全 文 ：　[收稿日期] 　2010-07-30;2010-12-20修回
　[ 基金项目] 　贵州省科学技术基金资助项目“信号物质对金线兰逆境蛋白产生的调控作用研究”[ 黔科合 J 字(2008)2097] ;贵州省科技创新
人才团队建设项目[ 黔科合人才团队(2009)4007]
　[作者简介] 　司庆永(1985-),男 ,在读硕士 ,研究方向:药用植物的开发与利用。 E-mai l:sqy01@163.com
　＊通讯作者:龚　宁(1963-),女 ,教授 ,从事植物生理生化方面的研究。 E-mai l:gn2033@126.com
遗传育种 ·种质资源·生物技术 [ 文章编号] 1001-3601(2011)02-0070-0001-02
脱落酸对金线兰可溶性蛋白表达的影响
司庆永 , 张奎一 , 龚 宁＊ , 王定景
(贵州师范大学 生命科学学院 , 贵州省山地环境信息系统与生态环境重点实验室 , 贵州 贵阳 550001)
　　[摘　要] 为金线兰抗逆机理的研究和抗逆种苗的培育提供参考 ,采用 3种浓度脱落酸(ABA)对金线兰
进行 6 ～ 72 h处理 ,研究 ABA 对金线兰叶片可溶性蛋白表达的影响。结果表明 ,在 3种浓度 ABA 处理下 ,在 6 ～ 72h 内 ,随处理时间的延长 ,金线兰可溶性蛋白含量均表现出先升高后下降的趋势;进一步通过 SDS-
PAGE发现 ,在ABA 处理过程中 ,分子量为48kD和 54 kD的可溶性蛋白条带出现特异性表达。说明 ,ABA能够诱导逆境蛋白的生成 ,在植物的抗逆性中具有重要的调节作用。[关键词] 金线兰;脱落酸;可溶性蛋白;SDS-PAGE[中图分类号] S567.9 [文献标识码] A
Influence of Abscisic Acid on Expression of
Soluble Protein in Anoectochilus roxburghii
SI Qing-yong , ZHANG Kui-yi , GONG Ning＊ , WANG Ding-jing
(College o f Lif e Science , GuizhouNormal Universit y , Guizhou Key Laboratory f or Mountainous In formation
System and Ecological Environment Protection , Guiyang , Guizhou 550001 , China)
　　Abstract:Inf luence of abscisic acid(ABA)on expression o f soluble pro tein content in Anoectochi lus
roxburghi i leaves w as studied by using three concentrations of ABA to t reat Anoectochi lus roxburghii fo r
6 ～ 72h.The results show ed that the soluble pro tein content of Anoectochius roxburghi i increased initially
and then decreased gradually w ithin 6 ～ 72 h.Specific expression appeared on 48 kD and 54 kD so luble
pro tein band af ter ABA treatment found by sodium dodecy l sulfate po ly acry lam ide gel elect rophoresis(SDS-PAG E), which indicated that ABA can induce the formation of stress protein and play s an impo rtant
role in the adjustment of resistance of plants.
Key words:Anoectochi lus roxburghii;abscisic acid ;soluble pro tein;SDS-PAGE
　　金线兰〔 Anoectochilus roxburghi i(Wall.)
Lindl.〕即花叶开唇兰 ,为兰科开唇兰属植物 ,全草
入药 ,是民间珍稀名贵的中草药[ 1] ,也是一种观赏价
值较高的室内观叶植物 ,具有广阔的开发利用前景 。
金线兰对生态条件要求较严 ,适应性较差 ,自然繁殖
和生长缓慢 ,野生资源非常稀少;加上鸟兽喜食和人
为采摘以及近年来山地开发 ,生态资源破坏 ,野生金
线兰数量锐减 ,已成为 17种濒临灭绝的中草药之
一[ 2] 。在逆境条件下 ,植物体内会产生一系列生理
生化变化 ,并诱导许多特异基因表达 ,其表达产物多
为蛋白质 ,逆境诱导蛋白对植物的逆境适应起保护
作用。在逆境胁迫条件下 ,植物体内脱落酸(ABA)
的含量会发生明显的变化 ,诱导一些特异性基因表
达及特异性蛋白质合成。ABA 可作为一种细胞的
逆境信号物质直接介导许多逆境应答基因的表
达[ 3] 。笔者以金线兰为材料 ,研究经 ABA 处理后
其叶片可溶性蛋白的变化 ,以期找到在 ABA 作用
下的蛋白表达变化以及与 ABA 作用可能相关的逆
境蛋白 ,为金线兰抗逆机理的研究和抗逆种苗的培
育积累资料 。
1 材料与方法
1.1 材料
选取金线兰无菌种子苗为试验材料 ,材料由贵
州师范大学提供。
1.2 处理方法
金线兰增殖组培苗转接到生根培养基中 60d
后 ,选取长势一致的组培苗进行试验。以放入 MS
培养液处理为对照(CK),然后分别在 10μmol/L 、
30μmo l/L 和 50μmo l/L 浓度的 ABA 处理液中处
理 6 h 、12 h 、24h 、48h 、72 h ,然后取相同部位的成熟
叶片进行可溶性蛋白的含量测定 。
1.3 可溶性蛋白含量的测定方法
测定方法采用考马斯亮兰G-250比色法[ 4] 。选
择植株相同部位的叶片 1.0 g ,加入预冷的蛋白提取
液(取 EDTA 0.003 72 g 、PVP 4g 、曲拉同 0.3mL
用 50mmo l/L pH 为 7.8 磷酸缓冲液定容至
100mL)2.5mL ,冰浴充分研磨 ,在冰冻离心机上以
　贵州农业科学　2011 , 39(2):1～ 2　Guizhou Ag ricultural Science s
12000 r/min冷冻离心 20min ,上清液即为蛋白提取
液 ,取蛋白提取液 0.1mL ,加入 5mL 考马斯亮蓝
G-250 ,混匀 ,静置 2min后 ,于 595 nm 波长下比色 。
按下试计算样品中蛋白含量 ,重复 3次 。
蛋白质含量/(mg/g)= C×VTVS ×W F ×1000
式中 ,C为查标准曲线值(μg),VT为提取液总体积
(mL),WF为样品鲜重(g),VS为测定时加样量(mL)。
1.4 SDS-PAGE
对可溶性蛋白的表达采用 SDS-PAG E分析 ,参
照郭尧君等[ 5] 方法。
2 结果与分析
2.1 不同处理金线兰可溶性蛋白含量
不同浓度 ABA处理金线兰可溶性蛋白含量结
果(图 1)表明 ,不同浓度 ABA 处理后金线兰可溶性
蛋白含量随ABA处理时间延长表现出先升高后下
　　图 1 各浓度 ABA 不同处理时间下金线兰的可溶
性蛋白含量
　 Fig.1　Effect of ABA on so luble pro tein content of
Anoectochilus roxburghii
降的趋势。不同浓度 ABA 处理金线兰均表现为可
溶性蛋白含量迅速上升 ,可能是金线兰对 ABA 的
胁迫很敏感 ,快速进行胁迫应答抵御外界信号物质
影响所致;但随着处理时间的延长 ,不同浓度 ABA
对金线兰可溶性蛋白含量影响有一定差异 。如
10μmo l/L 和 30μmol/L ABA处理的金线兰可溶性
蛋白含量表现出下降趋势最后趋于稳定 ,这可能是
金线兰适应了这种胁迫;50μmol/ L ABA 处理的金
线兰可溶性蛋白持续下降 ,可能是金线兰自身不能
适应这种胁迫对其有致死影响。
2.2 不同处理金线兰可溶性蛋白表达谱带
从图 2可见 ,3 种浓度 ABA 处理后 ,金线兰可
溶性蛋白谱带表现不同 ,不仅与对照有一定的差异 ,
而且彼此也有一定差异 ,其主要差异是分子量为
48 kD和 54kD 的可溶性蛋白谱带存在差异 。如
10μmo l/L ABA处理后金线兰可溶性蛋白表现在
6 h时增加了 1条分子量大约为 48 kD的蛋白带 ,这
个条带在 24 h后消失;而分子量为 54 kD 的蛋白带
表达量逐渐增加。30μmol/L ABA处理后金线兰可
溶性蛋白谱带在 6 h时也增加了 1 条分子量大约为
48 kD的蛋白带 ,在其他处理时间段分子量为 48 kD
蛋白带表达量有所下降 ,同时分子量为 54 kD的蛋
白带表达量随处理时间的持续而增加 。50μmo l/
LABA 处理后金线兰可溶性蛋白谱带在 6 h 时也增
加了 1条分子量大约为 48 kD的蛋白带 ,在 12h 和
48 h处理时间段分子量为 48kD蛋白带表达量有所
下降 ,同时分子量为 54kD的蛋白带表达量随处理
时间的持续而增加 。
图 2 10μmo l/ L(A)、30μmol/ L(B)和 50μmo l/ L(C)ABA 处理后金线兰可溶性蛋白谱带
Fig.2　Soluble protein banding pattern of Anoectochilus roxburghii after treated with 10μmol/ L、30μmol/ L and 50μmol/ L ABA
3 结论与讨论
脱落酸(ABA)被认为是植物细胞重要的信号
传递分子 ,其参与植物生长过程中的诸多生理活动 ,
植物对逆境(如干旱 、盐碱和低温)的生态适应是建
立在胁迫激素(ABA)生理调控的基础上的[ 6] 。笔
者研究了外加 ABA 对于金线兰叶片可溶性蛋白含
量及表达的影响 ,金线兰叶片中可溶性蛋白含量均
随处理时间的延长而逐渐下降 。不同浓度的 ABA
处理后 ,均诱导两条新的可溶性蛋白表达 ,分子量约
为 48 kD和 54 kD 。由此可见 , ABA 对金线兰可溶
性蛋白诱导作用明显。
·2· 　　　　　　　　　　　　 　　　　　贵 州 农 业 科 学 2011 , 39卷
[ 文章编号] 1001-3601(2011)02-0071-0003-03
商洛黄芩的组织培养快速繁殖技术
华智锐 , 李小玲
(商洛学院 生物医药工程系 , 陕西 商洛 726000)
　　[摘　要] 为探讨商洛黄芩组织培养的快速繁殖技术途径 ,采用商洛黄芩幼苗的根 、茎 、叶作为外植体 ,
选择 4个不同激素组合配方进行最佳外植体筛选试验 ,并利用筛选出最佳激素组合(NAA+6-BA)进行了商洛黄芩愈伤组织诱导的适宜浓度筛选。结果表明:在根 、茎 、叶作为外植体和 4个不同激素浓度组合中 ,茎为
商洛黄芩组培快繁的最佳外植体 ,诱导愈伤组织的诱导率依次为配方 1>配方 4>配方 2>配方 3 ,配方 1(MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L)采用茎作为外植体诱导商洛黄芩愈伤组织效果最好 ,为 71.67%;适宜浓度筛选中 ,愈伤组织诱导率由高到低依次为浓度 2)>浓度 3)>浓度 4)>浓度 1),激素组合浓度为
MS+NAA 0.25mg/L+6-BA 0.5mg/L 时的诱导率最高 ,为 87.04%。[关键词] 商洛黄芩;组织培养;外植体;愈伤组织诱导[中图分类号] S567.5+3 [文献标识码] A
Tissue Culture and Rapid Propagation of Shangluo Scutellaria baicalensis
H UA Zhi-rui , LI Xiao-ling
(Department of Biomedical Medicine Engineering , Shangluo Universit y , Shangluo , Shaanxi 726000 , China)
　　Abstract:The roots , stems and leaves o f Shang luo S .baicalensis seedling s w ere cultured on four
media w ith dif ferent ho rmone combinations to select the optimum concentration of hormone combination
fo r callus induct ion o f Shang luo S.baicalensis and probe the rapid propagat ion technique of Shangluo S.
baicalensis.The resul ts show ed that the optimum explant for tissue culture of Shang luo S.baicalensis was
the stem , the callus induction rate of Shang luo S.baicalensis stems cultured on MS+NAA 0.5mg/ L+6-
BA 0.5mg/L and M S+NAA 0.25mg/ L+6-BA 0.5mg/L reached 71.67% and 87.04% respectively .
Key words:Shang luo Scutel laria baicalensis;ti ssue cul ture;explant;callus induct ion
　　黄芩(Scutel laria baicalensis Geo rg i),作为商
洛道地药材 ,应用历史悠久 ,需求数量较大 ,是清热
泻火 、消炎镇痛的主要药材品种。目前 ,商洛黄芩产
业已经初步形成了具有一定规模 、结构完整的产业
体系 ,特别是近年呈现出快速增长的态势 ,是商洛医
药经济产业体系中的重要组成部分。近年来 ,临床
上对黄芩药材的需求量逐年上升 ,有限的野生资源
遭到了掠夺性采挖 ,黄芩的野生资源日益匮乏 ,该植
物虽系多年生草本植物 ,但生长期短 ,且繁殖速度
慢 ,加之少有栽培 ,市场上供不应求的矛盾日益尖
锐。利用组织培养技术进行黄芩的繁殖 ,可以很好
地解决这些问题。对此 ,笔者探讨商洛黄芩愈伤组
织诱导的最佳外植体和培养基配方 ,以期为建立商
洛黄芩组培再生体系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
商洛黄芩幼苗 ,用加有蛭石土的培养架于人工
气候箱中培养。黄芩种子 , 由陕西省商洛市 GAP
科研工程中心提供 。
1.2 方法
1.2.1 种子处理 在人工气候培养箱中培养
60 d ,白天温度 25℃,晚上 20℃,每天 2 000 lx 光照
12 h ,相对湿度 70%～ 75%。待黄芩长出 5 ～ 6片真
　[收稿日期] 　2010-08-03;2010-12-21修回
　[基金项目] 　陕西省教育厅专项科研基金(09JK418)
　[作者简介] 　华智锐(1980-),男 ,讲师 ,硕士 ,从事药用植物生物技术研究工作。 E-mai l:huazhi rui2000@163.com
[ 参 考 文 献]
[ 1 ] 范子南 , 肖华山.金线莲的组织培养研究[ J] .福建师
范大学学报:自然科学版 , 1997 , 13(2):82-87.
[ 2 ] 叶庆荣.珍稀中草药金线莲病虫害综合防治技术[ J] .
中国农村小康科技 , 2005 , 12:43.
[ 3 ] Chandler P M .Gene expression regulated by ABA
and its rela tion to str ess to ler ance[ J] .Plant M ol Bi-
ol , 1994 , 45:113-141.
[ 4] 李 琳 , 焦新之.应用蛋白染色剂考马斯亮兰 G-250
测定蛋白质的方法[ J] .植物生理学通讯 , 1980(6):
52-55.
[ 5] 郭尧君.蛋白质电泳实验技术[ M] .北京:科学出版
社 , 1999.
[ 6] 彭元成 ,严 敏.脱落酸受体及其信号转导[ J] .植物
生理学通讯 , 2008 , 44(2):194-200.
(责任编辑:彭　艳)
　贵州农业科学　2011 , 39(2):3～ 5　Guizhou Ag ricultural Science s