全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (4): 389~394　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2013.0234 389
收稿 2013-08-30　　修定 2014-02-28
资助 河南省教育厅科学技术研究重点项目(13B180288)和河南
省教育厅自然科学基础研究专项基金(2011B180007)。
* 通讯作者(E-mail: ln877979316@hotmail.com; Tel: 0371-
67673815)。
6-BA拮抗脱落酸缓解渗透胁迫对种子萌发的抑制
李娜1,2,*, 王琳丹2
1郑州澍青医学高等专科学校基础医学部, 郑州450000; 2棉花生物学国家重点实验室, 河南大学生命科学学院, 河南开封
475004
摘要: 细胞分裂素促进细胞分裂、芽的分化, 拮抗脱落酸抑制的种子萌发, 而细胞分裂素合成基因Ipt8在种子萌发过程中发
挥重要的作用。本文分别用120 mmol·L-1 NaCl和240 mmol·L-1甘露醇模拟盐和干旱胁迫处理拟南芥种子, 探讨6-BA拮抗
ABA对其抑制种子萌发和萌发后生长的影响。结果表明, 细胞分裂素合成相关突变体ipt6-1、ipt6-2、ipt8-1和ipt8-2的种子
萌发和生长可被NaCl和甘露醇显著抑制; 而ABA合成相关突变体aba2-1对相同浓度NaCl和甘露醇的处理表现相对不敏
感。进一步研究发现添加外源6-BA可恢复ipt6-1、ipt6-2、ipt8-1和ipt8-2的相关敏感表型, 并且随6-BA浓度的增加, 恢复效
果也愈趋明显。
关键词: 脱落酸; 细胞分裂素; 萌发; 渗透胁迫
Alleviation of 6-BA Antagonizing ABA on the Inhibition of Seed Germination
by Osmotic Stress
LI Na1,2,*, WANG Lin-Dan2
1Faculty of Basic Medicine, Zhengzhou Shuqing Medical College, Zhengzhou 450000, China; 2State Key Laboratory of Cotton
Biology, College of Life Sciences, Henan University, Henan, Kaifeng 475004, China
Abstract: Cytokinins promote cell division, differentiation of buds, antagonist abscisic acid inhibition of seed
germination. The cytokinin biosynthesis gene Ipt8 plays an important role in the process of seed germination. In this
paper, we studied the alleviation of 6-BA antagonizing ABA on the inhibition of seed germination in Arobidopsis
thaliana by osmotic stress. And the Arobidopsis seeds were treated with 120 mmol·L-1 NaCl and 240 mmol·L-1
manntiol to simulate the salt and drought stress. The results showed that the seed germination and growth of
cytokinin biosynthesis mutants ipt6-1, ipt6-2, ipt8-1, and ipt8-2 were significantly inhibited by NaCl and mannitol.
But the ABA biosynthesis the mutant aba2 was insensitived to same concentrations of NaCl and manntiol. Further
results showed that the sensitived ecotype of ipt6-1, ipt6-2, ipt8-1, ipt8-2 could be recovered by adding exogenous
cytokinin (6-BA), otherwise the effects were more obvious with the increasing concentrations of 6-BA.
Key words: abscisic acid; cytokinin; germination; osmotic stress
土壤盐渍化是现代农业所面临的主要问题之
一, 盐分胁迫影响植物的产量、蛋白质合成、光
合作用以及能量代谢(Parida和Das 2005)。近几年,
关于作物对盐胁迫的响应机制已做了大量的研究
(吕金印等2008; 张云华等2004; 陈源闽等2010; 李
卫欣等2010; 孙慕华等2010; 郭峰等2010)。盐胁迫
对棉花种子萌发和幼苗生长的伤害主要涉及渗透
胁迫、离子毒害以及对酶活性的抑制(孙小芳等
2000)。同时, 干旱胁迫也是自然界中最主要的非
生物胁迫之一, 严重影响了种子的萌发和幼苗的
正常生长过程(吴文荣等2012)。
通常, 干旱和盐渍处理等非生物胁迫可以促使脱
落酸(abscisic acid, ABA)浓度的升高(周金鑫等2008)。
ABA作为一种植物激素在植物生长发育过程中起
重要作用, 如促进果实与叶片脱落、器官衰老和气
孔关闭, 影响植物开花、调节种子和胚的发育等生
理功能(Bleecker和Patterson 1997; Finkelst 2006;
Leonardi等1995; Mishra等2006; Gao等2007)。ABA
被认为与种子的休眠有关(付婷婷等2008)。在许
多物种中, 内源ABA涉及种子休眠状态的诱导与
维持(Leubner-Metzger 2003; Nam-bara和Marion-Poll
2003)和种子萌发的抑制(Hilhorst 1995; Kermode
2005)。发育中的种子提早萌发通常与ABA的缺乏或
植物生理学报390
者不敏感有关(Hilhorst 1995; Bewley 1997), 例如玉米
胎萌突变体(vp)、番茄ABA缺乏突变体(sit)以及拟
南芥ABA缺乏突变体(aba)和ABA不敏感突变体(abi)
(Bewley 1997)等。而外加ABA可防止种子发生胎萌
(洪克前和张妙彬2004)。ABA是种子休眠诱导的正
调节因子和萌发的负调节因子(付婷婷等2008)。
细胞分裂素(cytokinin, CTK)能促进顶端优
势、休眠芽的萌发和休眠种子的萌发(罗超等2011;
Cohn和Butera 1982), 其中CTK对种子萌发的促进
作用主要是通过与ABA的相互作用实现的, CTK与
ABA同时出现时表现出拮抗效应(杨荣超等2012)。
抗CTK的烟草突变体种子表现出休眠程度降低以
及对CTK-ABA相互作用的多效性(Fischer-Iglesias
和Neuhaus 2001)。但是关于CTK和ABA在种子萌
发过程中的具体相互作用知之甚少。最新的研究
报道中, 关于CTK和ABA共同参与调控的种子休眠
与萌发信号传导网络, 其中涉及到多个CTK合成过
程中的基因如AtIPT8, 以及ABA信号转导途径中的
abi4、abi5等, 并且包括一些在信号网路途径中的
蛋白质调节因子。磷酸腺苷异戊烯基转移酶
(adenosinephos-phate-isopentenyl trans-ferase) IPT是
细胞分裂素生物合成催化酶。Takei等(2001)和
Kakimoto (2001)研究小组从拟南芥基因组测序中鉴
定出9个ipt同系物(ipt-homologs), 命名为AtIPT1~
AtIPT9。AtIPT4基因过表达时, 即使在没有外源
CTK存在的条件下, 茎仍能再生。同样, 通常只有
当CTK存在时, 愈伤组织才能有茎的再生。这表明
在植物体中, 此基因的产物能催化CTK的生物合成
(Kakimoto 2001)。AtIPT3、AtIPT5和AtIPT7基因在
营养器官中表达。AtIPT8专一地在再生器官中表
达, 在未成熟的种子中表达量最高。AtIPT4主要在
再生的未成熟种子中表达。AtIPT1在胚珠和营养器
官中表达。CTK负调节AtIPT1、AtIPT3、AtIPT5和
AtIPT7在植物体中的表达(Miyawaki等2006)。最新的
研究表明AtIPT8在细胞分裂素促进的种子萌发过程
中发挥作用。然而, 目前仍没有具体检测到AtIPT4
和AtIPT6在表达上对细胞分裂素的效应途径。
本文以细胞分裂素和ABA合成或信号转导子
突变体为材料, 采用NaCl和甘露醇来模拟盐和干
旱的非生物胁迫, 观察分析拟南芥种子的萌发及
子叶生长变绿状况, 探讨细胞分裂素对ABA缓解
渗透胁迫抑制种子萌发生长的影响。
材料与方法
1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)为Columbia-0
(Col-0)生态型、ipt6-1 (CS2360)、ipt6-2 (CS22-
659)、ipt8-1 (Salk_143008)、ipt8-2 (Salk_140499)、
aba2-1 (CS156)和abi5-2 (CS66980)等基因型纯合
突变体种子均是从拟南芥资源信息中心(http://
www.Arabidopsis.org)订购。实验主要是在河南大
学棉花生物学国家重点实验室完成。
2 方法
2.1 NaCl和甘露醇处理的培养基制备
配制MS培养基, 在灭菌之前分别将NaCl和
甘露醇添加进去 , 使得NaCl终浓度分别为120
mmol·L-1; 甘露醇终浓度为240 mmol·L-1; 经高压蒸
汽灭菌(121 ℃, 15 min)后分装到无菌培养皿中。
2.2 不同浓度ABA和6-BA处理的培养基制备
配制MS培养基或添加NaCl和甘露醇于MS培
养基, 分装于锥形瓶中, 经高压蒸汽灭菌(121 ℃,
15 min)后, 在无菌操作台内放凉。待培养基尚未
凝固前分别加入用微孔滤过膜过滤的ABA和6-BA
的母液, 摇匀, 使得ABA终浓度分别为0.1、0.5和
1.0 mmol·L-1, 6-BA终浓度分别为0.01和0.05 mmol·L-1,
最后倒入无菌培养皿中。
2.3 种子的萌发
选取籽粒饱满、大小均匀、无病虫害的种子,
用0.1% HgCl2浸种4~5 min后, 在超净工作台中用
灭菌的双蒸水冲洗5~6次, 将种子均匀点播在分装
的不同MS培养基中, 培养皿用封口膜封口后, 置于4
℃冰箱中春化3 d, 之后转到光照培养室(温度为
18~22 ℃, 光/暗为16 h/8 h, 光照强度300 mmol·m-2·s-1,
相对湿度为80%)中培养。
2.4 测定指标与方法
选取同一批收获的拟南芥种子, 自放入培养
室的第1天开始, 统计各个处理的种子萌发数目。
种子以露白为萌发标准, 连续统计数天。萌发率=
(萌发种子数/供试种子总数)×100%。每个处理3个
重复, 每隔24 h观察并记录种子萌发情况, 统计相
关数据, 持续数天。萌发后第4天做萌发表型分
析。对照是同一光照培养室内生长在MS培养基上
萌发的拟南芥种子。
同批收获的拟南芥种子萌发过程中, 胚根首
李娜等: 6-BA拮抗脱落酸缓解渗透胁迫对种子萌发的抑制 391
先突破种皮形成根系。然后下胚轴加速伸长, 将子
叶和胚芽推出, 子叶出现绿色即为子叶变绿。每个
处理3个重复, 每隔24 h观察并记录种子萌发及子
叶变绿情况。统计相关数据, 持续数天。萌发后第
7天做子叶变绿表型分析。对照是同一光照培养室
内生长在MS培养基上萌发的拟南芥种子。
以上的数据用Excel 2007和Origin 5.0软件进
行分析作图。
结果与讨论
1 外源NaCl和甘露醇对拟南芥种子萌发表型的影响
如图1所示, 120 mmol·L-1 NaCl和240 mmol·L-1
甘露醇处理可显著抑制ipt6-1和ipt6-2种子的萌发
以及子叶变绿, 使其萌发率分别降低近60%, 子叶
变绿率分别降低近70%, 而野生型种子仍能够萌发
并生长。也就是说在盐和干旱胁迫下ipt6-1和ipt6-2
突变体种子萌发和生长能力显著弱于野生型, 证实
IPT6基因参与调节NaCl和甘露醇引起的渗透胁迫。
2 外源ABA对拟南芥种子萌发表型的影响
通常, 干旱、寒冷、高温和盐等多种非生物胁
迫条件下, 植物体内的ABA含量大幅度升高, ABA
促进种子休眠的诱导和维持, 抑制种子的萌发。
为了确定NaCl与甘露醇对种子萌发的抑制是否依
赖于ABA调控, 本文检测了细胞分裂素合成相关
基因IPT6对ABA的反应。如图2所示, 外源ABA对
种子的萌发抑制作用具有浓度依赖性, 随着浓度
的升高, 抑制作用愈趋明显。1 mmol·L-1 ABA处理
下, 种子的萌发状况与120 mmol·L-1 NaCl、240
mmol·L-1 甘露醇处理下的种子萌发率非常接近, 因
此基本认为NaCl和甘露醇处理下的种子萌发受抑
制是ABA依赖的。
为进一步证实NaCl和甘露醇处理下种子萌发
抑制的ABA依赖性, 本文对ABA合成过程中的突
变体aba2-1以及其它细胞分裂素合成过程的相关
突变体ipt8-1和ipt8-2进行 NaCl和甘露醇处理, 观
察种子萌发及子叶变绿表型特征。如图3所示, 与
对照相比, ABA的合成突变体aba2-1在NaCl和甘露
醇处理下生长状况良好, 萌发率较高, 子叶变绿情
况也优于其他种子。可见, NaCl和甘露醇抑制种
子萌发现象是依赖ABA的。同时发现, NaCl和甘
露醇处理下细胞分裂素合成突变体ipt8-1和ipt8-2
的种子萌发状况与ipt6-1和ipt6-2极其相似, 说明目
前已掌握的细胞分裂素合成突变体在外源NaCl和
甘露醇胁迫处理下, 具有相同的种子萌发受抑制
表型, 所以初步推测, 种子萌发过程中, 细胞分裂
素与ABA存在一定的平衡调节或浓度比例协调关
系, 共同参与了种子休眠的解除过程以及子叶变
绿的调控途径。
图1 外源NaCl和甘露醇处理对拟南芥种子萌发和子叶变绿的影响
Fig.1 Effects of exogenous NaCl and mannitol on seed germination and green cotyledons of Arabidopsis
A: 拟南芥萌发表型, 培养基上不同基因型拟南芥按此分布, 下图同此。
植物生理学报392
3 细胞分裂素与ABA共同参与调控种子的萌发
为了进一步证实细胞分裂素与ABA在种子的
萌发过程中存在一定的平衡调节或浓度比例协调
关系, 本文在 NaCl 和甘露醇处理的基础上, 添加
0.05 mmol·L-1 6-BA, 观察种子的萌发及子叶变绿表
型。如图4所示, 与不加6-BA的(图1和2)相比, 添加
图2 外源ABA对拟南芥种子萌发和子叶变绿的影响
Fig.2 Effects of exogenous ABA on seed germination and green cotyledons of Arabidopsis
图3 NaCl和甘露醇对不同基因型拟南芥种子
萌发和子叶变绿的影响
Fig.3 Effects of NaCl and mannitol on seed germination and
green cotyledons of different genotypes of Arabidopsis
6-BA后, ipt6-1和ipt6-2种子的萌发率有所提高, 而
受抑制表型得恢复。再次证明突变体 ipt6-1和
ipt6-2对盐、干旱胁迫以及ABA敏感, 主要是其体
内合成细胞分裂素能力降低所致。
为了证明细胞分裂素和ABA共同参与调控植
物种子萌发, 本文对不同基因型突变体种子进行
图5 不同处理对不同基因型拟南芥种子萌发的影响
Fig.5 Effects of different treatments on seed germination of
different genotypes of Arabidopsis
李娜等: 6-BA拮抗脱落酸缓解渗透胁迫对种子萌发的抑制 393
同样的处理, 观察种子萌发受抑制表型是否得以
恢复。如图5所示, 与对照相比, NaCl明显抑制Ipt
家族中ipt8-1、ipt8-2、ipt6-1和ipt6-2种子萌发及
子叶变绿; 外加0.01 mmol·L-1 6-BA可以明显缓解
NaCl对其子叶变绿的抑制。此外, 我们发现ABA
不敏感突变体abi5-2对NaCl处理相对不敏感(图
5-B), 这表示NaCl对种子萌发的抑制依赖于ABA
合成和信号传递。综上所述, 植物种子的萌发过
程是细胞分裂素和ABA共同参与调控的, 二者存
在一定的平衡协调关系, 并且细胞分裂素在促进
图4 不同处理对拟南芥种子萌发和子叶变绿的影响
Fig.4 Effects of different treatments on seed germination and green cotyledons of Arabidopsis
图6 外源6-BA处理对拟南芥种子的萌发的影响
Fig.6 Effects of exogenous 6-BA on seed germination of Arabidopsis
植物生理学报394
种子萌发方面发挥着重要的作用。
为了探究如何维持6-BA与ABA的平衡, 本文
设置0.01和0.05 mmol·L-1的6-BA处理, 观察其种子
的恢复表型。如图6所示, 与NaCl胁迫相比, 在
NaCl+0.05 mmol·L-1 6-BA处理的种子萌发表型得
到有效恢复。结果表明, 在调控种子萌发过程中,
6-BA和ABA共同发挥调控作用, 并且存在一定的
浓度比例依赖关系。任何一种激素浓度的变化都
足以使种子的萌发异常。
上述结果证明不同激素之间的信号途径存在
直接或间接作用。因此, 对植物激素调节信号的
研究必须从整体上全面地分析影响种子萌发过程
的多种因素间的相互作用。此外, 在种子萌发的
过程中, 一种激素的含量及敏感性变化在靶组织
中具有特异性, 所以进一步分析种子休眠及萌发
过程中的生理机制还需要利用其他的一些非模式
作物进行分析。
种子的休眠与萌发性状的形成是一系列基因
的表达及多个功能蛋白执行功能的综合体现, 尽管
已知一些基因家族与种子的休眠有关。那么, 在休
眠的诱导和释放过程中, 这些信号又是怎样相互作
用的？以前的研究主要集中在针对单个或几个功
能基因的研究分析, 无法同一时间内对多个基因的
时空表达进行研究。随着功能基因组学的迅速发
展, 目前基因芯片技术及深度测序技术已经成为研
究表达分析的有效工具, 这些生物技术能够提供大
量差异表达基因的信息, 能够对参与种子休眠和萌
发的特异性基因进行分子识别, 使得对种子萌发的
信号转导机制有更深入的了解。
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