全 文 ：书西北植物学报!
"#$
!
%$
"
#
#$
""!%&""!
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#"""()"!*
"
!"#$
#
"#(""!%("+
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#",+$"$
%
-
,.//0,#"""()"!*,!"#$,"#,""!%
收稿日期$
!"#*("(!*
&修改稿收到日期$
!"#*(#!("1
基金项目$河南省科技攻关项目"
!#"!##"#!1
#&郑州市科技攻关项目"
#)#22344)!"
#
作者简介$崔
!
波"
#$!&
#!男!博士!教授!主要从事花卉分子生物学研究
5(67.8
$
879:;.<9
!
#$%,:96
"
通信作者$叶永忠!教授!博士生导师!主要从事植物生态学研究
5(67.8
$
=
>
=
?@
!
#$%,:96
铁皮石斛
1,23!
基因的克隆及表达分析
崔
!
波#!!王洁琼!!宋彩霞!!袁秀云#!
蒋素华#!梁
!
芳#!刘
!
佳!!叶永忠!"
"
#
郑州师范学院!郑州
)*""))
&
!
河南农业大学 生命科学学院!郑州
)*"""!
#
摘
!
要$为了研究铁皮石斛的光合特性!根据
A;<./:9
活化酶"
ABC
#基因的保守序列设计兼并引物!采用
A3(2BA
和
ACB5
方法从铁皮石斛叶中分离到一个
ABC
基因!命名为
!"#$%
"
4>0D70E
登录号
F3!"*1)#
#
!"#$%
基
因
:GHC
全长为
#+!)<
I
!包含
#%#+<
I
开放阅读框"
JAK
#!编码
)%1
个氨基酸系统进化分析显示!
!"#$%
与
马蹄莲
&#$%
"
CCF!*1"#,#
#亲缘关系最近生物信息学分析表明!
GJABC
与其他植物的
ABC
蛋白具有较高
一致性!属于
ABC
的
"
亚基
GJABC
蛋白具有定位于叶绿体的
H
端转运肽! 个保守的
C32
结合结构域和多个
磷酸化位点实时荧光定量
2BA
"
L
A3(2BA
#分析表明!
!"#$%
基因在茎(叶中表达&在自然光周期条件下!
!"#$%
基因在
1
$
%"
时表达量最高!
"
$
%"
时表达量最低!具有明显的光诱导表达特性
关键词$铁皮石斛&
A;<./:9
活化酶&分子特征&表达特性
中图分类号$
M+1*
&
M+1$
文献标志码$
C
$%"&#&

(&!)*
+
,-..#"&/&(%
0
.#."11,23!
2-&-1,"31)/.(&4-56&
77
-"-/$*)
BNOD9
#
!
!
PCH4Q.>
L
.90
R
!
!
SJH4B7.T.7
!
!
UNCHV.;
=
;0
#
!
QOCH4S;@;7
#
!
WOCH4K70
R
#
!
WONQ.7
!
!
U5U90
R
?@90
R
!
"
"
#X@>0
R
?@9;H9Y678B98>
R
>
!
X@>0
R
?@9;)*""))
!
B@.07
&
!B98>
R
>9ZW.Z>S:.>0:>/
!
[>070C
R
Y.:;8\;Y78N0.]>Y/.=
!
X@>0
R
?@9;
)*"""!
!
B@.07
#
/4.5,(65
$
39/\;^
=
\@>
I
@9\9/
=
0\@>/./9Z!()*+,-./0,
11
.2.)3(
!
_>./987\>^ 7Z;8(8>0
R
\@:GHC9ZA;<.(
/:97:\.]7/>!"#$%
"
C::>//.90H9,F3!"*1)#
#
ZY96\@./
I
870\<
=
\@>6>\@9^ 9ZA3(2BA70^ ACB5;(
/.0
R
>^
R
>0>Y7\>
I
Y.6>Y/ >^/.
R
0>^ 7::9Y^.0
R
\9\@>:90/>Y]>^ Y>
R
.909ZABC,3@>Z;8(8>0
R
\@:GHC9Z
!"#$%_7/#+!)<
I
!
_.\@70JAK9Z#%#+<
I
>0:9^.0
R
)%1
I
;\7\.]>76.097:.^/,2@
=
89
R
>0>\.:7078
=
/./
/@9_>^ \@7\!"#$%:89/>^ \9&#$%
"
CCF!*1"#,#
#
,D.9.0Z9Y67\.:/7078
=
/.//@9_>^ \@7\!"#$%<>(
890
R
>^ \9
"
./9Z9Y69ZABC
I
Y9\>.070^ @7^ @.
R
@.^>0\.\.>/_.\@9\@>Y
I
870\ABC/,3@>GJABC:90\7.0>^
7
I
Y>^.:\>^ H(\>Y6.078\Y70/.I
>
I
\.^>\9:@89Y9
I
87/!
\_9@.
R
@:90/>Y]>^ C32(<.0^.0
R
9^67.0/70^ 6;8\.(
I
8>
I
@9/
I
@9Y
=
87\.90/.\>/,3@>Y>78(\.6>
L
;70\.\7\.]>2BA
"
L
A3(2BA
#
Y>/;8\//@9_>^ \@7\!"#$%_7/90(
8
=
>^\>:\>^ .0
R
Y>>0\.//;>/,O0\@>#!@ 7^YE70^ #!@07\;Y788.
R
@I
@9\9
I
>Y.9^/
!
67T.67870^ 6.0.678
!"#$% 6AHC>T
I
Y>//.908>]>8/_>Y> >^\>:\>^ 7\1
$
%"70^ !"
$
%"
!
Y>/
I
>:\.]>8
=
!
_@.:@.0^.:7\>^ \@7!"#$%@7/\@>9<].9;/:@7Y7:\>Y./\.:/9Z8.
R
@\(.0^;:>^ >T
I
Y>//.90,
7-
0
8",!.
$
!()*+,-./0,
11
.2.)3(
&
A;<./:97:\.]7/>
&
698>:;87Y:@7Y7:\>Y./\.:/
&
>T
I
Y>//.90
I
7\\>Y0/
!!
铁皮石斛"
!()*+,-./0,
11
.2.)3(F.6;Y7>.`
R
9
#为兰科"
JY:@.^7:>7>
#多年生附生草本植物!
是石斛属"
!()*+,-./0
#药用植物中珍稀名贵的品
种!在中国主要分布在浙江(云南(四川(福建(广西(
安徽等地铁皮石斛富含多糖(生物碱(菲类化合物
等药用成分!在提高人体免疫力(抗衰老(抗肿瘤(降
血糖等方面具有显著的功效
近年来!光合机理研究日益受到研究者的重视!
其中
A;<./:9
"核酮糖
#
!
*(
二磷酸羧化酶%加氧酶#
活性的调节机制是一个重要的研究领域
A;<./:9
是所有光合生物进行光合碳同化的关键酶!它能催
化
A;D2
"
#
!
*(
二磷酸核酮糖#的羧化和加氧反应!并
调节二者之间的关系!这
!
个反应的比值决定了植
物的碳同化效率)#*已有研究表明!虽然
A;<./:9
含量占叶片可溶性蛋白的一半!但它的效率却很
低)!*
A;<./:9
只有处于活化态时!才能催化
BJ
!
固定因此!提高
A;<./:9
利用效率和活力是提高
光合作用的重要途径)%*在植物体中
A;<./:9
活性
受
A;<./:9
活化酶"
Y;<./:97:\.]7/>
!
ABC
#的调节
和控制!
ABC
是一种核编码的可溶性叶绿体蛋白!
广泛存在于光合生物中!具有
C327/>
活性!属于
CCC
a蛋白家族成员)*
ABC
的主要功能是活化
A;<./:9
!在适温条件下!
ABC
利用光合磷酸化产生
的
C32
使
A;<./:9
迅速与生理浓度
BJ
!
和
`
R
!a
结合形成
5B`
复合体"酶
(BJ
!
(`
R
#而达到最大的
活化程度!解除磷酸糖对
A;<./:9
活性的抑制作用!
完成对
A;<./:9
的活化)**
目前关于
ABC
的研究主要集中在粮食作物如
水稻)$*(小麦)+*(玉米)1*和观赏性园艺植物如彩叶
草)*(羽衣甘蓝)#"*等铁皮石斛作为名贵中草药!
因独特的保健功能使其市场需求逐年增加!但是生
长却比较缓慢因此!促进铁皮石斛的生长!提高生
产效率!是目前铁皮石斛产业发展的当务之急为
了更好地研究铁皮石斛的光合特性!本研究采用
ACB5
法克隆了
ABC
基因!并对其分子特性和表
达模式进行了分析!为进一步研究铁皮石斛的光合
作用奠定了基础
#
!
材料和方法
9,9
!
植物材料
实验材料为
#
年生铁皮石斛"
!()*+,-./0,
1
4
1
.2.)3(
#!来源于郑州师范学院兰花工程技术研究
中心选取生长一致的幼苗!从当晚
!"
$
%"
开始每
隔
)@
取样
#
次!到次日
!"
$
%"
结束!且采相同部位
的叶片!保存于
&1"b
冰箱!用于
AHC
提取
9,:
!
方
!
法
9;:;9
!
<=/
提取和
6>=/
合成
!
采用多糖多酚植
物总
AHC
提取试剂盒"
3.70
R
>0
公司#提取实验材
料总
AHC
!用
#c
琼脂糖凝胶电泳鉴定
AHC
完整
性&用
GN1""
核酸蛋白分析仪"美国
D>:E670
#测定
其
C
!$"
(
C
!1"
值!计算
AHC
浓度和纯度用
(`
`Wd
反转录酶"
37F7A7
公司#以提取的总
AHC
为模板!合成单链
:GHC
!具体方法参照试剂盒的说
明书
9;:;:
!
铁皮石斛
<$/
基因全长
6>=/
克隆
!
利用
生物软件
GHC`CH
和
2Y.6>Y*,"
!根据已有植物
ABC
序列的保守区!设计
#
对简并引物!上游引物
ABC(K#
"
*e(4CU4CBBC4BC44CBC3CCBBC(
%e
#和下游引物
ABC(A#
"
*e(334334CB4434(
3CB344434(%e
#!以叶
:GHC
为模板!扩增铁皮
石斛
ABC
基因的保守片段
2BA
反应体系为
!"
#
W
!包含
#"f2BA
缓冲液
!,"
#
W
!
H^32 .`T!,"
#
W
!上下游引物"
#"
#
698
%
W
#各
#,"
#
W
!
:GHC
模板
#,"
#
W
!
Y5
6
酶"
*N
%
#
W
#
",!
#
W
!加灭菌双蒸水至
总体积
!"
#
W
反应程序为
)b
预变性
)6.0
&
)
b
变性
)"/
!
*$b
复性
)"/
!
+!b
延伸
)"6.0
!
%*
个循环&最后
+!b
延伸
!"6.0

2BA
产物经
#c
琼
脂糖凝胶电泳检测后利用凝胶试剂盒"
3.70
R
>0
公
司#回收目的片段!连接
I
45` (357/
=
载体!转化
782,3.G[*
$
挑选阳性克隆送至上海英骏生物技术
公司测序
根据上步所得的
ABC
基因片段序列!设计
#
对
%e
端特异引物
4S2#
"
*e(3434B34BB3B3(
3BC3BCC34(%e
#和
4S2!
"
*e(CBBCBBBC43C(
BCBB43BCC(%e
#!
#
对
*e
端特异引物
42S%
"
*e(
C3CB34CB4CC4CBB3344B34C3(%e
#和
42S)
"
*e(BCBBB333BB3B34433C343BB3(%e
#!按
B890\>:@
公司
S` CA3>YACB5:GHCC6
I
8.Z.:7(
\.90F.操作说明进行反应!回收扩增产物!连接到
I
45 (`357/
=
载体上!转入大肠杆菌
G[*
$
菌株!
鉴定后进行测序
9;:;?
!
铁皮石斛
<$/
基因生物信息学分析
!
用
GHC`CH
软件分析拼接
:GHC
测序序列!得到正
确的铁皮石斛
ABC
基因序列铁皮石斛
ABC
蛋
白的分子特征主要采用生物信息学方法进行分析
D87/搜索分析(
JAKZ.0^.0
R
(核苷酸翻译以及蛋白
保守结构域均在
HBDO
"
@\I
$%%
___,0:<.,086,
0.@,
R
9]
%#网站上进行&不同
ABC
蛋白序列的多重
)!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
比对利用
B8;/\78V
和
GHC`CH
软件生成比对结果!
再利用
5`4C*,"
进行系统进化树构建&应用
5T(
2CS
=
(
S` CA3
(
H>\2@9/,!,"/>Y]>Y
(
3` 2A5G
(
37Y(
R
>\2#,#/>Y]>Y
等综合软件分析包预测
ABC
蛋白
的基本性质(结构特点(磷酸化位点(跨膜结构域和
亚细胞定位等
9;:;@
!
铁皮石斛
<$/
基因表达分析
!
利用
2Y.6>Y
*,"
设计铁皮石斛
ABC
基因实时荧光定量
2BA
引物
L
A3(ABCK
"
*e(343BCCBB4C433BBCB33CBB(
%e
#和
L
A3(ABCA
"
*e(3B4C443BC4BC4BBCC4C(
%e
#以铁皮石斛的
79#
!
作为内参基因)##*!引物为
5K#
$
K
"
*e(3BC44B34CB3434B343BB3(%e
#和
5K#
$
A
"
*e(4344344B43BBC3B33433(%e
#分
别提取铁皮石斛不同组织部位!不同时间点的总
AHC
!使用
2Y.6>S:Y.
I
\A3Y>7
R
>0\F.\_.\@
R
G(
HC5Y7/>Y
"
37F7A7
#反转录合成单链
:GHC
实
时荧光定量
2BA
反应体系和程序参照宝生物工程
"大连#有限公司
SUDA2Y>6.T5T5
6
3`
%
"
38.
AH7/>[28;/
#试剂盒说明书反应体系为
!"
#
W
!
所用仪器为
5
II
>0^9YZ 7`/\>Y:
=
:8>Y>
I
Y>78
I
8>T!

反应程序为
*b
预变性
#*/
!
*1b
变性
#*/
!
+!b
退火
#*/
!
)"
个循环每样品重复
%
次!采用公式
!
&
&&
$
\法计算基因相对表达量
!
!
结果与分析
:;9
!
铁皮石斛
<$/
基因全长
6>=/
克隆
以铁皮石斛叶片
:GHC
为模板!扩增出
#
条长
度为
*"%<
I
的特异保守片段"图
#
#!测序并在
HB(
DO
上
D87/分析!该片段与多种植物的
ABC
序列有
较高一致性"
1"c
以上#!证明该片段为
ABC
片段
根据该片段设计
ACB5
引物!利用
%e
端引物
4S2#
和
4S2!
扩增得到
%e
端目的片段!用
*e
端引物
42S%
和
42S)
扩增得到
*e
端目的片段"图
!
#将特异保
守片段(
%e(ACB5
和
*e(ACB5
序列拼接获得铁皮
石斛
ABC
的
:GHC
!命名为
!"#$%
!全长为
#+!)
<
I
!利用
HBDO
在线工具
JAKZ.0^>Y
确定该基因的
JAK
长
#%#+<
I
!编码
)%1
个氨基酸!包含起始密
码子和终止密码子
*e
端非编码区为
1#<
I
!
%e
端非
编码区为
%!*<
I

:;:
!
>A<$/
蛋白序列的理化性质
!"#$%
基因编码一个
)%177
的前体蛋白!蛋
白的分子量为
)1,!*EG
!理论等电位点为
$,#
应
用在线分析软件
37Y
R
>\2#,#S>Y]>Y
对
GJABC
氨
基酸序列进一步分析发现!此氨基酸序列的前
*+
个
`,` 7YE>Y
&
#,2BA
产物
图
#
!
!"#$%
基因片段的
2BA
扩增结果
`,` 7YE>Y
&
#,2Y9^;:\9Z2BA
K.
R
,#
!
3@>2BAY>/;8\<7/>^ 90!"#$%
R
>0>ZY7
R
6>0`,` 7YE>Y
&
#,*e(ACB5
&
!,%e(ACB5
图
!
!
!"#$%
基因
%e(ACB5
和
*e(ACB5
扩增结果
K.
R
,!
!
3@>2BAY>/;8\/9Z%e(ACB570^
*e(ACB5Z9Y!"#$%
氨基酸残基为叶绿体转运肽"图
%
#!因此成熟蛋白
分子量为
)#,#EG
!推测以
"
"
)#

)%EG
#亚基存在
3 2`A5G
对氨基酸序列进行跨膜结构预测表明在
H
端区域内"第
#+

%%
位
77
#具有跨膜结构
H>\(
2@9/!,"S>Y]>Y
预测表明!
GJABC
蛋白有
1
个
S>Y
磷酸化位点!
)
个
3@Y
磷酸化位点和
*
个
3
=
Y
磷酸
化位点!这表明蛋白翻译后修饰对
GJABC
蛋白功
能的实现起重要作用
S` CA3
和
BGS
保守结构
域搜索表明!
GJABC
蛋白含有一个
C32
酶的高度
保守的
2(899
I
H327/>S;
I
>YZ76.8
=
结构域"图
%
#!
其中在
#$!

%"77
位点范围内包含
CCC
a蛋白家
族折叠区!含有
!
个保守的
C32
结合基序"
69\.Z
#!
分别 为 +
P44F4M4FS
,"
C
区#和 +
4F`B(
BWKOHGWG
,"
D
区#
:;?
!
不同植物
<$/
基因系统进化分析
用
HBDO
上的
D87/I
程序和
GHC`CH
多序
列对比分析表明!
GJABC
蛋白序列与许多植物的
ABC
具有较高的一致性!其中与油棕 "
73(.:
;
/.)(():.:
#的一致性最高!达
1+c
将
!"#$%
基
因氨基酸序列与
4>0D70E
蛋白质数据库进行氨基
酸序列同源性比对!发现具有较高一致性的植物包
括$海枣"
<=,().>*2?
@
3.
1
(+
#(荷花"
A(3/0-,)/4
2.
1
(+
#(葡萄"
B.?.:C.).
1
(+
#(可可"
5=(,-+,0
*!
#
期
!!!!!!!!!!!!!
崔
!
波!等$铁皮石斛
!"#$%
基因的克隆及表达分析
起始密码子
C34
用下划线表示!终止子
3C4
用星号和下划线表示&灰色背景表示定位于
叶绿体的
H
端转运肽&方框表示
!
个推测的
C32
结合位点
2(
环序列
图
%
!
!"#$%
基因核苷酸序列和推测的氨基酸序列
3@>C34.0.\.7\.90:9^90./;0^>Y8.0>^
&
"
70^ ;0^>Y8.0>^ ./\@>\>Y6.078:9^90
&
3@>
I
;\7\.]>H(\>Y6.078:@89Y9
I
87/\Y70/.I
>
I
\.^>./67YE>^ _.\@
R
Y7
=
<7:E
R
Y9;0^
&
3@>C32<.0^.0
R
Y>
R
.90/9Z!2(899
I
7Y>67YE>^ _.\@<98^ <9T
K.
R
,%
!
K;8:GHC0;:8>9\.^>7:.^ />
L
;>0:>70^ >^^;:>^ 76.09/>
L
;>0:>9Z!"#$%
R
>0>
方框代表本研究的
!"#$%
在系统进化树中的位置&图中分支上的数字表示
D99\/\Y7
I
验证中
基于
#"""
次重复该节点可信度的百分比&括号内为氨基酸登录号
图
)
!
!"#$%
与其他
ABC
基因的系统进化树
3@><98^ <9T.0^.:7\>/!"#$%
I
9/.\.90.0\@>
I
@
=
89
R
>0>\.:\Y>>
&
3@>0;6<>Y/90\@>/Y>
I
Y>/>0\\@>
Y>8.7<.8.=I
>Y:>0\9ZD99\/\Y7
I
]78;>/<7/>^ 90#"""Y>
I
8.:7\.90/
&
3@>7::>//.90H9,_7/
R
.]>0.0\/
K.
R
,)
!
2@
=
89
R
>0>\.:\Y>>9Z!"#$%_.\@9\@>YABC
R
>0>/
$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
22,
#(麦 冬 "
"
D
=.,
D
,
;
,)
E

D
,).2/:
#(马 蹄 莲
"
&)?(*(:2=.(?=.,
D
.2:
#和大豆"
F3
@
2.)(0>
#
等!与这些基因的一致性都在
1"c
以上在
`54C
*,"
软件上运用
B;/\78V
对这些氨基酸序列进行系
统进化树构建"图
)
#!结果表明!
GJABC
与单子叶
植物马蹄莲"
&)?(*(:2=.(?=.,
D
.2:
#的亲缘关系
最近多序列比对也表明
GJABC
蛋白的
B
末端
没有受硫氧化蛋白
Z
"
3YT(Z
#的氧化还原作用所调
节的
!
个
B
=
/
残基"图
*
#!表明
GJABC
蛋白属于
"
亚基!这与
GJABC
蛋白分子量为
)#,#EG
属于
"
亚基的分析一致
$
亚基
B
末端的特异
B(>T\>0/.90
结构用方框表示&
!
个推测的
C32
结合位点
2(
环序列用方框
C
(
D
表示&
黑色背景表示完全一样的氨基酸序列多序列比对所用的
ABC
蛋白序列和
4>0D70E
登录号$
GJABC,
铁皮石斛"
F3!"*1)#
#&
X7ABC(D,
马蹄莲"
CCF!*1"#,#
#&
d]ABC(D,
葡萄"
V2"#"$*)!)1,#
#&
4@ABC(D,
陆地棉"
CC4$##!",#
#&
46ABC(C,
大豆"
H2""#!)!*%#,#
#&
d]ABC(C,
葡萄"
V2""!!+"*+#,!
#&
5
R
ABC(C,
油棕"
V2"#"!"*!%,#
#
图
*
!
!"#$%
氨基酸序列比对
3@>/
I
>:.78/\Y;:\;Y>9ZB(>T\>0/.909Z
$
/;<;0.\./.0<9T,3@>C32<.0^.0
R
Y>
R
.90/9Z!2(899
I
7Y>67YE>^ _.\@<98^ <9TC70^ D,
S@7^>/.0<87:EY>
I
Y>/>0\.^>0\.:7876.097:.^/7690
R
\@>@96989
R
9;/
I
Y9\>.0/,C87<].7\.9070^ 4>0D70EC::>//.90H9,7Y>
/@9_0.0\@./
$
GJABC,!()*+,-./0,
11
.2.)3(
"
F3!"*1)#
#&
X7ABC(D,&)?(*(:2=.(?=.,
D
.2
"
CCF!*1"#,#
#&
d]ABC(D,B.?.:C.).
1
(+
"
V2"#"$*)!)1,#
#&
4@ABC(D,F,::
@D
./0=.+:/?/0
"
CC4$##!",#
#&
46ABC(C,F3
@
2.)(
0>
"
H2""#!)!*%#,#
#&
d]ABC(C,B.?.:C.).
1
(+
"
V2""!!+"*+#,!
#&
5
R
ABC(C,73(.:
;
/.)(():.:
"
V2"#"!"*!%,#
#
K.
R
,*
!
B96
I
7Y./909Z\@>76.097:.^ />
L
;>0:>9Z!"#$%
+!
#
期
!!!!!!!!!!!!!
崔
!
波!等$铁皮石斛
!"#$%
基因的克隆及表达分析
:;@
!
1,23!
表达模式分析
为了研究
!"#$%
基因在铁皮石斛组织中的表
达模式!采用实时荧光定量
A3(2BA
对铁皮石斛的
根(茎(叶进行分析!结果显示!
!"#$%
主要在绿色
组织中表达!其中叶片中的表达量最高!在茎中相对
表达量较少!而在根中几乎检测不到"图
$
#本研
究得出的结论与玉米)1*(水稻)$*等
ABC
只在绿色
组织中特异性表达相一致研究表明!大量光合作
用相关基因受光照和生物钟节律的调控!为了检测
!"#$%
是否受光调节!选取生长在每天
#!@
自然
光照"
$
$
""

#1
$
""
#和
#!@
黑暗条件"
#1
$
""

$
$
""
#下的铁皮石斛幼苗!提取相应时间点的叶
AHC
!进行
L
A3(2BA
表达分析结果显示"图
$
#!
在自然光周期条件下!
!"#$%
表达量变化呈现出
明显的生物钟特性黑暗周期过程中!
!"#$%
的
相对表达量逐渐增加!至上午
1
$
%"
时达到最大值!
随后逐渐降低!到晚上
!"
$
%"
降至最低另外结果
还显示!
!"#$%
基因表达水平较高的时间段主要
集中在
)
$
%"

#!
$
%"

!"#$%
受光调节的特点与
玉米)1*(苹果)##*等多种植物
ABC
受光调节并具有
昼夜节奏的表达特性相同
A
(
S
和
W
分别代表根(茎(叶
图
$
!
!"#$%
在铁皮石斛不同部位和
不同光照时间下的表达
A
!
S70^ WY>
I
Y>/>0\Y99!
/\>670^ 8>7Z
K.
R
,$
!
!"#$%>T
I
Y>//.90
I
7\\>Y0/.0 .^ZZ>Y>0\.//;>/70^ .^ZZ>Y>0\.8;6.07\.90\.6>/
%
!
讨
!
论
在植物光合作用的研究中!关于
A;<./:9
活化
酶活性调节机制一直是一个重要的研究领域
A;<./:9
活化酶是维持和调节
A;<./:9
活性所必需
的!在植物体中只有
A;<./:9
活化酶存在时
A;<./:9
才能保持较高的催化活性)#!*在本研究中利用
A3(2BA
和
ACB5
技术从铁皮石斛中扩增出了一
个
ABC
基因的全长
:GHC
序列
!"#$%
"
4>0D70E
登录号
F3!"*1)#
#并利用生物信息学方法对
GJABC
蛋白的分子特征进行分析和预测结果表
明
!"#$%
基因
:GHC
全长
#+!)<
I
!编码
)%1
个
氨基酸的前体蛋白!
H
端具有
*+
个氨基酸的叶绿体
转运肽!是核基因编码的叶绿体蛋白
!"#$%
编
码的成熟蛋白具有
ABC
蛋白都含有的
!
个保守的
C32
结合基序!属于
CCC
a 蛋白家族系统进化
树显示
!"#$%
基因的氨基酸序列与其他已知植物
ABC
具有高度一致性!且与马蹄莲亲缘关系最近属
于同一支
大量研究表明!植物
ABC
基因具有组织表达
特异性
W.;
等)#%*研究发现拟南芥
ABC
基因只在
绿色组织如叶(茎(角果中表达
P7\.890
等)#)*研
究发现苹果
ABC
基因同样在叶片中能大量检测
到!但在根和茎中几乎检测不到本研究利用实时
荧光定量
A3(2BA
方法得出的检测结果与前人结
果相似)#%(#)*!且与
A;<./:9
仅在绿色组织中特异表
达相一致同时多数植物
ABC
基因的表达还受到
光的诱导及生物钟的调控)#*(#$*!本研究中同样发现
铁皮石斛
ABC
基因昼夜表达变化节奏性!开始时
表达水平最低!然后表达量逐渐增加!至上午
1
$
%"
时表达量达到最大值!随后逐渐降低!表现出了生物
钟特性
不同植物
ABC
亚基的种类和数量是不同的!
如小麦)+*(水稻)$*(拟南芥)#+*(大豆)#1*(菠菜)#+*(棉
花)#*等植物均含有
$
和
"
亚基!而有些植物如黄
瓜)!"*(玉米)1*(烟草)#**等却只表达
"
亚基植物
ABC
的
$
亚基大小范围在
)*

)+EG
!而且只有
$
亚基的
B
末端具有调节硫氧还蛋白
Z
"
3YT(Z
#的
!
个
B
=
/
残基!
"
亚基的大小为
)#

))EG
!
B
末端没
有保守结构)#$*
GJABC
蛋白经多重序列对比表
明!其
B
端没有
$
亚基所具有的
!
个
B
=
/
残基!并且
成熟蛋白大小为
)#,#EG
!说明属于
"
亚基形式
研究表明无论何种形式的亚基!来源于同种或是不
同种的植物抗体之间都有可能发生交叉反应)#1*
另外!
ABC
基因的表达方式也各不相同!有的是由
一个
ABC
基因通过选择性剪接编码
!
个亚基!有
的是不同基因编码同一个亚基)!#*因此!在铁皮石
斛中是否还具有
$
亚基形式!以及其
"
亚基是否是
由一个或者多个基因编码的!还需要利用
S9;\@>Y0
<89\\.0
R
及
P>/\>Y0<89\\.0
R
等技术进一步进行分
析确定
1!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
苏文华等)!!*研究表明!铁皮石斛叶片具有兼性
BC`
植物的特点!晴天呈
BC`
途径(阴雨天呈
B
%
途径!多云天气在上述两种途径之间变化本试验
关于
!"#$%
基因的分子克隆与表达特性的研究!
为进一步研究铁皮石斛复杂的光合作用奠定了基
础目前正在构建
!"#$%
基因的超表达载体进行
遗传转化!试图进一步解释其调控的分子机制
参考文献!
)
#
*
!
`CFOHJC
!
`C53
!
J[OACF,2;Y.Z.:7\.9070^ /\9Y7
R
>9Z
Y.<;89/>#
!
*(<./
I
@9/
I
@7\>:7Y<9T
=
87/>ZY96Y.:>8>7]>/
)
Q
*
,
<3)?)*$(33<=
@
:.,3,
;@
!
#1%
!
:@
"
$
#$
##$(##+%,
)
!
*
!
`CHHBB,4>0>\.:>0
R
.0>>Y/7.6\9/9;
I
;
I
:Y9
II
@9\9/
=
0(
\@>/./
)
Q
*
,G2.()2(
!
#
!
:B?
"
*)""
#$
%#)(%#$,
)
%
*
!
2JA3OSQACA,A;<./:97:\.]7/>(A;<./:9
-
/:7\78
=
\.::@7
I
>Y(
90>
)
Q
*
,<=,?,:
@
)?=(:.:#(:(+2=
!
""%
!
CD
"
#
#$
##(!+,
)*
!
张
!
国!王
!
玮!邹
!
琦
,A;<./:9
活化酶的分子生物学)
Q
*
,
植
物生理学通讯!
"")
!
@E
"
*
#$
%%($%+,
!!!
X[CH44
!
PCH4 P
!
XJNM,` 98>:;87Y<.989
R=
9ZA;<./:9
7:\.]7/>
)
Q
*
,<3)?<=
@
:.,8$,00/8
!
"")
!
@E
"
*
#$
%%($%+,
)
*
*
!
WOWW5UA`
!
2JA3OSCAQA,C:\.]7\.909ZY.<;89/>(#
!
*(<.(
/
I
@9/
I
@7\>:7Y<9T
=
87/>
%
9T
=R
>07/>
"
Y;<./:9
#
<
=
Y;<./:97:\.(
]7/>
)
Q
*
,<3)?<=
@
:.,38
!
#"
!
)
$
!)*(!)+,
)
$
*
!
3JFU
!
SN5HGK
!
B[5HSB4,` 98>:;87Y:@7Y7:\>Y.?7\.90
9ZY.<;89/>(#
!
*(<./
I
@9/
I
@7\>:7Y<9T
=
87/>
%
9T
=R
>07/>7:\.]7/>
.0Y.:>8>7]>/
)
Q
*
,<3)?
!
#
!
:EF
"
#
#$
$(+$,
)
+
*
!
WCP AG
!
BACK3S(DACHGH5ASQ,[.
R
@\>6
I
>Y7\;Y>/\Y>//
.0:Y>7/>/\@>>T
I
Y>//.909Z_@>7\8>7ZY.<;89/>(#
!
*(<./
I
@9/
I
@7\>
:7Y<9T
=
87/>
%
9T
=R
>07/>7:\.]7/>
I
Y9\>.0
)
Q
*
,%+2=.C(:,
1
H.,2=(0.:4
?+
@
)*H.,
D
=
@
:.2:
!
""#
!
?BG
"
!
#$
!$#(!$+,
)
1
*
!
CUCWC(JB[JCC
!
dCA4CS(SNCA5X`
!
WJXC(3Cd5AC [
!
(?3,O067.?>
!
\_9^./\.0:\Y.<;89/>#
!
*(<./
I
@9/
I
@7\>:7Y<9T
=
87/>
%
9T
=R
>07/>7:\.]7/>\Y70/:Y.
I
\/@7]> .^ZZ>Y>0\^ 7
=
%
0.
R
@I
7\\>Y0/9Z
>T
I
Y>//.90
)
Q
*
,H.,2=.0.(
!
"")
!
BG
"
+
#$
)%()),
)

*
!
祝钦泷!谢先荣!眭顺照!等
,
彩叶草
A;<./:9
活化酶基因
G:#4
$%
的分子特征及其表达模式)
Q
*
,
西北植物学报!
!"##
!
?9
"
$
#$
#"+(##"),
!!!
X[NMW
!
VO5VA
!
4NOVX[
!
(?3,` 98>:;87Y:@7Y7:\>Y./\.:/
70^ >T
I
Y>//.90
I
7\\>Y0/9Z709]>8A;<./:97:\.]7/>
R
>0>
!
G:#$%
!
ZY96G,3(),:?(0,):2/?(33+.,.*(:
"
W,
#
B9^^
)
Q
*
,%2?H,?8H,+(4
384"22.*()?8G.)8
!
"##
!
?9
"
$
#$
#"+(##"),
)
#"
*
!
朱明库!陈国平!周
!
爽!等
,
羽衣甘蓝
A;<./:9
活化酶基因
H,#$%
的克隆!生物信息学及表达分析)
Q
*
,
云南大学学报
"自然科学版#!
"#%
!
?D
"
$
#$
1*+(1$*,
!!!
X[N ` F
!
B[5H42
!
X[JNS[
!
(?3,B890.0
R
!
<.9.0Z9Y(
67\.:/70^ >T
I
Y>//.907078
=
/./9ZA;<./:97:\.]7/>
R
>0>H,#4
$%ZY96H+::.2,3(+2(
)
Q
*
,I,/+)3,
1
J/))K).C(+:.?
@
"
H7\,S:.,5^.,
#!
"#%
!
?D
"
$
#$
1*+(1$*,
)
##
*
!
ANHGW5SQ
!
XO5WOHSFOA5,JY
R
70.?7\.9070^ >T
I
Y>//.90
9Z\_9\70^>68
=
9Y.>0\>^
R
>0>/>0:9^.0
R
Y.<;89/><./
I
@9/(
I
@7\>:7Y<9T
=
87/>
%
9T
=R
>07/>7:\.]7/>.0<7Y8>
=
)
Q
*
,I,/+)3
,
1
H.,3,
;
.23$=(0.:?+
@
!
##
!
:GG
"
1
#$
)$++()$1*,
)
#!
*
!
张
!
岗!赵明明!张大为!等
,
铁皮石斛实时定量
2BA
内参基
因的筛选)
Q
*
,
中国药学杂志!
"#%
!
#
$
#*,
!!!
X[CH44
!
X[CJ``
!
X[CH4GP
!
(?3,A>Z>Y>0:>
R
>0>/>(
8>:\.90Z9YY>78(\.6>
L
;70\.\7\.]>2BA7078
=
/./9Z!()*+,-./0,
1
4
1
.2.)3(
)
Q
*
,$=.)8<=+08I8
!
"#%
!
@B
"
#
#$
#$$)(#$$1,
)
#%
*
!
WONX
!
3CNDBB
!
B`BWNH4BA,O^>0\.Z.:7\.909Z70%+-.4
*,
D
:.:?=3.)Y.<;89/>(#
!
*(<./
I
@9/
I
@7\>:7Y<9T
=
87/>
%
9T
=R
>07/>
7:\.]7/>
"
ABC
#
6.0.678
I
Y969\>YY>
R
;87\>^ <
=
8.
R
@\70^ \@>:.Y(
:7^.70:89:E
)
Q
*
,<3)?<=
@
:.,3,
;@
!
#$
!
99:
"
#
#$
)%(*#,
)
#)
*
!
PC3OWWJHD
!
F533`CHHA
!
DJVNS2
!
(?3,G>]>89
I
(
6>0\7870^ :.Y:7^.70
I
7\\>Y09ZY;<./:97:\.]7/>6AHC7::;(
6;87\.90.07
II
8>
I
870\/
)
Q
*
,<3)?L,3(2/3+H.,3,
;@
!
#%
!
:?
"
%
#$
*"#(*",
)
#*
*
!
MOCHQ,
!
AJG5A 5`WS,A,A.<;89/>(8
!
*(<./
I
@9/
I
@7\>:7Y(
<9T
=
87/>
%
9T
=R
>07/>7:\.]7/>:GHC/ZY96A.2,?.)?-2/0
)
Q
*
,<3)?<=
@
:.,38
!
#%
!
#"!
$
1%($1),
)
#$
*
!
AJ5SW5A F A
!
J4A5H P W,2Y.67Y
=
/\Y;:\;Y>9Z
$=30
@
*,0,):+(.)=+*?..Y.<;89/>#
!
*(<./
I
@9/
I
@7\>:7Y(
<9T
=
87/>
%
9T
=R
>07/>7:\.]7/>70^ >].^>0:>Z9Y7/.0
R
8>
I
98
=
(
I
>
I
\.^>
)
Q
*
,<3)?<=
@
:.,3,
;@
!
#"
!
F@
"
)
#$
#1%+(#1)#,
)
#+
*
!
P5AH5F5Q`
!
B[C3KO5WGQ`
!
J4A5H PW,C8\>Y07(
\.]>6AHC/
I
8.:.0
RR
>0>Y7\>/\@>\_9Y.<;89/><./
I
@9/
I
@7\>
:7Y<9T
=
87/>
%
9T
=R
>07/>7:\.]7/>
I
98
=I
>
I
\.^>/.0/
I
.07:@70^
%+-.*,
D
:.:
)
Q
*
,5=(<3)?$(33
!
#1
!
9
"
1
#$
1#*(1!*,
)
#1
*
!
UOHX
!
5`H4K
!
SJH4 [
!
(?3,5T
I
Y>//.90
L
;70\.\7\.]>
\Y7.\89:.7078
=
/./9Z\_9
R
>0>/>0:9^.0
R
Y;<./:97:\.]7/>.0
/9
=
<>70
)
Q
*
,<3)?<=
@
:.,3,
;@
!
"#"
!
9D:
"
%
#$
#$!*(#$%+,
)
#
*
!
SCWdNBBO`5
!
dCH G5WJJKQ
!
S35B[5AG,3_9./9(
Z9Y6/9ZA;<./:97:\.]7/>.0:9\\90
!
\@>
I
Y9^;:\/9Z/>
I
7Y7\>
R
>0>/
09\78\>Y07\.]>/
I
8.:.0
R
)
Q
*
,<3)?
!
""%
!
:9G
"
*
#$
+%$(+)),
)
!"
*
!
X[CH4H
!
FCWWOSA2
!
5PUA4
!
(?3,W.
R
@\69^;87\.909Z
A;<./:9.0%+-.*,
D
:.:Y>
L
;.Y>/7:7
I
7:.=
Z9YY>^9TY>
R
;87\.909Z
\@>87Y
R
>YA;<./:97:\.]7/>./9Z9Y6
)
Q
*
,<+,2((*.)
;
:,
1
?=(A4
?.,)3%2*(0
@
,
1
G2.()2(:
!
""!
!
FF
"
*
#$
%%%"(%%%),
)
!#
*
!
李海霞!王真梅!曾汉来
,
植物
A;<./:9
活化酶的研究进展
)
Q
*
,
植物生理学报!
"#"
!
@G
"
##
#$
#"!(##"",
!!!
WO[V
!
PCH4X`
!
X5H4[W,3@>Y>/>7Y:@
I
Y9
R
Y>//>/.0
A;<./:97:\.]7/>.0
I
870)
Q
*
,<3)?<=
@
:.,8$,00/8
!
!"#"
!
@G
"
##
#$
#"!(##"",
)
!!
*
!
苏文华!张光飞
,
铁皮石斛叶片光合作用的碳代谢途径)
Q
*
,
植
物生态学报!
""%
!
:C
"
*
#$
%#($%+,
!!!
SNP[
!
X[CH44K,3@>
I
@9\9/
=
0\@>/./
I
7\@_7
=
.08>7]>/
9Z!()*+,-./0,
11
.2.)3(
)
Q
*
8%2?<=
@
?,(2,3,
;
.2G.).2
!
!""%
!
:C
"
*
#$
%#($%+,
!编辑"宋亚珍#
!!
!
#
期
!!!!!!!!!!!!!
崔
!
波!等$铁皮石斛
!"#$%
基因的克隆及表达分析