全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (9): 881~886 881
收稿 2012-03-13 修定 2012-07-16
资助 “十二五”国家科技支撑计划(2011BAD35B01)、粮食丰产科
技工程(2011BAD16B09-03)、山东省农业良种工程和山东
省泰山学者岗位(作物栽培与育种学)。
* 通讯作者(E-mail: songxy@qau.edu.cn; Tel: 0532-86080009)。
一种利用生理指标评价玉米弯孢菌叶斑病抗性的方法
郭新梅, 叶克苁, 宋希云*
青岛农业大学农学与植物保护学院/青岛市主要农作物种质资源创新与应用重点实验室, 山东青岛266109
摘要: 本试验以4种不同抗性的玉米自交系幼苗为材料, 比较了新月弯孢菌毒素浓度和处理时间对玉米主要防御酶系苯丙
氨酸解氨酶(PAL)、过氧化酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)比活力的影响。结果表明: 在不同毒素浓度和胁迫时间下,
PAL、POD和SOD比活力与品种抗病性的相关程度不一致。稀释200倍的毒素溶液处理玉米幼苗12 h时, PAL比活力与抗
病性呈极显著线性正相关, POD比活力与抗病性呈曲线正相关, SOD比活力与玉米抗病性呈极显著线性负相关。因此, 可
利用稀释200倍的新月弯孢菌毒素溶液处理12 h时测得的玉米幼苗PAL、POD及SOD比活力估算玉米自交系弯孢菌叶斑病
的抗性水平。
关键词: 玉米; 新月弯孢菌; 毒素; 防御酶系; 生理指标; 评价方法
An Evaluation Method of Resistance to Curvularia Leaf Spot Disease by Phys-
iological Indexes in Zea mays L.
GUO Xin-Mei, YE Ke-Cong, SONG Xi-Yun*
Qingdao Key Lab of Germplasm Innovation and Application of Major Crops/College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao
Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: Effects of concentration and treatment time of Curvularia lunata (Wakker) Boed toxin on phenylala-
nine ammonia-lyase (PAL), peroxidase (POD) and superoxide dismutase (SOD) in the seedlings of four maize
(Zea mays L.) inbred lines with different resistance to disease were studied. The results suggested that the de-
gree of correlation between resistance and PAL, POD and SOD specific activities were different under the treat-
ment of different concentrations and time of toxin. After 12 h of 200-times diluted toxin stress, PAL had a high-
ly significant linear correlation with the resistance; POD had a curve positively correlation with the resistance;
and SOD had a highly significant negative linear correlation with the resistance. The specific activities of PAL,
POD and SOD in maize seedlings could be used to evaluate the resistant levels to Curvularia lunata (Wakker)
Boed toxin of maize inbred lines after 12 h of 200-times diluted toxin stress.
Key words: maize (Zea mays L.); Curvularia lunata (Wakker) Boed; toxin; defense enzymes; physiological
index; evaluation method
玉米弯孢菌叶斑病(corn curvularia leaf spot
disease)是20世纪80年代中后期在我国玉米产区发
生的一种危害较大的新病害, 其发病趋势逐年上
升, 常导致大面积减产, 甚至绝产, 已成为我国玉
米的重要病害之一。国内外学者对弯孢叶斑病病
原菌的分离、防治技术及生理分化等进行了大量
研究, 对致病基因、抗性相关蛋白也进行了分子
水平的初步探索, 这些研究工作为揭示玉米弯孢
叶斑病病菌的致病机制, 抗病品种的选育提供了
强有力的支持(王嘉渊和陈捷2011; 周舒扬等2010;
高颖等2009; 鄢洪海等2009; 周斐红等2009)。然而
对抗性评价方法却鲜有研究, 仍主要采用人工接
种弯孢菌孢子悬浮液后利用病斑数、产孢量等病
情指数进行抗性评价的方法(王宏等2000; 赵来顺
等1995), 这种鉴定方法工作量较大, 易受其他病害
及地域的影响 (刁毅和叶华智2011; 冷廷瑞等
2010)。而采用同工酶分析、酶联免疫检测等方法
虽然精确, 但步骤繁琐, 成本较高, 因此急需找到
一种简单的可在室内鉴定品种抗性的方法。
植物的保护反应是复杂的新陈代谢过程, 植
物受到病原物侵染后, 抗、感品种之间苯丙氨酸
植物生理学报882
解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、多酚
氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、过氧化物酶
(horseradish peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶
(superoxide dismutase, SOD)以及其它重要酶类的
活性变化有明显差异(Shoresh和Harman 2008;
Segarra等2007; 何祖华等2001; 葛秀春等2000)。
陈捷等(2002)研究表明寄主体内产生的防御酶系
POD、PAL和SOD是玉米抗弯孢菌叶斑病的重要
机制。因此, 毒素处理后测定保护酶系的变化可
以作为选育抗弯孢菌叶斑病品种的指标。
新月弯孢菌[Curvularia lunata (Wakker) Boed]
毒素是玉米弯孢菌叶斑病的主要致病因子, 是植物
病程中起着决定作用的有毒物质(李富华等2004)。
在抗病选育中, 利用毒素代替病原菌处理预测材
料, 可以简单快速筛选出具有初步抗病作用的材
料(张欣芳等2009)。本研究在前期初步探讨了新
月弯孢菌毒素对玉米种子萌发影响的基础上, 选
择了在生产上广泛使用的抗、感自交系作为试验
材料进一步研究毒素浓度及处理时间对玉米幼苗
主要防御酶系PAL、POD和SOD比活力的影响, 以
确定毒素胁迫处理的最佳浓度及时间, 并找到利
用生理指标衡量玉米自交系弯孢菌叶斑病抗性水
平的方法, 以便在室内完成抗、感品种的筛选和
鉴定, 打破季节限制并减少田间抗病性鉴定的繁
杂工作, 提高工作效率, 推动玉米弯孢菌叶斑病抗
性机制的研究, 为抗性品种的选育提供依据。
材料与方法
玉米新月弯孢菌由青岛农业大学鄢洪海老师
提供。供试玉米(Zea mays L.)自交系包括抗病自
交系‘BC2433’、中抗自交系 ‘178’、中感自交系
‘H21’和感病自交系‘掖478’, 抗病性为长期田间实
验鉴定结果, 评价标准为抗病: 病斑类型为R或M,
严重度1级; 中抗: 病斑类型为R或M, 严重度2级;
中感: 病斑类型S或M, 严重度3级; 感病: 病斑类型
S, 严重度4级; 高感: 病斑类型S, 严重度5级(王宏
等2000; 赵来顺等1995)。
根据肖淑芹等(2006)的活性炭柱过滤法提取
粗毒素(褐色物质), 加蒸馏水稀释, 定容至100 mL,
即为粗毒素原液(10 mg·mL-1)。将毒素原液稀释
0、10、100、200和500倍, 配成10 000、1 000、
100、50和20 µg·mL-1 5个浓度梯度的溶液, 以清
水为对照。选择均匀一致的3叶期玉米幼苗放入
50 mL试管中, 每个试管5 株, 加毒素溶液50 mL,
26.65 kPa负压力下渗透0、6、12、24和48 h, 25
℃恒温箱中静置18 h, 取第3叶放入−80 ℃冰冻保
存, 每处理重复3次。
参照Lamb和Rubery (1976)的方法提取PAL、
POD和SOD的粗提酶液 , 采用Koukol和Conn
(1961)的方法进行PAL比活力测定, 采用张志良和
翟伟菁(2003)愈创木酚法测定POD的比活力, 参照
王爱国等(1983)的方法测定SOD的比活力。文中
数据为3次重复的平均值, 利用Excel 2007和DPS
(Data Processing System) 7.05进行数据分析。
实验结果
1 不同毒素浓度对玉米PAL、POD和SOD比活力
的影响
不同浓度的毒素溶液胁迫处理玉米幼苗后,
PAL、POD与SOD的比活力均出现不同程度地升
高。PAL与POD的上升趋势均为抗病‘BC2433’>中
抗‘178’>中感‘H21’>感病‘掖478’, 而SOD的上升趋
势与前两者相反(图1)。
将毒素浓度与玉米的3种酶比活力进行相关
分析, 结果(表1)表明, 毒素浓度与PAL、POD及
SOD比活力呈负相关, 毒素浓度越高, 比活力越
低。毒素浓度的变化对感病、中感玉米自交系比
活力的影响大于抗病、中抗玉米自交系的, 且毒
素对SOD、POD比活力的影响大于PAL的影响。
进一步分析不同毒素浓度对玉米主要防御酶
系的影响, 结果(表2)显示, 在不同毒素浓度胁迫处
理下, 玉米自交系的抗病性与PAL、POD比活力存
在正相关关系, 与SOD比活力存在负相关关系。
稀释200倍的毒素胁迫处理下, 玉米自交系的抗病
性与PAL比活力极显著正相关, 与POD比活力存在
显著正相关性, 与SOD比活力极显著负相关。
综上所述, 稀释200倍的毒素溶液胁迫最易激
发多数玉米自交系主要防御酶系, PAL、POD及
SOD比活力与自交系的抗病性有显著或极显著的
相关性。方差分析结果表明, 稀释200倍毒素溶液
处理下的玉米幼苗PAL、POD与SOD的比活力的
差异均达到显著或极显著水平(数据未列)。因此,
郭新梅等: 一种利用生理指标评价玉米弯孢菌叶斑病抗性的方法 883
表1 毒素浓度与玉米PAL、POD和SOD比活力的相关性分析
Table 1 Correlation analysis between PAL, POD and SOD specific activities in maize and toxin concentration
玉米自交系 PAL比活力与毒素浓度的相关系数 POD比活力与毒素浓度的相关系数 SOD比活力与毒素浓度的相关系数
‘BC2433’ −0.412 −0.463 −0.625
‘178’ −0.423 −0.404 −0.419
‘H21’ −0.479 −0.555 −0.459
‘掖478’ −0.454 −0.545 −0.571
图 1 毒素浓度对玉米PAL、POD
和SOD比活力的影响
Fig.1 Effects of toxin concentration on PAL, POD
and SOD specific activities in maize
图2 毒素处理时间对玉米PAL、POD
和SOD比活力的影响
Fig.2 Effect of toxin stress time on PAL, POD
and SOD specific activities in maize
植物生理学报884
本文认为毒素原液稀释200倍是最佳的新月弯孢
菌毒素处理浓度。
2 毒素处理时间对玉米PAL、POD 和SOD比活力
的影响
稀释200倍的毒素胁迫玉米幼苗0、6、12、24
和48 h, 测定PAL、POD与SOD的比活力变化。结果
(图2)表明, 毒素未处理时, 4种玉米自交系PAL、POD
及SOD比活力相差不大; 胁迫6 h, 抗病‘BC2433’、
中抗‘178’玉米的PAL和POD比活力迅速增大, 速度
明显快于感病‘掖478’和中感‘H21’玉米自交系; 胁
迫12 h时, 4种自交系的PAL比活力, 抗病、中抗自
交系POD比活力, 感病、中感与中抗自交系SOD的
比活力均达到峰值。而中感‘H21’和感病‘掖478’
自交系POD比活力在处理24 h时达到最大值。
对毒素处理时间与玉米的主要防御酶系比活
力进行相关分析, 发现毒素处理时间对玉米防御
表2 不同毒素浓度处理下玉米抗性与PAL、POD及SOD比活力的相关性分析
Table 2 Correlation analysis between resistance and PAL, POD and SOD
specific activities in maize with different toxin concentration
稀释倍数 PAL与抗性的相关系数 POD与抗性的相关系数 SOD与抗性的相关系数
对照 0.385 0.950* −0.667
500 0.931 0.917 −0.945
200 0.993** 0.978* −0.998**
100 0.881 0.947 −0.916
10 0.606 0.978* −0.178
0 0.538 0.999** −0.124
* 表示显著相关, ** 表示极显著相关。下表同此。
表3 毒素处理时间与玉米PAL、POD和SOD比活力的相关性分析
Table 3 Correlation analysis between stress time of toxin and PAL, POD and SOD specific activities in maize
玉米自交系 PAL比活力与处理时间的相关系数 POD比活力与处理时间的相关系数 SOD比活力与处理时间的相关系数
‘BC2433’ −0.038 −0.040 0.308
‘178’ −0.072 −0.107 0.528
‘H21’ 0.047 0.266 −0.329
‘掖478’ 0.025 0.183 −0.371
表4 不同毒素处理时间下玉米抗性与PAL、POD及SOD比活力的相关性分析
Table 4 Correlation analysis between resistance and PAL, POD and SOD specific activities in maize at different toxin stress time
处理时间/h PAL与抗性的相关系数 POD与抗性的相关系数 SOD与抗性的相关系数
0 0.385 0.950* −0.666
6 0.953* 0.976* −0.988*
12 0.977* 0.979* −0.981*
24 0.881 0.947 −0.916
48 0.967* 0.926 −0.883
酶系比活力的影响为PAL
理时间延长而降低, 而SOD比活力随着处理时间
延长而升高(表3和图2)。将不同毒素处理时间的
玉米自交系抗病性与PAL、POD和SOD比活力进
行相关性分析, 结果(表4)表明, 毒素胁迫6和12 h
时, 玉米自交系的抗病性与PAL和POD比活力显著
正相关, 与SOD比活力显著负相关。毒素胁迫12 h
时, 玉米幼苗的PAL、POD与SOD比活力的差异均
达到显著或极显著水平(数据未列)。因此, 稀释
200倍毒素胁迫12 h时, 可利用PAL、POD和SOD
比活力对供试自交系进行抗病性评价。
3 玉米自交系的抗性与PAL、POD和SOD比活力的
关系
稀释200倍的毒素溶液处理12 h后, 测定PAL、
POD与SOD的比活力, 并以1表示感病自交系‘掖
郭新梅等: 一种利用生理指标评价玉米弯孢菌叶斑病抗性的方法 885
478’抗性, 以2表示中感自交系‘H21’的抗性, 以3表
示中抗自交系‘178’的抗性, 以4表示抗性自交系
‘BC2433’的抗性, 分别做出玉米自交系抗性(x)与
PAL、POD与SOD的比活力(y)关系的拟合图(图3)。
图3表明, 玉米自交系的抗病性与PAL的比活
力存在极显著的线性正相关关系, 随着自交系抗性
的增强, 自交系PAL的比活力增大, 线性方程为
y=22.13x+35.17 (R2=0.955, P<0.01)。抗病性与
POD的比活力不存在显著的线性相关(P=0.07), 但
存在着曲线相关, 回归方程为y=50.17x2–136.9x+
222.5 (R2=0.996, P=0.058), 且随着自交系抗性的增
强, 自交系POD的比活力增强。抗病性与SOD的
比活力存在极显著负相关性, 线性回归方程为y=
–4.432x+38.04 (R2=0.961, P<0.01)。因此, 可利用
稀释200倍的新月弯孢菌毒素溶液处理12 h时测得
的玉米幼苗PAL、POD及SOD比活力及回归方程
估测玉米自交系弯孢菌叶斑病抗性水平。
讨 论
抗、感玉米自交系主要防御酶系对新月弯孢
菌毒素的胁迫反应与玉米弯孢叶斑病菌毒素对玉
米品种主要防御酶系的反应一致(陈捷等2002)。
因此, 利用新月弯孢菌毒素进行供试品种抗病性
的鉴定是完全可行的。研究中发现抗、感玉米自
交系的PAL、POD与SOD比活力随着毒素稀释倍
数的增大而增强, 一般在稀释200倍时达到高峰,
且抗、感自交系的比活力差异显著。这与本课题
组在利用抗、感玉米种子萌发情况筛选出的最佳
毒素处理浓度一致(叶克苁等2011)。
毒素浓度及处理时间与玉米主要防御酶系的
相关分析表明, 玉米自交系POD、SOD比活力与
自交系抗病性的相关程度高于PAL。这可能与
POD和SOD在植物体内的功能有关, 酚的氧化与
活性氧的积累可能更易提高植物的抗病性, 而通
过提高PAL活性增加木质素的合成, 达到增厚细
胞壁, 抵御病原菌入侵的抗病方式是一种间接抗
病机制。利用玉米自交系在新月弯孢菌毒素胁迫
下的PAL、POD与SOD比活力直接估算品种的抗
病等级, 为玉米及其他作物抗病品种的选育和抗
性的鉴定提供了一个全新的思路。对于本研究建
立的品种抗病性与毒素胁迫下玉米自交系酶活性
的关系模型是否适用于玉米杂交种抗病性的鉴定
工作, 还有待于进一步的验证。
参考文献
陈捷, 蔺瑞明, 高增贵, 薛春生, 鄢洪海, 郭红莲(2002). 玉米弯孢叶
斑病菌毒素对寄主防御酶系活性的影响及诱导抗性效应. 植
图3 玉米抗性与PAL、POD和SOD
比活力的关系拟合图
Fig.3 Fit plot between resistance and PAL, POD
and SOD specific activities in maize
植物生理学报886
物病理学报, 32 (l): 43~48
刁毅, 叶华智(2011). 玉米弯孢菌叶斑病田间发生动态研究. 南方农
业学报, 42 (2): 161~163
高颖, 薛春生, 姜晓颖(2009). 玉米弯孢叶斑病菌生物学特性比较研
究. 玉米科学, 17 (2): 136~139
葛秀春, 宋凤鸣, 郑重(2000). 稻瘟菌侵染后水稻幼苗活性氧的产生
与抗病性的关系. 植物生理学报, 26 (3): 227~231
何祖华(2001). 植物抗病反应的信号传导网络. 植物生理学报, 27
(4): 281~290
冷廷瑞, 刘汉臣, 潘颖慧,卜瑞, 赵兵, 乔亚民(2010). 玉米品种资
源对弯孢菌叶斑病抗性评价及筛选. 现代农业科技, (17):
159~161, 163
李富华, 王玉涛, 潘开文(2004). 玉米弯孢叶斑病研究现状、问题与
展望. 植物保护, 30 (6): 5~10
王爱国, 罗广华, 邵从本, 吴淑君, 郭俊彦(1983). 大豆种子超氧化物
歧化酶的研究. 植物生理学报, 9 (1): 77~84
王宏, 吕国忠, 纪明山, 张士平(2000). 玉米杂交种对弯孢菌叶斑病
抗性鉴定. 沈阳农业大学学报, 31 (5): 476~478
王嘉渊, 陈捷(2011). 玉米弯孢叶斑病菌Clm1基因的克隆及其功能
验证. 植物病理学报, 41 (5): 464~472
肖淑芹, 薛春生, 石莹, 高增贵, 薛继生(2006). 玉米弯孢菌毒素理化
性质及致病机理的研究. 玉米科学, 14 (4): 138~140
鄢洪海, 陈捷, 宋希云(2009). 玉米弯孢叶斑病菌生理分化与遗传多
态性研究. 玉米科学, 17 (1): 139~142
叶克苁, 郭新梅, 魏志刚, 张恩盈, 宋希云(2011). 玉米抗弯孢菌叶斑
病的快速鉴定方法. 西北农业学报, 20 (4): 168~172
赵来顺, 田学军, 孔宪君, 张义奇, 王江柱, 李玉琴(1995). 玉米黄斑
病研究II. 症状类型. 河北农业大学学报, 18 (4): 36~38
张欣芳, 苏前富, 宋淑云, 张伟, 李红, 刘影, 晋齐鸣(2009). 玉米弯孢
病菌毒素的研究进展. 玉米科学, 17 (6): 118~120, 123
张志良, 翟伟菁(2003). 植物生理学实验指导. 北京: 高等教育出版
社, 123~124
周舒扬, 杨洪一, 赵敏, 梅丽艳(2010). 黑龙江省玉米弯孢菌叶斑病
病原鉴定及其产细胞壁降解酶和漆酶活性分析. 玉米科学, 18
(5): 126~130
周斐红, 刘力行, 陈捷, 姜雪, 刘铜, 黄秀丽, 翟羽红(2009). 寄主抗
性胁迫下玉米弯孢叶斑病菌致病力相关蛋白与基因表达的分
析. 自然科学进展, 19 (9): 936~941
Koukol J, Conn EE (1961). The metabolism of aromatic compounds
in higher plants IV. Purification and properties of the phenyla-
lanine deaminase of Herdeum vulgare. J Biol Chem, 236 (10):
2692~2698
Lamb CJ, Rubery PH (1976). Phenylalanine ammonia-lyase and cin-
namic acid 4-hydroxylase: product repression of the level of
enzyme activity in potato tuber discs. Planta, 130: 283~290
Segarra G, Casanova E, Bellido D, Odena MA, Oliveira E, Trillas I
(2007). Proteome, salicylic acid, and jasmonic acid changes in
cucumber plants inoculated with Trichoderma asperellum strain
T34. Proteomics, 7 (21): 3943~3952
Shoresh M, Harman GE (2008). The molecular basis of shoot respons-
es of maize seedlings to Trichoderma harzianum T22 inoculation
of the root: a proteomic approach. Plant Physiol, 147: 2147~2163