全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 11期, 2010年 11月1092
收稿 2010-07-29 修定 　2010-08-22
资助 “973”前期研究项目(2008CB117006)。
* 通讯作者(E-mail: zenghl@mail.hzau.edu.cn; Tel: 027-
8 7 2 8 3 4 6 5 )。
植物Rubisco活化酶的研究进展
李海霞, 王真梅, 曾汉来 *
华中农业大学农业部华中作物生理生态与栽培研究重点开放实验室, 武汉 430070
提要: 植物Rubisco活化酶广泛存在于光合生物中, 是AAA+家族成员, 具有ATP酶活性, 并具有对温度反应的活化Rubisco
和分子伴侣的双重功能。该文重点介绍了近年来对Rubisco活化酶的分子特性、作用机制、温度等因子的影响及基因工程
研究的最新进展。
关键词: Rubisco活化酶; 分子伴侣; 基因工程
The Research Progresses in Rubisco Activase in Plant
LI Hai-Xia, WANG Zhen-Mei, ZENG Han-Lai*
Key Laboratory of Huazhong Crop Physiology, Ecology and Production, Ministry of Agriculture, Huazhong Agricultural University,
Wuhan 430070, China
Abstract: Member of the AAA+ family in plant kingdom, Rubisco activase not only has the ATPase activity, and
is ubiquitously present in the photosynthetic organisms, but also it shows the temperature responsive dual
functions of both the releasing inhibitory sugar phosphates from the active site of Rubisco and major player as
a molecular chaperone. In this review, the recent progresses in studies on the molecular characteristics, the
action mechanism, temperature effect and its gene manipulation were introduced and discussed.
Key words: Rubisco activase; molecular chaperone; genetic engineering
长期以来, 人们试图通过各种手段提高作物产
量, 其中提高作物光合速率是提高产量的重要手段,
光合机理研究近年来日益受到研究者的重视。
Rubisco, 全称核酮糖 -1,5-二磷酸羧化酶 /加氧酶,
存在于叶绿体基质中, 作为催化光合代谢CO2固定
和光呼吸最初步骤的关键酶, 是叶片中含量最丰富
的可溶性蛋白, 提高 Rubisco利用效率和活力是提
高光合作用的重要途径。因此, 在光合作用研究
中, Rubisco活性的调节机制已成为一个重要的研究
领域。Salvucci等(1985)在植物体内发现 Rubisco
活化酶(Rubisco activase, RCA)是本研究领域的重
要进展, 为体内 Rubisco的活化机制研究展现了良
好的前景。RCA是一种核编码的可溶性叶绿体蛋
白, 广泛存在于光合生物中, 具有ATP酶活性和激
活 Rubisco的功能。国内一些学者(唐如航和李立
人1998; 翁晓燕等1998; 韩鹰等2000; 张国等2004)
曾分别对RCA的研究进展作过综述, 近年来随着分
子生物学技术的发展, 对 RCA及相关研究不断深
入, 新发表了大量研究结果。本文着重对 RCA的
分子特性、作用机制、温度等因子的影响及基因
工程研究的最新进展进行综述。
1 Rubisco活化酶的分子特性
RCA 是 AAA+家族成员, 具有WalkerA、
WalkerB、Sensor 1、Box VII和 Sensor 2结构域,
有保守的核苷酸结合位点, ATP和Mg2+能催发其形
成高度有序的低聚体, 执行多种拟伴侣蛋白的功能,
参与大分子复合体的形成(Portis Jr 2003)。RCA
的两种亚基结构中均含有 “P-环 ” (phosphate-bind-
ing loop, G-X-X-X-X-G-K-S/T)序列, 而 “P-环 ”是
许多ATP酶具有的核苷酸结合序列, 它能维持酶和
ATP上的 α-、β-和 γ-磷酸基团形成的氢键, 稳定
ATP水解过程的中间状态, 因此, RCA本身虽不是
ATP酶, 但具有ATP酶的活性, 具有活化 Rubisco
的功能, 此活化过程依赖于 ATP而受 ADP抑制
(Kallis等 2000), 符合ATP酶的作用特征。
1.1 Rubisco活化酶的亚基组成 不同植物RCA亚
基的种类和数量不同, 如拟南芥、小麦、水稻、
棉花、大豆等植物均含有 α (大亚基, 45~47 kDa)
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和 β (小亚基, 41~44 kDa)两种亚基, 而有些植物如
玉米、烟草、黄瓜、菜豆、绿豆等则仅含 β 一
种亚基。氨基酸序列分析表明同种植物或不同植
物的 α亚基之间同源性平均约为 74.8%, β亚基同
源性平均约为65.9%, 其抗体均能发生交叉反应, 这
为利用Western杂交检测不同植物RCA的表达方式
提供了方便。另外, RCA基因的表达方式也各不
相同, 有的由 1个RCA基因通过选择性剪接编码 2
个亚基, 有的是不同基因编码同一个亚基, 有的则
是由 2个独立 RCA基因编码 2个亚基(To等 1999;
Salvucci等 2003; Law和Crafts-Brandner 2001; Pol-
lock等 2003; Ayala-Ochoa等 2004; Yin等 2010)。
关于两种亚基的生理功能, Wang等(2010)认为
β亚基主要是活化Rubisco, 而α亚基在调节和维护
β亚基的Rubisco活化活性上起作用。两种亚基的
存在可能与植物不同的调节机制有关, 因为只有α
亚基受硫氧还蛋白 f (Trx-f)氧化还原作用的调节
(Zhang和 Portis Jr 1999; Zhang等 2002)。α亚基
的C-末端具有 2个Cys残基, 当 2个Cys残基结合
形成二硫键时, 氧化的α亚基的羧基端域能与包括
核苷酸结合域在内的区域交叉连接(Wang和Portis
Jr 2006b), 从而使ADP对α亚基的抑制作用比未形
成二硫键时增强, 而 Trx-f含有调节氧化还原活性
的二硫键 /巯基, 它能够还原 α亚基的二硫键: 还
原态Trx-f与α亚基中二硫键的一个Cys残基形成
混和的二硫键, 然后 Trx-f活化区域中的另一个巯
基进攻这个二硫键, Trx-f自身形成二硫键而 α亚
基被还原, 这样就减少了α亚基对ADP抑制作用的
敏感性, 从而导致 α 亚基的活性增加(Zhang和
Portis Jr 1999; Zhang等 2002; Motohashi等 2001)。
Yin等(2010)发现编码大豆RCA α亚基和β亚基的
基因GmRCAα和GmRCAβ的表达水平由不同连锁
群上的不同位点控制, 它们具有不同的表达类型, 可
能是基因组复制和进化的结果。由此看来, 不同植
物RCA亚基的组成与RCA基因的表达方式不同可
能是多方面机制造成的。
热胁迫下, 棉花RCA的α和β亚基的从头合成
受到的影响不大, 41 ℃长时间热胁迫后还诱导产
生了46 kDa的新RCA亚基, 占总RCA量的5%, 当
热胁迫植株恢复后, 新RCA亚基的前体消失, 分析
认为, 热诱导RCA亚基的合成可能受转录调控(Law
等2001)。小麦经38 ℃热胁迫后, 其RCA的mRNA
水平明显降低, 但与 RAC转录水平相反的是, 4 h
热胁迫后, 42 kDa亚基数量增加, 同时诱导产生一
种新的 41 kDa亚基, 停止胁迫 24 h恢复后, 42 kDa
亚基返回到对照水平, 而新的 41 kDa亚基仍有少
量表达, Southern杂交分析证明, 小麦叶片内只有
一个 RCA基因(Law和 Crafts-Brandner 2001)。可
见, 热胁迫使小麦的RCA表达发生改变很大程度上
是翻译后调控。另外, 玉米(Crafts-Brandner和
Salvucci 2002)和菠菜(Rokka等2001)等植物在热胁
迫下也会产生新的RCA亚基。看来多种植物在热
胁迫下都会产生RCA新亚基, 若对它们的功能和调
节机制进行深入研究将对植物光合作用对逆境的反
应与适应机制具有重要意义。
1.2 Rubisco活化酶的功能 RCA具有对温度反应
的双重功能。在最适温度时, RCA利用光合磷酸
化生成的ATP使Rubisco迅速与生理浓度的CO2和
Mg2+结合形成ECM (酶 -CO2-Mg)而达到最大的活
化程度, 解除磷酸糖对Rubisco活性的抑制作用, 完
成对 Rubisco的活化(Portis Jr 2003; 韩鹰等 2000);
当遇热胁迫时, 又可行使第二种功能: 作为分子伴
侣保护与类囊体结合的核糖体, 使在类囊体中合成
的相关蛋白免受热钝化。RCA在催化 Rubisco时
以聚合态的形式出现, 因为聚合态的RCA才具有较
高的催化活性(Wang等 1993; 洪法水等 2004)。但
人们至今还未从植物体内结晶出 Rubisco-RCA的
复合体, 只是对该复合体的可能模型提出了假设
(Parry等 2003; Portis Jr 2003)。
RCA在植物发育中发挥重要作用。在大豆重
组自交系中, GmRCAα的表达水平与光合能力和种
子产量呈显著正相关, GmRCAβ为极显著正相关
(Yin等 2010), 表明RCA基因在调节大豆光合能力
和种子产量中发挥重要作用。另外, RCA对水稻
转绿型白化突变系W25在转绿过程中起调控作用
(翁晓燕等 2000), 参与了叶绿体的发育过程。在植
物叶片衰老期间, RCA基因表达水平下降与光合速
率下降密切相关, RCA对维持Rubisco初始羧化活
力和净光合速率有重要调节作用(蒋德安等2000; 张
国等 2005)。也有报导 RCA缺乏可延缓烟草叶片
衰老(He等 1997)。同种植物的不同品种之间RCA
存在着差异, 经20个农艺选择周期从玉米低产品系
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Z0中选育出增产90%以上的高产品系Z20, 与Z20相
比 Z0中叶绿素含量和 Rubisco含量相似, 但 Z0中
Rubisco活性很低, 若向Z0叶片提取物中添加RCA
和ATP再生体系以提高RCA水平时, 其Rubisco活
性随之上升(Martínez-Barajas等1997), 说明Z0低产
是由 RCA含量低引起的。此外, 即使在水稻生育
后期剑叶开始衰老, 高产品种水稻叶片中RCA含量
都一直较高(翁晓燕和毛伟华 2000)。
RCA还具有保护植物抵御环境胁迫的作用。
有报道认为, 植物RCA的温度稳定性是高温限制其
光合作用的一个主要生化因子, 从而最终影响了高
等植物的地理分布特性、特定温度环境中的生产
力以及它们对气候变化作出反应的能力(Salvucci和
Crafts-Brandner 2004)。通过对拟南芥突变体的研
究发现, 43 kDa的RCA β亚基对净光合速率(Pn)热
恢复起主要作用(Kim和 Portis Jr 2005)。水稻干
旱处理后, 耐旱品种RCA等4个蛋白表达显著上升
(Salekdeh等 2002)。也有研究表明干旱胁迫下反
义RCA水稻突变体的光合作用比野生型受到更大
程度的抑制(杨万军 2008)。树木在臭氧(Pelloux等
2001; Dizengremel 2001)胁迫下, Rubisco及RCA蛋
白和mRNA表达下降。而在玉米中, 不同叶位RCA
对臭氧的反应不同, 第 5叶的 RCA mRNA水平趋
于下降, 而第10叶的RCA mRNA水平趋于增加, 其
具体机制还不清楚(Leitao等2007)。也有报道指出
RCA是一种GA结合的磷蛋白(Komatsu等1996), 具
有GA信号转导链上Ca2+依赖的蛋白激酶作用, 在
GA信号传递中发挥重要功能(Parry等 2003; Portis
Jr 2003)。
以上结果都提示RCA可能在植物中发挥多种
作用。因此, RCA无论是作为活化酶或是其他调
节作用, 对其作用机制和功能的深入研究都是备受
关注的热点。
1.3 Rubisco活化酶的细胞定位 有些学者在研究
水稻Rubisco和RCA活性及含量的日变化时, 发现
叶片中 RCA含量的变化难以解释其活性的变化
(Jiang等2001), 推测可能与两种酶在细胞中的定位
差异有关。
Anderson等(1996)和Rokka等(2001)认为RCA
主要存在于叶绿体基质中, 当遇热胁迫时则大部分
RCA由于自身构象变化从基质中转移到与类囊体
膜上的多核糖体特异性结合。但王妮妍等(2003)
的研究发现水稻叶片RCA除分布于叶绿体外, 在线
粒体中也有大量存在, 预示RCA可能还具有除活化
Rubisco以外的其他功能。
一般植物叶绿体基质中的 R C A 起着活化
Rubisco的作用, 当遇热胁迫时, RCA就会起分子
伴侣的作用, 叶绿体基质中一定数量的RCA结合到
类囊体膜上, 保护在类囊体膜上蛋白合成的进行(Jin
等2006), 那么叶绿体基质中活化Rubisco的RCA数
量就会减少, 光合速率大大下降。然而, 一些耐热
性强的植物品种, 或利用基因工程技术提高了耐热
性的植物, 则会通过一定的机制使类囊体膜上的
RCA补偿基质中RCA的减少以维持相对稳态的光
合作用。例如, 转菠菜 BADH基因(甜菜碱醛脱氢
酶)的烟草(Yang等2005)、过量表达达尔文循环关
键酶SBP酶(1,7-景天庚酮糖二磷酸酶)的转基因水
稻(Feng等2007)的耐热性都大大提高了, 这是因为
GB (甘氨酸甜菜碱)和SBP酶可通过阻止基质中的
RCA与类囊体膜结合以维持Rubisco的活化, 从而
提高了碳同化的耐热性。由此可看出, GB和 SBP
酶可作为分子伴侣在高温胁迫时一定程度上阻止
RCA的构象变化, 但具体机制还有待于进一步研究。
1.4 Rubisco活化酶的光调节机制 光调节既有外
部因子又有内部因子的影响。苹果、番茄、大
麦和拟南芥中RCA表达都有明显的昼夜节奏。翁
晓燕等(2000)认为RCA对Rubisco初始活性的调节
主要发生在每天早晚及光暗转换的初期, 此时钝化
态 Rubisco比较多。马铃薯 RCA基因的表达具有
光诱导特性, 在其他培养条件相同的情况下, 其表
达水平与光照处理时间呈正相关, 黑暗条件下RCA
基因不表达, 8 h·d-1连续光照下表达量极少, 而 24
h·d-1连续光照下, 其表达量最高(宋扬 2007)。在限
制性光照强度中, 只表达RCA β亚基的拟南芥植株
的 Rubisco活性没有下调, 但只表达 α亚基植株的
却强烈下调了, 而当两种转化株杂交后其后代中的
Rubisco光调节又与野生型相似, 表明光照强度可能
通过调节叶绿体基质的氧化还原势, 改变 Trx-f对
α亚基的调节作用, 从而影响RCA的活性及Rubisco
的活性, 而且β亚基在α亚基存在条件下可间接受
氧化还原势调节, 但在只有β亚基的烟草中Rubisco
也受光调节, 这可能是其他蛋白参与的结果(Zhang
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等 2002; Zhang和 Portis Jr 1999; Motohashi等
2001)。
唐如航等(1997a)的实验表明, 就基因转录受光
诱导而言, RCA基因比 Rubisco大小亚基基因敏
感。RCA作为核基因, 在核中转录, 进入细胞质中
翻译, 转录与翻译在时空上不同步。实验表明,
RCA表达在转录和翻译水平上的调控机制不同, 转
录既由光暗交替控制又受内生节奏调节, 而翻译则
更大程度上由光调节(张峰等 2002)。因为体外
RCA在无ATP存在的条件下具有自水解功能, 一天
当中 RCA含量与ATP含量呈显著直线相关(Jiang
等2001), 所以光可能通过启动某些有助于RCA蛋
白翻译或防止RCA蛋白水解的步骤(如光合磷酸化
合成 ATP)来调节 RCA 的翻译, 加之光对 RCA
mRNA在转录水平的调节作用, 从而形成RCA在不
同光照条件下的昼夜表达的差异。当然, 对 RCA
的调节还有其他机制。有研究表明, 玉米两个不同
RCA基因具有不同的光 /暗周期表达类型, 由DST-
like (下游样因子)因子介导的转录后机制可能是其
原因(Ayala-Ochoa等 2004), 这是 C4植物的普遍机
制还是例外机制有待于进一步研究。
2 Rubisco活化酶对Rubisco的活化作用
RCA的活性与叶绿体的能荷有密切关系, 黑暗
条件下RCA以失活态存在, 光照下, 随着光合磷酸
化的进行和ATP的增加, 与ATP的水解相偶联, 利
用所提供的能量进行变构形成活化态RCA, 当活化
态 RCA发生作用后即形成失活态 RCA。
结合文献(Salvucci和 Crafts-Brandner 2004;
Jensen 2000; 韩鹰等 2000; Zhu等 1998; Portis Jr
2003; 张国等2004), 提出Rubisco活化酶对Rubisco
活化的作用模型(图 1)。
在Rubisco的活化位点有一个由333~338位的
氨基酸残基形成的环状结构 loop-6 (Schreuder等
1993), 非活化态Rubisco为 loop-6处于紧缩状态但
图 1 活化态RCA对Rubisco的活化
Fig.1 Scheme for activation of Rubisco by activation state of RCA
1: 非活化态 Rubisco与 CO2和Mg2+结合形成开放型构象的活化态 ECM (酶 -CO2-Mg); 2: 非活化态 Rubisco结合 RuBP使 loop-6
处于延伸状态, 形成封闭型构象的钝化态 E-RuBP (终端复合物); 3: ECM与 CA1P (2-羧基阿拉伯糖醇 -1-磷酸)结合, 形成封闭型构象
的复合体 CA1P-ECM; 4: ECM与 RuBP结合, 形成封闭型构象的复合体 RuBP-ECM; 5: Rubisco作为异构酶把 RuBP转变成KABP (3-
酮基阿拉伯糖醇 -1,5-二磷酸)与 ECM紧密结合, 形成封闭型构象的复合体 KABP-ECM; 6: Rubisco催化 RuBP按碳同化的方向进行
产生 PGA (3-磷酸甘油酸), 并重新形成 ECM; 7: Rubisco作为异构酶把 E-RuBP中的 RuBP转变成XuBP (1,5-二磷酸木酮糖), 形成 E-
XuBP复合物。*表示 RCA发挥功能的步骤, 方框右上角曲线表示紧缩态 loop-6, 方框右侧曲线表示延伸态 loop-6。修改自 Salvucci
和 Crafts-Brandner (2004)。
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还没有结合CO2和Mg2+的开放型构象。RCA利用
光合磷酸化生成的ATP使非活化态Rubisco迅速与
生理浓度的 CO2 (10 μmol·L-1)和Mg2+结合形成开
放型构象的氨甲酰化的活化态 ECM (酶 -CO2-Mg,
步骤 1), 之后有以下两个反应方向。
(1)与RuBP结合, 构象改变, loop-6处于延伸状
态, 形成封闭型构象的复合体RuBP-ECM (步骤4),
之后也有两种可能: (a) Rubisco催化 RuBP按碳同
化的方向进行(步骤6), 催化羧化反应, 产生PGA (3-
phosphoglyceric acid, 3-磷酸甘油酸), 并重新形成
ECM, 进入下一轮反应; (b) Rubisco作为异构酶把
RuB P 转变成 KABP ( 3-ket oa r ab in i to l - 1 , 5 -
bisphosphate, 3-酮基阿拉伯糖醇 -1,5-二磷酸),
KABP的产生需要O2, 可能与氧化反应有关, 质子
在C-2位重排, 产生后与已甲酰化的酶紧密结合, 形
成封闭型构象的复合体KABP-ECM (步骤5), 而且
高温时更容易进行此步反应, 须靠活化态RCA与之
结合, 释放KABP重新形成 ECM。
(2) ECM与 CA1P (2-carboxy-arabinitol-1-
phosphate, 2-羧基阿拉伯糖醇 -1-磷酸)结合, 形成
封闭型构象的复合体 CA1P-ECM (步骤 3), 易在黑
暗条件下进行, 与Rubisco活性呈现昼夜变化有关,
也须靠活化态 RCA与之结合, 使 CA1P从 ECM中
解离的速度提高, 尽快重新形成 ECM。
当非活化态的Rubisco结合RuBP后构象发生
改变, 使 loop-6处于延伸状态, 将 Rubisco的活化
位点挡住, Rubisco成封闭型构象的钝化态E-RuBP
(步骤 2), 也称为终端复合物, 即不能再被 CO2和
Mg2+所活化, 这时活化态RCA与之结合, 改变其构
象, 使 Rubisco与 RuBP的结合变松弛, 并将 RuBP
从 Rubisco活化区域解离下来, 重新形成非活化态
的 Rubisco。这样, Rubisco便可以重新被 CO2和
Mg2+激活, 形成ECM。当形成E-RuBP后, Rubisco
也可作为异构酶把RuBP转变成XuBP (xylulose-1,
5-bisphosphate, 1,5-二磷酸木酮糖), RuBP在羧化过
程中, 质子在 C-3重排, 形成XuBP, 积累于反应液
中, 它仅和未甲酰化的 Rubisco紧密结合, 形成 E-
XuBP复合物(步骤7), 也得靠活化态RCA的作用使
XuBP从复合物上解离下来, 重新形成非活化态的
Rubisco。
在这个模型中可能存在的疑问: RCA如何从失
活态变为活化态？为什么活化态RCA能与Rubisco
相互作用？从生物化学的角度解释如下。
ATP识别RCA羧基端Sensor 2结构域上的精
氨酸残基, 发生ATP水解, 活化RCA, 并使 Sensor 2
结构域(包括 311~314区域)移动。磷酸糖类抑制
物与 Rubisco结合后, Rubisco变成封闭型构象, 其
N端结构域中的Glu60、loop-6中的 Lys334和磷
酸糖基键之间相互作用, 限制 Rubisco N端结构域
的移动, 活化态 RCA 311~314位的氨基酸残基通
过静电和其他作用力与Rubisco N端结构域 89~94
位上的残基相互识别, 断开磷酸糖基键, loop-6处
于紧缩态, 空出活性位点, Rubisco变成开放型构象,
被活化(Li等 2006; Portis Jr等 2008)。
Crafts-Brandner和 Salvucci (2000)指出, 高温
下非活化态Rubisco极易形成E-RuBP, 而极大减少
ECM的产生。另外, 活化态 RCA的形成及其发生
活化作用也受到很大限制, 从而使 Rubisco失活速
率加快, 影响光合作用的进行。此外, 缺乏ATP时,
RCA的ATP酶活性和活化Rubisco活性均丧失(唐
如航等 1997b), 这表明催化ATP的水解是 RCA的
一个不可缺少的重要性质。ATP水解发生的具体
过程和意义尚需进一步研究。
从上可看出, RCA对Rubisco的活化作用主要
是使磷酸糖类抑制物从Rubisco的活性位点解离下
来, 尽快形成ECM, 从而保证光合作用的正常进行。
3 温度对Rubisco活化酶的影响
温度是影响光合作用日变化的主要生态因
子。当温度超过植物生长的最适温度会影响其光
合作用的进行。高温下光合作用的下降是由 RCA
的抑制造成 Rubisco的失活而引起的(Kurek等
2007)。关于温度尤其是高温对 RCA调节 Rubisco
活性影响的研究一直是研究热点。
尽管植物在热胁迫中发生基质氧化, 但其并不
是使光合作用受抑制的主要因子(Kim和 Portis Jr
2005)。热胁迫会降低 Rubisco的活化态水平, 是
由于RCA功能受损引起的, 同时高温下Rubisco的
迅速钝化也会加剧RCA功能的损害。RCA结构发
生微小变化就会影响与Rubisco的有效结合。热胁
迫对 RCA功能的损害并不是对氧化还原敏感的 α
亚基发生氧化作用引起的, 而是由RCA的热变性造
成的(Rokka等 2001; Salvucci等 2001, 2006), 当
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RCA的含量降到能使 Rubisco活化的阈值以下时,
就不能活化 Rubisco, 从而抑制光合作用的进行。
当温度升高到 35~40℃时, 植物叶片中 RCA从
Rubisco活化区域解离出来, 亚基之间的相互作用
消失, Rubisco活性下降, 但可以恢复; 当温度高于
42 ℃时, RCA展开成单体, 这些单体自身或与其他
叶绿体蛋白结合成高分子量的不可溶的聚合体, 这
时Rubisco的活性下降加速且不能逆转(Salvucci等
2001)。当然, 植物自身也会采取一定的机制来尽
量阻止这种情况的发生。在拟南芥 RCA β亚基的
C端连接了含8个氨基酸的多肽S-tag, 以便于吸附
和纯化能与RCA相互作用的蛋白。研究表明从转
化株叶片的提取物中得到了热胁迫时能与RCA结
合形成高分子量复合体的一种蛋白cpn60β (β-sub-
unit of chaperonin-60), 它们的结合是动态的, 随着
热胁迫时间的延长和强度的增加而加强, 随着热胁
迫恢复而减弱(Salvucci 2008), 表明 cpn60β在光合
作用适应热胁迫的过程中发挥作用, 可能是保护
RCA以避免热变性。
自然生长温度条件下Pn和Rubisco活性的温度
反应与RCA的温度特性一致, 植物RCA的温度稳
定性是高温限制其光合作用的一个主要生化因子,
具较高热稳定性 RCA的植物分布在较热的地区
(Salvucci和 Crafts-Brandner 2004), 另外, 表现较高
耐热性的转RCA基因拟南芥在中度热胁迫时表现
出较高的光合速率、较好的发育类型和较高的生
物产量及籽粒产量(Kurek等 2007)。
由此, RCA是植物在热胁迫时影响光合作用的
一个主要限制因子, 提高RCA的热稳定性成为高温
胁迫下提高作物生产力的基因工程的一个可行性目
标。
4 Rubisco活化酶的基因工程
现在, 多采用体外定点突变的方法来研究RCA
结构变化后对其功能的影响, 以确定特定氨基酸残
基或结构域对RCA功能贡献的作用机理。分别将
RCA的α亚基或β亚基基因转入拟南芥突变体(rca)
中的结果表明, 只转 β亚基或定点突变的 α亚基(1
个或 2个 Cys被Ala代替)时, Rubisco不受光调节;
转 α亚基或两者都转的植株则受光调节(Zhang等
2002), 这证明Rubisco的光调节是基于RCA的α亚
基受到氧化调节的。RCA的腺苷酸结合位点的定
点突变可提高其对 Rubisco的活化能力, 并改变其
催化时对ATP的需要量(Kallis等 2000)。Box VII
和 Sensor 2结构域中含有一些保守精氨酸残基, 烟
草 RCA的 Box VII中的 R241或 R244, Sensor 2中
的 R294或 R296上的精氨酸被丙氨酸替代后其与
ATP或ADP的结合特性并没有多大改变, 但ATP
的水解特性降到最低(R241A和R244A)或极大减少
(R296A), 并且这些点突变体的RCA没有一个能使
Rubisco活化, 证明这些精氨酸残基与ATP的水解
密切相关(Li等 2006)。将 RCA 109和 250位点上
的色氨酸经点突变换成其他氨基酸残基, 在加入
ATP后RCA固有荧光的增强特性减弱, 说明W109
和W250上的色氨酸残基在能增加固有荧光的构象
变化中起主要作用(Wang和 Portis Jr 2006a)。在
RCA亚基近N和 /或C端引入一个Cys, 会通过化
学交联产生亚基二聚体或由二聚体形成寡聚体, 但
RCA催化Rubisco的活性以及ATP水解作用并没有
受到影响, 表明RCA亚基间可发生相互作用, 但并
不影响酶功能(Salvucci 2004)。Kumar等(2009)将
具有较高热稳定性的烟草RCA的Rubisco识别结构
域替换成拟南芥的 Rubisco识别结构域, 得到了具
有更高热稳定性的重组 Tob-Arab RCA (烟草 -拟
南芥重组 RCA), 将此转入拟南芥 rca突变体, 在短
期高温处理后转化植株的光合速率比野生型的高,
并且放回常温后恢复较好; 另外, 进行较长时间的
中度热胁迫后, 与野生型相比, 转化植株具有较高
的生物产量和种子产量。看来对 RCA结构进行基
因操作但不影响ATP水解及与Rubisco相互作用的
方案是可行的。
此外, 一般采用转反义基因技术研究植物RCA
对生理生化性状的影响及其与 Rubisco的调控关
系。转反义 RCA植株大多光合作用减弱, 不能在
大气CO2浓度条件下生长, 需要在高浓度CO2条件
下才能正常生长(C4植物也不例外), 有的植株死亡,
死亡之前都是新叶先发黄, 枯萎, 后逐渐死亡, 与缺
钙症状相似; 存活下来的转化株也是生长缓慢, 植
株瘦小, 生育期明显推迟(金松恒等2004; Hammond
等 1998; Zhang等 2002; Caemmerer等 2005)。转
反义 RCA烟草在热胁迫(42 ℃)下与未经热胁迫的
比较, 野生型光合作用几乎完全能恢复, 而转基因
植株则恢复很少(Motohash等 2001)。利用Rubisco
植物生理学通讯 第 46卷 第 11期, 2010年 11月1098
小亚基基因的反义和超表达载体构建出Rubisco含
量不同的水稻转化株, 对其进行高温处理, 随着温
度从 25 ℃到 41 ℃的上升, 在每个 Rubisco含量水
平其活化态在降低, 但是25 ℃和41 ℃的活化态和
含量间的反应斜率没有改变(Makino和Sage 2007),
表明高温时RCA的热不稳定性并不是Rubisco活化
态的初始控制因子。RCA对C4途径的顺利进行也
是很重要的, 反义转化 RCA 的黄顶菊植株体内
Rubisco的含量虽然与野生型相似, 但因其RCA含
量极度减少, 导致 Rubisco的氨基甲酰化水平和叶
片光合作用降低(Caemmerer等 2005), 但 40 ℃短
期高温处理时, Rubisco氨基甲酰化水平的降低并
不与存在的RCA含量相关(Hendrickson等2008), 表
明RCA含量并不是C4光合作用过程中调节Rubisco
活化的唯一因子, 还有其他因子参与其中。
从上可看出, 体外定点突变和转反义基因技术
是近年来研究植物RCA结构与功能及其对Rubisco
调控关系的重要基因工程手段, 所得出的结果具有
较强的说服力, 今后仍将是揭示RCA的功能及分子
机制研究的重要技术手段。
5 结束语
从发现RCA至今, 广大研究者对其分子特性和
调控机理的认识已取得了重大进展。今后, RCA
研究的主要方向为: 利用基因工程技术、蛋白质组
学、代谢组学技术, 通过突变体(点突变)和转反义
RCA技术研究RCA亚基间相互作用、RCA的活化
机制、对 Rubisco的调节机制以及 RCA结构中氨
基酸残基和结构域对其功能的贡献, 以完善RCA作
用的分子基础。
随着全球气候变化, 异常高温经常出现, 关于
温度尤其是高温对RCA调节Rubisco活性影响的研
究将显得更有实际意义, 将人工改造的具有更高热
稳定性的 RCA基因导入植物, 提高 RCA活性与热
稳定性, 最终提高植物光合作用速率与效率将会是
可行的策略。
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