全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (2): 193~198 193
收稿 2010-11-24　　修定 2010-12-24
资助 上海市科委基础研究重点项目(09JC1408500)、上海市
蔬菜学重点学科(B209)、高等学校博士点专项科研基金
(20090073110047)和“Arcus 2006 Languedoc-Roussillon/
China”项目。
* 通讯作者(E-mail: hdf@sjtu.edu.cn; Tel: 021-34206943)。
甜瓜钾离子通道MIRK受Na+抑制的分子机理
王黎敏1, Anne-Aliénor Véry2, 张屹东1, 邓扬悟1, 黄丹枫1,*
1上海交通大学农业与生物学院, 植物科学研究所, 上海200240; 2法国国家农业部植物生物化学与分子生理学中心, 法国蒙
彼利埃34060
摘要: 甜瓜钾离子通道MIRK受Na+抑制, 本研究通过钾离子通道氨基酸序列比对, 发现MIRK与其他钾离子通道在3个位点
上有较明显差异。采用基因定点突变方法获得3个MIRK突变体, 将突变体在非洲爪蟾卵母(Xenopus laevis oocytes)细胞中
表达后利用双向电压钳技术研究了Na+对MIRK通道电流的调整作用, 以探索MIRK受Na+抑制的可能氨基酸位点。结果显
示, MIRK受外界Na+的抑制不是由其单一氨基酸引起, 可能涉及MIRK第232~234位丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺及第241位
天冬酰胺等多个氨基酸的共同调节。
关键词: 甜瓜钾离子通道MIRK; 突变体; 外界Na+; 抑制; 电生理
Molecular Mechanism of Melon Potassium Channel MIRK Inhibited by Na+
WANG Li-Min1, Anne-Aliénor Véry2, ZHANG Yi-Dong1, DENG Yang-Wu1, HUANG Dan-Feng1,*
1Institute of Plant Science, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China; 2Biochem-
istry and Plant Molecular Physiology, French National Institute for Agricultural Research, Montpellier 34060, France
Abstract: Melon potassium channel MIRK, after heterologous expression in Xenopus laevis oocytes was found
an inhibition by external Na+. In order to investigate the effect of external Na+ on MIRK and explore the molec-
ular base of blockage site(s), we proceeded our research by performing site-directed mutagenesis experiment
after amino acid align and obtained three mutants of MIRK, then, used double electrode voltage clamp tech-
niques as a research tool in this study. The results indicated that the depressing effect was not determined by
single amino acid but might involve serine, lysine, glutamine combination from 232–234 sites and asparagines
at a 241-site.
Key words: melon potassium channel MIRK; mutant; external Na+; inhibition; electrophysiology
通过拟南芥中KAT1和AKT1的克隆, 人们开
始认识和了解植物中的钾离子通道。随着研究深
入, 发现钾离子通道除主要参与钾离子的吸收转
运外, 还有其他一些生理功能, 如气孔的开放、胞
间信号传导及根毛生长等 (Maathusis等1997;
Schroeder等1994; Thiel和Wolf 1997)。除此之外,
调整植物对于逆境的适应, 也是钾离子通道的主
要功能之一。目前, 盐渍化威胁着世界近7%的耕
地土壤, 成为最受关注的逆境之一(Shabala和Cuin
2007)。因此, 目前更多研究聚集到钾离子转运体/
通道与耐盐性之间的关系。当超表达钾离子通道
OsKAT1于水稻细胞中可提高耐盐性(Obata等
2007), PutAKT1转至拟南芥中也起同样作用(Ardie
等2010), 但关于钾离子通道在耐盐方面的作用机
理研究还不很深入(Su等2001; Fuchs等2005; Zhang
等2006; Shabala和Pottosin 2010)。
MIRK (melon inward rectifying K+ channel)是
从网纹甜瓜‘春丽’中克隆的钾离子通道基因, 当表
达于非洲爪蟾卵母细胞和钾离子缺陷性酵母中时,
表现出所有植物钾离子通道所没有的一个新的特
性: 受外界Na+的抑制, 并且该抑制效应依赖于胞
外Na+/K+。根据MIRK受Na+抑制表现出的电生理
特征, 推测在孔道区外部开口处可能存在一个Na+
结合位点(Zhang等2010)。同时, 谢亚丽等(2009)将
该基因超表达于拟南芥中时, 可明显提高植物的
耐盐性。
植物生理学报194
根据氨基酸比对, 本实验通过基因定点突变
方法获得3个MIRK突变体, 并在非洲爪蟾卵母(Xe-
nopus laevis oocytes)细胞中表达, 然后结合双向电
压钳技术探索调控该效应的可能氨基酸位点, 为
进一步了解MIRK在植物耐盐上的调控作用提供
研究基础。
材料与方法
1 基因定点突变
利用BLAST软件比对MIRK同源的钾离子通道
氨基酸序列, 寻找不同的氨基酸位点。利用Vector
NTI软件设计引物(表1), 并以构建于载体pGEMX-
表1 基因定点突变使用的引物
Table 1 Primers in site-directed mutagenesis process
基因 引物 序列
L252-R MIRK L252-R F 5 GAAGAAAGTTTATGGAACCGTTACATTACTTC 3
MIRK L252-R R 3 GAAGTAATGTAACGGTTCCATAAACTTTCTTC 5
N241-Y MIRK N241-Y F 5 CATGGATTGGTGCTGTGTACCCTAATTTCAAAG 3
MIRK N241-Y R 3 CTTTGAAATTAGGGTACACAGCACCAATCCATG 5
S232KQ-PRK MIRK S232KQ-PRK F 5 GTATCCAGATCCAAGAAAAACATGGATTGGTGC 3
MIRK S232KQ-PRK R 3 GCACCAATCCATGTTTTTCTTGGATCTGGATAC 5
ho (双酶切位点为BamHI和NotI)的MIRK cDNA为
模板(Zhang等2010), 在高保真酶(pfu ultra)的作用
下进行基因定点突变。突变产物转化到Top10感
受态细胞(Invitrogen, 美国), 提取质粒, 经酶切
(SacI)检验为阳性的质粒片段, 利用表1中引物进行
PCR扩增后测序, 得到正确无误的突变体。
2 MIRK cRNA及其突变体cRNA的制备
利用mMESSAGE mMACHINE试剂盒(Ambi-
on Inc., Austin, 美国), 将构建于载体pGEMXho的
cDNA线性化后, 经体外转录制备cRNA, 用DEPC
处理的双蒸水稀释至浓度为1 ng·L-1, 储存在-70 ℃
冰箱备用。
3 卵母细胞的采取
非洲爪蟾(Xenopus laevis Daudin)冰浴麻醉(约
30 min)后, 将其背部置于手术器械盘内, 除下腹部
外其他部位用冰覆盖 ,在下腹部外侧做长度为
0.8~1.0 cm的切口, 打开腹腔, 拉出子宫瓣, 剪下
1~3个卵叶。子宫轻放回腹部, 分层缝合体壁肌肉
及皮肤, 待动物苏醒后放回池中。
将成簇卵母细胞, 置于含胶原酶(1~2 g·mL-1)
的OR2溶液中消化30~60 min, 于20 ℃下缓慢振摇,
以去除卵巢膜和滤泡膜。用ND96液[96 mmol·L-1
NaCl, 2 mmol·L-1 KCl, 1.8 mmol·L-1 CaCl2, 1
mmol·L-1 MgCl2, 2.5 mmol·L
-1 Na-pyruvate, 5
mmol·L-1 HEPES-NaOH, 50 mg·mL-1庆大霉素(pH
7.5)]冲洗, 在显微镜下挑选动植物极境界分明、成
熟的IV~V期卵母细胞用于注射。
4 微注射
在解剖显微镜下通过微量注射仪(Nanoliter
2000, WPI公司)将cRNA按每个卵母细胞50 nL注
射。注射后的卵母细胞用ND96培养液在恒温20
℃条件下孵育3~4 d, 每天换液, 并去除坏死细胞。
5 电生理记录
将2个玻璃微电极(电阻为0.5~1.5 MΩ)通过微
操纵器, 插入卵母细胞内, 电极内液为3 mol·L-1的
KC1溶液, 电极外液为以下几个处理溶液分别持续
灌流(表2)。
在电流测定时, 钳制电压为-20 mV, 给予波
600 ms, 超级化电压从-25 mV到-175 mV, 阶跃为
-15 mV, 后将膜电位钳制在-20 mV, 记录600 ms。
采用双电极电压钳放大器(GeneClamp 500B, 美国),
经pClamp10程序将信号记录入计算机内。
6 数据分析
实验数据用Excel、Sas 9.13和SigmaPlot 11.0
进行统计分析和制图, 实验结果以均数±标准差表
示。
王黎敏等: 甜瓜钾离子通道MIRK受Na+抑制的分子机理 195
实验结果
1 氨基酸比对结果
用BLAST软件比对MIRK与其他shaker家族成
员中连接第五跨膜片段S5与P-功能区的氨基酸序
列, 结果如图1。以KAT1 (已知的不受Na+抑制的钾
离子通道)为主要对照, 其中黑色虚框标记为感兴趣
的氨基酸位点, 分别为第232~234位的丝氨酸-赖氨
酸-谷氨酰胺、第241位天冬酰胺及第252位亮氨
酸。根据此对比结果设计基因定点突变的引物(表
1), 将第232~234位、第241位及第252位氨基酸突
变为脯氨酸-精氨酸-赖氨酸、酪氨酸及精氨酸。
后的尾电流值来标准化所有尾电流, 以避免由于
各个卵母细胞基因表达量的不同而引起的差异。
从图中可以看出电压MIRK及其突变基因编码的
钾离子通道电流呈现电压依赖性, 即随电压改变,
电流值发生改变。在不同外界K+浓度下 , 虽然
MIRK及突变体电流值存在差异, 但都具有依赖于
胞外K+浓度的特性, 即随浓度改变, 电流值改变。
上面两点说明突变体未改变MIRK钾离子通道的
基本特性。
为了解MIRK及突变体对胞外K+的敏感性, 利
用欧姆定律Gkout=GK=I/(E–EK)=N·P0·g, (GK为钾离
子通道电导值, I为经过通道的电流值, E为钳制电
压值, EK为平衡电压值, N为单个卵母细胞上的钾
离子通道总数, P0为开放概率, g为单个通道的电
导)计算电导值。同样利用外液为K1Li99且经激活
脉冲-175 mV后的尾电流值来标准化所有尾电流
以避免由于各个卵母细胞基因表达量的不同而引
表2 6种处理溶液成分及浓度
Table 2 Components and concentrations of six external solutions
成分 溶液1 (K10Li90) 溶液2 (K10Na90) 溶液3 (K1Li99) 溶液4 (K1Na99) 溶液5 (K0.1Li99.9) 溶液6 (K0.1Na99.9)
KCl/mmol·L-1 10 10 1 1 0.1 0.1
NaCl/mmol·L-1 0 90 0 99 0 99.9
LiCl/mmol·L-1 90 0 99 0 99.9 0
　　实验所用的基本溶液含1 mmol·L-1 CaCl2、2 mmol·L
-1 MgCl2和10 mmol·L
-1 Mes, 用Tris调pH至6.0。用基础液为底液配制表中的6种电
解液。
图1 MIRK与其他shaker家族成员氨基酸对比
Fig.1 Comparison of amino acid of MIRK and
other shaker members
2 MIRK cRNA及其突变体cRNA的电泳结果
图2为经线性化后 , 构建于载体pGEMXho
(3 044 bp)上的MIRK (约2 000 bp)及突变体的
cRNA凝胶电泳图。图上仅为一条带, 表示线性化
结果很好。同时5 kb条带表示MIRK及其突变体成
功构建于载体pGEMXho。
3 MIRK及其突变体电生理特征比较
图3示MIRK及其突变体钾离子通道尾电流的
I-V曲线。以K1Li99为外液且经激活脉冲-175 mV
图2 线性化后的MIRK及其突变体的cRNA电泳图
Fig.2 Electrophoretogram of linearizing MIRK and
mutants cRNA
L252-R为第252位亮氨酸突变为精氨酸的突变体, N241-Y
为第241位天冬酰胺突变为酪氨酸的突变体, S232KQ-PRK为第
232~234位丝氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺突变为脯氨酸-精氨酸-赖氨酸
的突变体。以下同。
植物生理学报196
图3 标准化后的钾离子通道尾电流与电压的关系曲线图
Fig.3 Normalized potassium tail current-Itail/V curve
起的差异。当通道在一个指定电位被激活后, 在
充分去极化的电位下测量的外向钾离子通道电导
值应该保持恒定, 且不依赖于外界K+浓度, 除非胞
外K+浓度能调节开放通道的数目。从图4的结果
可以看出MIRK及突变体电导值都是随胞外K+浓
度的改变而改变, 因此外界K+浓度能调节开放通
道的数目。但相应氨基酸位点的改变也导致对外
界K+敏感度发生变化。在1~10 mmol·L-1浓度范围
内 , 所有突变点对K+敏感度增加 , 而在0.1~1.0
mmol ·L-1浓度范围内 , 突变体S232KQ-PRK和
N241-Y对K+敏感度降低。
图5为MIRK及其突变体的门控特征曲线图,
钾离子通道的开放概率(Po/Pomax)可由失活外向尾
电流计算得到, 其与电压的曲线关系应用波尔兹
曼分布 I=1/{1+exp[ZgF(E-Ea50)/R/T]}进行拟合, 并
估计门控参数Zg和Ea50。其中Zg为等价门控电荷,
Ea50为半激活电压, E为静息电位, F为法拉第常
数, R为波尔兹曼常数, T为绝对温度。从图中看出,
MIRK半激活电压为-188 mV, 突变体L252-R
为-176 mV, N241-Y为-196 mV, S232KQ-PRK
为-167 mV。N241-Y和L252-R的门控电荷数明显
小于对照。
4 外界Na+对突变后MIRK钾离子通道的影响
以胞外浓度Na+及Li+为99 mmol·L-1时的电流
曲线图为例, 说明Na+对MIRK及其突变基因编码
的钾离子通道电流的影响(图6)。从图中可以明显
看出, 突变体钾离子通道电流在外界存在Na+的情
况下内向电流或是尾电流均明显小于无Na+下的
王黎敏等: 甜瓜钾离子通道MIRK受Na+抑制的分子机理 197
图4 标准化外向电导值的比较
Fig.4 Comparison of outward conductance
图5 MIRK及其突变体的门控特征
Fig.5 Gating properties of MIRK and mutants
图6 卵母细胞表达的钾离子通道内向电流及外向失活电流
Fig.6 Current trace of MIRK and mutants with and
without external Na+
左侧为无Na+处理, 右侧为Na+处理。
图7 外源Na+对MIRK及其突变体钾离子通道电流的影响
Fig.7 Effect of external Na+ on K+ current of
MIRK and mutants
*表示与WT相比差异显著, P<0.05。
膜电流, 表现为外源Na+依旧抑制MIRK钾离子通
道电流, 但抑制程度有所差异。
图7反应了在-175 mV下受Na+抑制程度。可
以看出, 与未突变MIRK一致, 突变体受外界Na+抑
制效应均随着Na+/K+比率的升高而增大。当Na+/
K+达到999时, 抑制效率可达95%以上。突变体
L252-R不论在任何浓度的Na+作用下, 其抑制率对
比MIRK的不存在显著性差异。而N241-Y及
S232KQ-PRK则在所有处理浓度下受Na+抑制的程
度与MIRK的相比, 存在显著差异。在外界Na+/K+
浓度比为9时, 抑制率分别减少了19.5%和19.4%;
当比率升高为99时, 抑制率同时减少了16.1%; 当
达到999时, 抑制率分别减少了8.5%和7.7%。
讨　　论
本实验门控曲线中反应的L252-R和S232KQ-
PRK半激活电压的减少, 表明孔道区外部氨基酸可
能与电压器直接相互作用或是通过离子渗透反馈
到电压器, 从而改变其半激活电压(Becker等1996)。
同时, 电生理实验结果表明, 外界Na+仍抑制
MIRK突变体编码的内向钾离子通道电流, 但抑制
植物生理学报198
程度存在差异。其中第252位亮氨酸对该效应不
起调控作用。而第232~234位丝氨酸-赖氨酸-谷氨
酰胺, 第241位天冬酰胺的突变明显降低了通道受
Na+抑制的作用, 说明这几个位于P区与S5跨膜片
段连接处的氨基酸的改变, 可能会导致Na+结合位
点蛋白质构像发生改变, 进一步作用于孔道的过
滤器,使得钾的吸收增加。同时, 说明了并不是单
一的氨基酸位点调控Na+抑制的效应。
MIRK对Na+的敏感性的氨基酸位点存在于孔
道外部开口的假设, 可以进一步通过结合以上的
多个氨基酸位点或是所有氨基酸位点的突变证
实。或者通过将整个KAT1 (已知不受外界Na+抑
制)孔道区替换到MIRK序列上来验证其是否存在
于孔区外。
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