡尔文循环过程的酶对应基因的表达水平。
本研究结果表明小白菜叶片中 ＳＢＰａｓｅ表达量的变
化可能是引起小白菜在铜胁迫及铜胁迫的基础上添
加外源ＮＯ时小白菜叶片净光合速率出现相应的降
低或升高的原因之一。
１４７
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２２卷
ＮＯ缓解植物逆境胁迫的生理效应往往与其对
ＲＯＳ代谢的调控有关，并涉及有关的信号转导。王
丽娜等［２３］研究表明，外源 ＮＯ显著提高了铜胁迫下
番茄幼苗叶片保护酶编码基因 ｍＲＮＡ的表达量，诱
导保护酶同工酶的表达，提高了植株抵御铜毒害的
能力。陈蕤等［２４］研究表明，一定浓度的 ＮＯ供体
ＳＮＰ可以通过调节 ＣＡＴ、ＳＯＤ和 ＰＯＤ活性，抑制
Ｏ－２ 和Ｈ２Ｏ２生成，缓解百草枯对玉米胚根的胁迫。
推测在铜胁迫的基础上外源添加 ＮＯ时，小白菜叶
片中ＳＢＰａｓｅ基因表达量增加，可能是 ＮＯ诱导铜胁
迫下小白菜叶片保护酶及保护酶的同工酶的表达，
减少ＲＯＳ在其体内的累积，或通过诱发一系列信号
转导过程来调节一些基因的表达。但是铜胁迫使得
小白菜叶片中的ＳＢＰａｓｅ基因表达量下降，及在铜胁
迫基础上外源添加 ＮＯ后 ＳＢＰａｓｅ表达量增加的具
体调控机制尚不清楚，有待进一步研究。
参 考 文 献：
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３期 叶丽萍，等：外源ＮＯ对铜胁迫下小白菜ＳＢＰａｓｅ基因表达特性及其光合速率的影响
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［２１］ ＮｉｓｈｉｚａｗａＡ Ｎ，ＢｕｃｈａｎａｎＢ Ｂ．ＥｎｚｙｍｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎＣ４
ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｌｉｎｋｅｄ
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［２２］ 崔金霞．一氧化氮和ＭＡＰＫ在油菜素内酯诱导黄瓜抗氧化防
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ＰｈＤＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０
［２３］ 王丽娜，杨凤娟，王秀峰，等．外源 ＮＯ对铜胁迫下番茄幼
苗生长及其抗氧化酶编码基因 ｍＲＮＡ转录水平的影响［Ｊ］．
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ｅｎｚｙｍｅｍＲＮＡｉｎｔｏｍａｔｏｓｅｅｄｉｎｇｓｕｎｄｅｒｃｏｐｐｅｒｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ
ＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１０，３７（１）：４７－５２
［２４］ 陈蕤，崔盛，唐江川，等．ＮＯ对百草枯胁迫下玉米胚根氧化
损伤的效应［Ｊ］．云南农业大学学报，２００６，２１（４）：４７９
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ＣｈｅｎＲ，ＣｕｉＳ，ＴａｎｇＪＣ，ｅｔａｌ．Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｎｉｔｒｉｃ
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３４７