全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (4): 505–513　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0642 505
收稿 2016-02-26　　修定 2016-03-28
资助 国家自然科学基金(31160186)、新疆维吾尔自治区自然
科学基金(2015211C274)和国家“973”计划前期研究专项
(2012CB722204)。
* 通讯作者(E-mail: zeng_ylxju@126.com)。
盐穗木HcmiR172e和预测的靶基因HcTOE3的克隆及盐胁迫下的靶向关
系分析
张玉芳, 杨瑞瑞, 曾幼玲*
新疆大学生命科学与技术学院, 新疆生物资源基因工程重点实验室, 乌鲁木齐830046
摘要: 盐穗木(Halostachys caspica)广泛分布于新疆干旱盐碱地区, 属于藜科极端耐盐的盐生灌木。从600 mmol·L-1 NaCl处
理48 h的盐穗木根的小RNA文库中筛选到差异极显著的HcmiR172e做为研究对象, 利用盐穗木转录组数据预测其靶基因为
HcTOE3, 开展HcmiR172e-HcTOE3的分子克隆和胁迫表达相关性工作。通过同源克隆和RACE技术获得盐穗木HcmiR172e
前体和HcTOE3全长序列; 使用生物信息软件分析前体和靶基因信息及相关性; 采用qRT-PCR技术检测了不同盐浓度(200、
400和600 mmol·L-1 NaCl)处理48 h的盐穗木HcmiR172e及预测的靶基因HcTOE3的表达变化。结果显示, 克隆得到的Hc-
miR172e前体序列可形成颈环结构, 各项指标符合前体要求。其靶基因HcTOE3 cDNA全长为1 744 bp, 开放阅读框1 329 bp,
在编码区有一个高度匹配HcmiR172e的结合位点(CTGCAGCATCATCAGGATTC); qRT-PCR分析结果表明HcmiR172e与其
预测的靶基因HcTOE3均响应盐的处理, 二者呈现一定的负相关性。后续将通过实验逐步阐明盐穗木HcmiR172e对Hc-
TOE3在逆境中的靶向调控作用。
关键词: 盐穗木; 盐胁迫; HcmiR172e; HcTOE3; 克隆; qRT-PCR; 相关性
植物microRNA (miRNA)是一类长约21 nt的
非编码RNA, 通过对靶mRNA的切割或翻译抑制
来调节基因的表达(Cui等2014)。植物miRNA的靶
基因大多为转录因子等具有调控功能的基因, 在
植物生长发育进程及对多种胁迫应激反应中具有
重要调节作用(Khraiwesh等2012)。
miR172是极度保守的一类miRNA, 最早在拟
南芥中检测到 , 随后在多种植物中也相继报道
(Park等2002)。miR172可通过对靶mRNA的切割
或翻译抑制来调控靶基因的表达, 其靶基因编码
的蛋白为APETALA2 (AP2)及AP2-like的转录因子
[TARGET OF EAT1-3 (TOE1-3)、SCHLAFMÜTZE
(SMZ)和SCHNARCHZAPFEN (SNZ)] (Schwab等
2005)。AP2是一类重要的与植物花发育相关的转
录因子, 具有特殊的AP2结构域, 参与植物的生长
发育及多种生理生化反应(Prunet等2015; Wuddineh
等2015)。miR172通过调节其靶基因调控植物由营
养生长到生殖生长的过渡。在拟南芥中除TOE3外,
miR172的其他靶基因均能作为植物开花抑制子,
即过量表达这些靶基因能造成植物的开花延迟
(Jung等2014)。而TOE3能影响花器官的形成, 但不能
延迟植物的开花时间。在拟南芥多突变体(ap2-12、
toe1、toe2、toe3-1、smz和snz)中, 与野生型植株相
比, 突变体植株高产并且提前开花(Yant等2010)。
miR172也响应多种逆境胁迫, 面包小麦经过干旱
胁迫后, miR172相对表达量差异显著(Akdogan等
2015); 南瓜幼苗的miR172响应盐胁迫(Xie等2015);
大豆的miR172c可调节根瘤菌的侵染、根瘤器官的
形成以及结节数量的控制(Wang等2014)等。
目前miRNA的研究主要在拟南芥、水稻和大
豆等甜土植物中开展, 而在真盐生植物中鲜见报
道。新疆具有丰富的盐生植物资源。盐穗木(Ha-
lostachys caspica)属藜科(Chenopodiaceae)盐穗木
属, 是茎和叶高度肉质化的极端耐盐的多年生盐
生灌木, 生长于干旱盐碱荒漠地区, 对盐分的适应
性极强(Zeng等2015)。基于本课题组前期构建的
高盐胁迫下盐穗木根的小RNA文库(Yang等2015),
本研究以受盐胁迫表达差异显著的miR172e及其
预测的靶基因TOE3为研究对象, 利用同源克隆和
RACE技术获得盐穗木miR172e前体(pre-HcmiR172e)
序列和HcTOE3全长, 前体序列经Mfold生物软件
预测可形成颈环二级结构, 靶基因编码的蛋白序列
经BLAST同源比对, 与甜菜TOE3最为相似; 并通过
qRT-PCR技术对盐胁迫下盐穗木miR172e和预测的
靶基因TOE3进行了相关性分析, 后续将通过遗传
转化拟南芥进一步解读盐穗木miR172e-TOE3的耐
盐生物学功能和机制。
植物生理学报506
材料与方法
1 实验材料
实验所用盐穗木[Halostachys caspica (Bieb.)
C. A. Mey.]种子采集于古尔班通古特沙漠103团野
外盐碱地(87.31°E, 44.29°N)。挑选籽粒饱满的种
子播种于有基质(珍珠岩:蛭石:花土=1:1:2)的花盆
中, 采用室外自然光(16 h光照/8 h黑暗)、温度25~
28°C的条件下培养90 d左右。将培养一致的盐穗
木幼苗分为对照组和处理组 (200、400和600
mmol·L-1 NaCl溶液), 并给予相同水量淋浇处理, 以
保证植株各处理浓度稳定, 48 h后, 取其同化枝, 每
处理3份重复样品, 液氮速冻并保存于–80°C冰箱。
2 实验方法
2.1 盐穗木总RNA提取及cDNA合成
称取200 mg NaCl处理的盐穗木同化枝, 利用
植物总RNA提取试剂盒(DP432, Tiangen)和RNA-
Free DNase I (D2270A, TaKaRa, Japan)的试剂盒操
作说明提取植物总RNA。
按照SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒
(634923, Clontech)要求, 以RNA为模板, 反转录合
成5′-RACE-Ready-cDNA和3′-RACE-Ready-cDNA,
用于靶基因RACE的克隆。根据M-MLV Reverse
Transcriptase试剂盒(2641A, TaKaRa, Japan), 采用
Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链, 用于全长
基因的克隆。按照SYBR® PrimeScript™ miRNA
RT-PCR 试剂盒(RR716, TaKaRa, Japan)操作指南,
以盐穗木总RNA为模板, 利用poly A加尾法进行反
转录合成cDNA, 用于miRNA的qRT-PCR实验。
2.2 HcmiR172e前体及靶基因HcTOE3的克隆
根据高盐胁迫盐穗木根的小RNA文库和转录
组数据, 候选了显著差异表达的HcmiR172e及预测
的靶基因HcTOE3的EST序列。由miRBase数据库
中不同物种[拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米
(Zea mays)、毛果杨(Populus trichocarpa)、大豆
(Glycine max)、琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)、
油棕(Elaeis guineensis)、亚麻(Linum usitatissimum)、
烟草(Nicotiana tabacum)、木薯(Manihot esculenta)
和马铃薯(Solanum tuberosum)]的pre-miR172e, 设
计同源克隆的前体引物(miR172e-F和miR172e-R)
(表1), 再由同源克隆获得的序列设计5′-RACE引物
表1 实验所用引物序列
Table 1 Primer sequences used in the all experiments
名称 引物 引物序列(5′→3′)
miR172e miR172e-F TGCAGATGCAGCATCATCAAGATTC
miR172e-R ATGCAGCATCATCAAGATTCCCA
miR172e-5′RACE-GSP AGGGGGCTTTAAGAAATAAATGTGGTTCC
miR172e-5′RACE-NGSP CTCAAGGAGAAGCGTAGGATGTG
HcmiR172e-F (KpnI) GGTACCCCGCTGCAGCATCAT
HcmiR172e-R (BamHI) GGATCCATGCAGCATCATCAAG
TOE3 HcTOE3 5′RACE-Outer CGTGAGCTCCTTGCTGTTGGATT
HcTOE3 5′RACE-Inner ATGCACGACCACGACCATGATGA
HcTOE3 3′RACE-Outer ATGGTCGTGGTCGTGCATTCC
HcTOE3 3′RACE-Inner GCATCATCAGGATTCCCTTCAATC
HcTOE3 ORF-F (KpnI) GGTACCATGTTGGATCTTAATCT
HcTOE3 ORF-R (BamHI) GGATCCTCAGTTAGATAAGTG
UPM (Long) CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
UPM (Short) CTAATACGACTCACTATAGGGC
NUP AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
qRT-PCR RmiR172e CGGGGAATCTTGATGATGCTGCAT
RHcTOE3-P1 AGGTTACCCTTCTGCCTGGAGT
RHcTOE3-P2 GCTGAAGAAGCAGTTGTGATTG
Hc5S-P1 ACCCGATCCCATTCCGAC
Hc5S-P2 TGTCTCCCGAACAATCTCAGTAC
Hcβ-actin-P1 AAGATCTGGCACCACACCTTC
Hcβ-actin-P2 CACACCATCACCAGAATCGA
张玉芳等: 盐穗木HcmiR172e和预测的靶基因HcTOE3的克隆及盐胁迫下的靶向关系分析 507
(miR172e-5′RACE-GSP和miR172e-5′RACE-NG-
SP), 以此精确获得HcmiR172e前体的5′端序列, 随
后将HcmiR172e前体同源克隆片段与5′-RACE序列
拼接获得该基因序列, 并以此序列设计特异性引
物[HcmiR172e-F (KpnI)和HcmiR172e-R (BamHI)];
以盐穗木cDNA为模板, PCR反应条件: 95°C 5 min;
95°C 30 s, 58°C 30 s, 72°C 30 s, 35个循环; 72°C 7
min。反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, PCR
产物纯化回收后, 与pMD18-T (6011, TaKaRa, Ja-
pan)连接, 转化DH5α, 经菌液PCR扩增鉴定正确后,
送上海生工生物工程股份有限公司测序。
根据盐穗木转录组中预测的靶基因TOE3的
EST序列, 首先设计并利用5′-RACE引物(HcTOE3
5′RACE-Outer和HcTOE3 5′RACE-Inner), 3′-RACE
引物(HcTOE3 3′RACE-Outer和HcTOE3 3′RACE-
Inner)及试剂盒自带通用引物(NUP; UPM) (表1),
以5′-RACE-Ready-cDNA和3′-RACE-Ready-cDNA
为模板进行PCR扩增 , 获得3 ′-RACE末端及5 ′-
RACE末端产物。PCR产物回收后, 经连接、转化,
鉴定正确后送上海生工生物工程股份有限公司测
序。然后对靶基因HcTOE3的已知EST序列、5′-
RACE和3′-RACE 末端序列进行拼接, 获得该基因
的电子拼接全长序列, 并以此设计扩增开放阅读
框(ORF)的引物HcTOE3 ORF-F (KpnI)和HcTOE3
ORF-R (BamHI) (表1) ; 以盐穗木cDNA为模板,
PCR反应条件: 95°C 5 min; 95°C 30 s, 58°C 30 s,
72°C 1.5 min, 35个循环; 72°C 7 min。反应产物进
行琼脂糖凝胶电泳检测, PCR产物纯化回收后, 与
pEASY-T1 (CT101, TransGen Biotech)连接, 转化
DH5α, 菌液PCR扩增鉴定正确后送测序。
2.3 HcmiR172e前体及HcTOE3基因结构与序列分析
使用Mfold (http://mfold.rna.albany.edu/?q=m-
fold)在线软件对HcmiR172e前体二级结构预测。
利用ExPASy (http://expasy.org/tools/pi_tool.html)预
测HcTOE3蛋白的理化性质。利用NCBI CDD
(Conserved Domain Database)在线数据库(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析
靶基因编码蛋白的保守结构域。利用MEGA5.0软
件构建HcmiR172e和HcTOE3的系统进化树。
2.4 荧光定量检测盐胁迫下盐穗木HcmiR172e和
HcTOE3的表达模式
根据已知序列设计HcmiR172e引物(RmiR172e),
同时利用软件Primer Premier 5.0设计靶基因Hc-
TOE3引物(RHcTOE3-P1和RHcTOE3-P2)。以
M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒和SYBR® Pri-
meScript™ miRNA RT-PCR Kit试剂盒反转录合成
的cDNA为模板, HcmiR172e的表达量检测以Hc5s-
rRNA为内参基因, HcTOE3的表达量检测以Hcβ-
actin为内参基因, 使用ABI PRISM7500仪器实施各
样本的荧光定量PCR。每样本进行3次生物学重
复, 实验3次技术重复, 使用2-∆∆CT法分析数据, 并利
用软件Prism5.0作图分析HcmiR172e及靶基因Hc-
TOE3的表达模式。
实验结果
1 盐穗木HcmiR172e前体克隆和二级结构预测
从本课题组已构建的高盐胁迫下盐穗木根的
小RNA文库中 , 筛选得到表达显著上调的Hc-
miR172e成熟体序列, 其前体经同源克隆获得200 bp
序列, 5′-RACE巢式扩增获得210 bp片段, 再由二者
拼接的序列设计特异性引物, 获得pre-HcmiR172e
198 bp序列(图1)。该前体序列中成熟体与文库中
HcmiR172e成熟体一致, 利用Mfold软件预测该序
列的二级结构, 能形成颈环结构(图2); 最小折叠
自由能指数(MFEI)可从所有编码与非编码RNA
中区分miRNA, 该值高于0.85时极有可能为miR-
NA, 扩增序列经计算MFEI值约为1.11 (表2);
m i R N A成熟体在颈环二级结构的一条臂上 ;
miRNA成熟体和miRNA*双链的非对称凸起尺寸
小(1个或2个碱基), 频率少(1个或更少) (Meyers等
2008)。综上, 获得的序列符合植物pre-miRNA的
标准, 命名为pre-HcmiR172e。对miRBase中高粱
(SbimiR172e)、玉米(ZmamiR172e)、毛果杨(Ptc-
miR172e)、大豆(GmamiR172e)、可可树(TccmiR-
172e)、油棕(EgumiR172e)、亚麻(LusmiR172e)、
烟草(NtamiR172e)、苹果(MdmmiR172e)、香瓜
(CmemiR172e)、木薯(MesmiR172e)与盐穗木Hc-
miR172e成熟体比对, 结果表明miR172e成熟体在
不同物种中高度保守(图3)。通过MEGA5.0软件构
建盐穗木pre-HcmiR172e系统进化树, 结果显示不
同物种的pre-miR172e前体保守性不高(图4), 盐穗
木与拟南芥的前体序列聚为一类, 二者进化关系
较近。
植物生理学报508
表2 预测的pre-HcmiR172e作为前体的各项指标
Table 2 HcmiR172e potential precursor using Mfold software
prediction
名称 指标
miRNA pre-HcmiR172e
成熟体序列 GAAUCUUGAUGAUGCUGCAU
成熟体长度/nt 20
前体长度/nt 198
GC/% 40.4
MEF –88.6
MEFIs 1.11
2 HcmiR172e预测的靶基因HcTOE3的克隆和序
列分析
2.1 盐穗木HcTOE3基因的克隆
HcmiR172e预测的靶基因是HcTOE3, 根据Hc-
TOE3 EST序列(323 bp), 分别设计了5′-RACE和3′-
RACE巢式扩增引物, 并利用RACE技术获得了相
应的5′-RACE (1 228 bp)和3′-RACE (372 bp)末端
(图5)。使用DNAMAN软件对HcTOE3 EST序列和
RACE技术扩增获得的序列进行拼接, 并以此序列
设计扩增HcTOE3基因开放阅读框的特异性引物,
经PCR扩增获得预期大小的条带。测序正确后, 对
该基因和编码蛋白进行生物信息学分析。
图2 HcmiR172e前体颈环二级结构预测
Fig.2 Predicted secondary structure of HcmiR172e precursor
图中灰色阴影为miRNA成熟体。
图1 盐穗木HcmiR172e前体克隆
Fig.1 PCR amplification of the HcmiR172e precursor gene from H. caspica
A: HcmiR172e前体同源扩增; B: HcmiR172e 前体5′端扩增; C: HcmiR172e前体扩增; M: DL2000 Marker。
图3 盐穗木HcmiR172e成熟体与其他物种miR172e成熟体比对
Fig.3 The multiple alignment of mature sequences of
miR172e precursor between H. caspica and other plant species
张玉芳等: 盐穗木HcmiR172e和预测的靶基因HcTOE3的克隆及盐胁迫下的靶向关系分析 509
2.2 盐穗木HcTOE3基因序列分析
通过生物信息学分析, HcTOE3的cDNA全长
为1 744 bp, 包含5′-UTR非编码区145 bp, 开放阅读
框(ORF) 1 329 bp, 3′-UTR非编码区270 bp, ORF编
码442个氨基酸的蛋白质。通过在线软件EXPASy
对HcTOE3基因编码蛋白的理化性质分析, 结果表
明该蛋白的分子式为C2147H3276N620O670S11, 理论分
子量为48.8 kDa, 理论等电点为6.93, 脂肪系数为
62.51, 不稳定系数是44.01, 为不稳定蛋白。同时,
利用NCBI在线保守结构域数据库(CDD)分析Hc-
TOE3的保守结构域, 结果显示该蛋白属于AP2转
录因子超家族成员(图6), 含有2个AP2结构域。
AP2超家族是植物花发育中的一类重要参与因子,
在多种逆境胁迫中有重要作用, 可通过调节植物
激素来应对生物和非生物胁迫, 这些植物激素包
括乙烯(Zhang等2011)、脱落酸(Zhu等2010)、茉莉
酸(Moffat等2012)、细胞分裂素(Zhao等2012)、赤
霉素(Yaish等2010)和病原体感染(Lin等2007)等。
图4 不同植物pre-miR172e序列的系统进化树
Fig.4 Phylogenetic tree of miR172e precursor sequences from different plant species
图中分支点的数字表示Bootstrap验证中基于1 000次重复该节点可信度的百分比; 标尺代表遗传距离。
图5 盐穗木HcTOE3基因的扩增
Fig.5 PCR amplification of the HcTOE3 gene from H. caspica
A: HcTOE3 5′端扩增; B: HcTOE3 3′端扩增; C: HcTOE3 开放阅读框扩增; M: DL2000 Marker。
植物生理学报510
通过MEGA5.0软件构建系统进化树, 结果显
示TOE3蛋白在番茄、巨桉、葡萄、粟、香蕉和油
菜等不同物种中高度保守, 并且HcTOE3与同为藜
科植物的甜菜聚为一类(图7)。
3 HcmiR172e及靶基因HcTOE3的相关性分析
Aukerman和Sakai (2003)研究证实, miR172通
过调节AP2类转录因子的表达参与植物花器官的
形成及开花时间的调控。Jung等(2014)在拟南芥中
验证, 过表达rTOE3 (抗miR172的TOE3过表达植物)
与过表达rAP2 (抗miR172的AP2过表达植物)植株
表型相似, TOE3与AP2在植物花形成过程中有重要
作用。Nova-Franco等(2015)研究大豆的miR172c与
靶基因AP2-1表达呈现负相关, 并且增加miR172的
表达量, 可改进根系的生长, 增加根瘤菌的感染率,
增高早期结瘤表达量等。
植物miRNA与其靶基因的作用机制主要有2
种: 对靶基因mRNA的切割或对靶mRNA翻译的阻
遏(Rhoades等2002)。根据盐穗木小RNA文库和转
录组数据, HcmiR172e预测的靶基因为HcTOE3, 该
基因在靠近3′端的编码区位置存在HcmiR172e的靶
位点(图8), 表明其可能受HcmiR172e的调控。
利用qRT-PCR技术对盐穗木同化枝中Hc-
miR172e和HcTOE3基因表达模式进行分析, 结果
(图9)表明, HcmiR172e在200和400 mmol·L-1 NaCl
处理时, 表达显著下调, 随后在600 mmol·L-1 NaCl
胁迫处理时的表达量上调接近对照水平; 相应地,
图6 盐穗木HcTOE3蛋白的保守结构域
Fig.6 Conserved domains of the HcTOE3 protein from H. caspica
图7 不同植物TOE3氨基酸序列的系统进化树分析
Fig.7 Phylogenetic tree of TOE3 amino acid sequences from different plant species
图中分支点的数字表示Bootstrap验证中基于1 000次重复该节点可信度的百分比; 标尺代表遗传距离。
张玉芳等: 盐穗木HcmiR172e和预测的靶基因HcTOE3的克隆及盐胁迫下的靶向关系分析 511
HcTOE3在200 mmol·L-1 NaCl处理时的表达显著上
调, 随着盐浓度的增加其表达量呈现下调趋势。盐
穗木同化枝经不同NaCl浓度处理48 h后HcmiR172e
与HcTOE3的表达量变化(图9), 与Nova-Franco等
(2015)研究结果相似, miRNA与靶基因呈现负相关
性, 表明HcmiR172e可能调节HcTOE3的表达量, 即
HcmiR172e的靶基因可能为HcTOE3。
讨　　论
植物在生长发育过程中, 常受到多种不利环
境因素的影响, 而植物为固着生长无法逃避胁迫,
进而衍生出错综复杂的分子调控网络 , 尤其是
miRNA作为一类保守的内源性小RNA分子在此过
程中起着重要调控作用(Ding等2008)。植物miRNA
的靶基因大多为编码调控蛋白的转录因子, 因此
miRNA与靶基因的靶向关系和调控机制对研究植
物生长发育和应对胁迫至关重要。
miRNA172是极为保守的miRNA家族, 其靶
基因已证实为AP2类转录因子(Chen 2004)。AP2
是开花调控抑制子, 主要参与植物的生长发育, 如
参与花器官、花序分生组织、胚珠及种子的形成
(Irish 1998; Klucher等1996), 而在胁迫应答方面研
究较少。盐穗木为荒漠盐碱植物, 对盐分的适应
性极强, 是盐生植物群落的建群种、优势种或主
要伴生种(郗金标等2006)。因此 , 研究盐穗木
miRNA的耐盐调控机制具有重要意义。
Frazier等(2011)研究烟草中miR172受盐胁迫
诱导上调; Gupta等(2014)证实大麦的miR172响应
盐胁迫, 表达上调。盐穗木HcmiR172e在200和400
mmol·L-1NaCl处理时, 表达下调, 随后在600 mmol·L-1
NaCl胁迫处理时表达上调, 且恢复至对照水平, 这
可能与miRNA的调控具有物种、时空和浓度依赖
有关(Wang等2013)。HcTOE3与HcmiR172e呈现相
反的表达模式, 在200 mmol·L-1 NaCl处理诱导上调,
随着盐浓度的增加表达开始下调, 在600 mmol·L-1时
表达量低于对照水平。
pre-miRNA在miRNA的功能研究中至关重
要。目前, miRBase中的pre-miRNA以模式植物居
多, 一般是通过实验方法(直接克隆、Northern杂
交、PCR和/或5′-RACE)、计算方法预测或者EST
(expressed sequence tag)分析获得前体序列(Zhang
等2006)。如果未预测到该植物的miRNA前体, 则
会有碍于miRNA的调控功能研究。本文通过同源
克隆与5′-RACE技术得到盐穗木pre-HcmiR172e序
图8 盐穗木HcmiR172e的靶基因预测
Fig.8 Predicted target gene of the HcmiR172e from
the H. caspica transcriptome
图中字母X和O表示miRNA与预测靶基因靶位点间的碱基错配,
X表示嘧啶之间或者嘌呤之间的错配, O表示嘧啶与嘌呤的错配。
图9 盐穗木同化枝HcmiR172e和靶基因HcTOE3在不同盐浓度胁迫处理48 h的表达模式
Fig.9 Expression pattern of HcmiR172e and its target HcTOE3 in H. caspica assimilating branches under
different concentration NaCl treatment for 48 h
各柱形上不同小写字母表示HcmiR172e或HcTOE3不同处理间存在显著差异(P<0.05)。
植物生理学报512
列 , 符合前体各项指标 , 有助于深入探讨H c -
miR172e的调控功能。
综上, 盐穗木miR172e-TOE3的相关性研究有待
进一步丰富和完善, 如它们的靶向关系, HcmiR172e
在胁迫方面的调控功能和预测的靶基因HcTOE3响
应盐胁迫的机制都需要实验验证来进一步阐明。
目前, 利用拟南芥转基因技术平台正在开展盐穗木
miR172e-TOE3的耐盐调控研究, 以期利用miRNA
的生物技术提高农作物的抗性和产量。
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Cloning, expression and correlated analysis of HcmiR172e with predicted tar-
get gene HcTOE3 in Halostachys caspica under salt stress
ZHANG Yu-Fang, YANG Rui-Rui, ZENG You-Ling*
Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang
University, Urumqi 830046, China
Abstract: Halostachys caspica as a salt-diluted short shrub belonging to the Chenopodiaceae is distributed
widely in acrid and saline-alkali region of Xinjiang and shows extremely salt-tolerant. A miRNA mature se-
quence (HcmiR172e) differentially expressed was candidated from the two small RNA libraries of the H. caspi-
ca roots established by 600 mmol·L-1 NaCl treatment for 48 h and the target gene of HcmiR172e was predicted
as HcTOE3 using the H. caspica transcriptome data. The HcmiR172e precursor (pre-HcmiR172e) and the full
length HcTOE3 gene were obtained by homologous cloning and RACE technology. pre-HcmiR172e and Hc-
TOE3 were analyzed by using the bioinformatics software. The expression pattern of HcmiR172e and HcTOE3
of the H. caspica assimilatings under different concentration NaCl treatment was detected using qRT-PCR
method. The results showed that the obtained pre-HcmiR172e sequence can form the stem-loop structure, and
the indexes can meet the requirements of the precursor using the Mold biological software. The full length of
HcTOE3 gene was 1 744 bp, the open reading frame was 1 329 bp, and the highly binding site (CTGCAGCAT-
CATCAGGATTC) of HcmiR172e was matched within the HcTOE3 encoding region. qRT-PCR analysis showed
that HcmiR172e and predicted target gene HcTOE3 were responding to salt treatment and took on a negative
correlation at a certain extend between HcmiR172e and HcTOE3. The regulated mechanism for a pair of the
miR172e-TOE3 in H. caspica under aibotic stress will be elucidated in the further experiments.
Key words: Halostachys caspica; salt stress; HcmiR172e; HcTOE3; cloning; qRT-PCR; correlation
Received 2016-02-26 Accepted 2016-03-28
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31160186), the Natural Science Foundation of Xinjiang
Uygur Autonomous Region (Grant No. 2015211C274), and the “973” Pre-Research Program of the Ministry of Science and Technology, China
(Grant No. 2012CB722204).
*Corresponding author (E-mail: zeng_ylxju@126.com).