全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (8): 1119~1125　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0201 1119
收稿 2014-04-24　　修定 2014-06-19
资助 国家自然科学基金(31160186)、自治区高校科研计划项目
(XJEDU2011I02)和国家“973”计划前期研究专项(2012CB-
722204)。
* 通讯作者(E-mail: zeng_ylxju@126.com; Tel: 0991-8582076)。
基因表达研究中内参基因的选择与应用
张玉芳, 赵丽娟, 曾幼玲*
新疆大学生命科学与技术学院, 新疆生物资源基因工程重点实验室, 乌鲁木齐830046
摘要: 管家基因是一类无组织特异性的, 在物种的所有组织细胞中都表达的基因, 被广泛用作内参基因来检测目标基因在
不同的组织器官、一定的发育阶段或胁迫的环境条件下的表达规律变化。这些管家基因并不是在所有生理条件下都能作
为理想内参基因稳定表达。在基因表达转录分析中, 大多数普遍使用的内参基因已不能满足准确定量的要求。基于统计
学分析软件, 如geNorm、BestKeeper和NormFinder三种分析软件, 可以筛选出稳定性较好的内参基因。本文综述了内参基
因的选择条件、方法及应用。
关键词: 基因表达; 内参基因; 选择与应用; 统计学分析软件
Selection and Application of Reference Genes for Gene Expression Studies
ZHANG Yu-Fang, ZHAO Li-Juan, ZENG You-Ling*
Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang
University, Urumqi 830046, China
Abstract: Housekeeping genes are known as such a class of genes that their expressions are existed in all tis-
sues and cells of a given species, so they are widely used as reference genes to detect expression changes and
patterns of the target genes in different tissues and organs of a species in a certain developmental stage or envi-
ronmental stress conditions. However, these housekeeping genes can not be always stably expressed under all
physiological conditions as ideal reference genes. During the transcription analysis of gene expression, the most
common reference genes can not meet the requirements of accurate quantification. The stably expressed refer-
ence genes can be screened according to some statistical analysis softwares, such as geNorm, BestKeeper and
NormFinder. This paper reviewed the selection criteria, methods and applications of the reference genes for
gene expression studies.
Key words: gene expression; reference genes; selection and application; statistical software
基因表达分析广泛应用于生命科学领域, 其
研究的深入对探寻疾病相关基因和调控机理、揭
示生命奥妙等方面至关重要。在转录水平进行基
因表达定量中, 如实时定量PCR (real-time quantita-
tive RT-PCR)、RNA印迹(Northern blotting)、核糖
核酸酶保护分析(ribonuclease protection assay,
RPA)、基因芯片(gene chip)等, 为获得更加准确可
信的结果, 都需要内参基因对目标基因的表达水
平进行标准化衡量。
在研究基因表达水平时, 常用管家基因作为
参考标准。管家基因又称看家基因、持家基因,
是指不受外部环境的影响, 在所有细胞中均要表
达的一类基因, 其产物是对维持细胞基本生命活
动所必需的。管家基因的表达水平要高于其他基
因的平均表达水平, 其表达水平的几何均数为1 200,
而其他基因为150。管家基因排列紧密, 其内含
子、未翻译区和编码序列较短。短基因(TG:CA)n
重复序列的数目要比长的重复序列多(邓红平和何
继亮2006)。在检测基因表达水平变化时用内参基
因来做参照物, 其作用是校正上样量和上样过程
中存在的实验误差, 保证实验结果的准确性。借
助检测每个样品内参的量就可用于校正上样误差,
这样定量的结果才更为可信。
目前, 一些内参基因已被广泛应用于标准化
校正基因的表达量。例如, 实时定量RT-PCR是在
传统的PCR技术基础上发展起来的一种新的核酸
定量分析方法, 具有定量准确、灵敏度高、重复
植物生理学报1120
性好及高通量等特点, 已经被广泛应用于基因的
表达分析, RT-PCR也需要内参基因以校正转录效
率和cDNA用量, 弥补制备过程中样本纯度和浓度
的差别, 从而避免mRNA转录的高动态性、样品操
作及下游处理步骤的多变性造成的误差(Huggett
等2005; Steinau等2006)。然而, 最近有研究表明,
常用的内参基因在不同条件下的表达可能是不稳
定的(Gutierrez等2008)。使用不稳定表达的内参基
因对靶基因表达量分析可能有极大影响。例如,
Gutierrez等(2008)报道与已经验证的内参基因相
比, 使用未验证的内参基因进行校正将对目标基
因表达水平的定量出现100倍的偏差。盲目地使
用一种管家基因作为内参, 一方面可能使基因表
达的微小差异难以发现, 另一方面可能出现错误
甚至相反的结论(Vandesompele等2002; Huggett等
2005)。因此, 合适内参基因的选择尤为重要, 本文
就目前基因表达分析中常用内参基因的选择及应
用作简要综述, 以期为选择合适的内参基因进行
靶向基因的表达分析提供一些理论依据。
1 常用内参基因及特点
在基因表达分析中, 常用的内参基因有肌动
蛋白(actin, ACT)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceral-
dehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、转
录延伸因子(elongation factors 1 alpha, EF-1α)、泛
素(ubiquitin, UBI/UBQ)、β2-微球蛋白(beta-2-mi-
croglobulin, B2M)、18S rRNA等的基因。
ACT是一类由375~377个氨基酸残基组成的
高度保守球状微丝结构蛋白 , 分子量大约为42
kDa, 以单体和多聚体2种形式存在, 占细胞总蛋白
质的5%~10%。根据等电点的不同, 高等动物细胞
内的肌动蛋白可分为α、β、γ三种类型(Venkatesh
等1996)。β-actin氨基酸序列高度保守, 其表达量
在不同的组织中变化量较小, 而且表达量高, 因此
常用作内参基因(Nicot等2005; Cornejo等2010)。
GAPDH是糖酵解、糖异生及光合作用碳固
定循环途径的关键酶, 占总蛋白的10%~20%。
GAPDH同源基因间较低的同源性, 使得它作为探
针具有独特的优势(Stürzenbaum和Kille 2001)。
EF-1α是在mRNA翻译时促进多肽链延伸的
蛋白质因子, 有3个结构域, 结构域I与GTP结合, 结
构域II和结构域III结合tRNA。EF-1α是细胞内继
肌动蛋白之后含量第二多的蛋白, 在不同的物种
中它的基因及表达调控有高度保守性。
B2M是一种内源性低分子量血清蛋白质, 由
淋巴细胞和其他大多数有核细胞分泌, 每天在体
内生成量较为恒定, 且只被肾脏排泄。它存在于
尿、血浆、脑脊液及淋巴细胞、多核中性粒细胞
及血小板的表面, 量极微。血清B2M极易通过肾
小球滤过膜, 滤过的B2M 99.9%被近曲小管细胞重
吸收和降解, 不再返流入血。正常人B2M的合成
速度和细胞膜释放的量是非常恒定的 , 从而使
B2M含量保持稳定水平。而许多疾病, 如肝炎、
肾炎、类风湿关节炎, 以及恶性肿瘤、免疫性疾
病等, 均可使血液中的B2M升高。
18S rRNA是真核生物核糖体RNA的一种, 是
所有的细胞中最保守的基因之一, 对维持基本的
细胞代谢和细胞内的功能具有重要的作用(Yeap等
2014)。已有报道18S rRNA在流感病毒感染的细胞
中是表达最稳定的内参基因(Kuchipudi等2012)。
由于18S rRNA在总RNA中所占的比例较大, 只要
保证参与反转录时的总RNA量一致, 即可保证18S
rRNA量的基本恒定。同时由于反转录过程中只需
要加入总RNA, 避免了进一步提取mRNA的操作,
更简化了实验环节(陈应泰等2005)。
UBQ属于泛素家族基因, 在细胞的蛋白质降
解中发挥重要作用。UBQ是通过对靶蛋白进行泛
素化修饰参与胞内多种生物学过程调节的一种多
效的分子信号。泛素单体含76个氨基酸残基, 在
真核生物中极为保守。泛素单体往往通过赖氨酸
残基聚合起来, 对蛋白质进行标记。由于使用的
赖氨酸残基的位置不同, 也有多种不同的多聚泛
素化方式(Ikeda和Dikic 2008)。
此外, 真核生物翻译起始因子(eukaryotic trans-
lation initiation factor, eIF)、β-葡萄糖苷酶(β-D-glu-
cosidase, β-GUS)、组蛋白(His)、微管蛋白(tubulin,
TUB)、TATA盒结合蛋白(TATA box binding pro-
tein-associated factor, TBP)、亲环蛋白(cyclophilin,
CYP)、核糖体蛋白S3 (ribosomal protein S3,
RPS3)、核糖体磷蛋白大亚基P0 (ribosomal phos-
protein large P0, RPLP0)、RNA聚合酶II (RNA
polymerase II, RNA Pol II)、RNA聚合酶II转录因
子(RNA polymerase-II transcription factor, RP II)、
张玉芳等: 基因表达研究中内参基因的选择与应用 1121
28S rRNA等的基因也常用作内参基因。
1.1 内参基因在植物中的研究应用
Maroufi等(2010)研究菊苣(Cichorium intybus)
合适内参基因时发现, EF-1α和18S rRNA在根和叶
组织中稳定高表达, 适合作为其组织的内参基因,
而GAPDH和NADHD (还原型尼克酰胺腺嘌呤二核
苷酸脱氢酶, reduced nicotinamide adenine dinucle-
otide dehydrogenase)的基因呈相对低表达, 并指出
增加内参基因的数目能提高研究分析的精确性,
但较费时昂贵。使用两个内参基因相对于单一内
参基因也能提高结果的精确性。Cui等(2011)为长
筒石蒜(Lycoris longituba)的基因表达研究筛选合
适内参基因时发现, eIF和His可作为石蒜的内参基
因, 18S rRNA在不同组织中表达变化量较高, 不宜
作为内参基因, UBCE (ubiquitin-conjugating en-
zyme)可作为植物不同发育阶段的内参基因。Xu
等(2012)对萝卜(Raphanus sativus)的8种候选内参
基因在不同品种、组织类型、光周期和春化处理
及不同发育阶段验证时, 得到EF2 (translation elon-
gation factor 2)、RPII和ACT在不同实验条件下稳
定表达, 而EF-1b和18S rRNA在大多数情况下表达
不稳定。Meng等(2013)鉴定收割后现代月季(Rosa
hybrida)中ACT、TUB和UBI的候选内参基因, 结果
表明应根据不同情况选择最优内参基因, UBI1适
用于干旱处理中的内参基因, TUB2适合在乙烯处
理时作为内参基因, ACT4适合在赤霉素和脱落酸
处理时用作内参基因, UBI6适合作花瓣中的内参
基因, UBI2适用于萼片中的内参基因, ACT1适用于
雌蕊中的内参基因。
Kumar等(2013)对模式植物谷(Setaria italica)
的8种常用内参基因进行评价, 在盐和失水处理下
RNA Pol II和ACT2可作为合适的内参基因。Zhang
等(2013)对11种麻风树(Jatropha curcas)常用内参
基因分析, 结果建议因不同的样本类型来选择适
当的内参基因, 其数目应在两个或两个以上较佳,
ACT和TUB8为营养生长阶段最佳组合的内参基因,
GAPDH和EF-1α为生殖生长阶段的最佳组合内参
基因, TUB5和TUB8为干旱胁迫下的最适内参基
因。Wang等(2013)利用TUA10等10个基因对棉花
(Gossypium hirsutum)盐和干旱的非生物胁迫下筛
选合适内参基因。结果表明, UBQ7、GAPDH和
EF-1α8无论在盐和干旱胁迫下在棉花的根和叶中
都适合作为内参基因, TUA10适合在盐胁迫下棉花
的根和干旱胁迫下棉花的根和叶中作为内参基因,
而CYP1只适合在盐胁迫下棉花的根中作为内参基
因。Luo等(2014)分析寒兰(Cymbidium kanran)的9
种常用内参基因, 结果表明在不同组织不同处理
下, ACT和TUB在ABA、NaCl、CuSO4和冷胁迫下
作为合适的内部对照, RPS3和TUB在NAA、6-BA
和GA处理下最稳定。
1.2 内参基因在动物中的研究应用
Ponton等(2011)在分析黑腹果蝇(Drosophila
melanogaster)常用内参基因[α-ACT、EF1、Mnf
(forkhead domain 68A)、RPS20、RPL32、α-TUB
与18S rRNA]时指出使用18S rRNA作为内参基因,
可能导致错误估计靶基因的表达水平, 造成假阳
性, ACT5适用于雌果蝇不同组织基因表达分析的
内参, ACT3适用于雄果蝇组织中的内参基因, 而
α-TUB则是在两种雌雄果蝇中都可以作为内参基
因。Kortner等(2011)对β-ACT等8种基因分析, 选择
合适内参基因研究大西洋鲑鱼(Salmo salar)豆粕
(SBM)诱发性肠炎的结果显示18S rRNA、GAP-
DH、RNA Pol II和HPRT1表达更稳定, 可作为一个
内参基因组合来标准化SBM诱导性肠病。Li等
(2011)在不同的猪组织中评估内参基因, 通过对
His3、β-ACT、GAPDH、18S rRNA、UBQ的分析
中发现GAPDH、18S rRNA在研究的肝脏、甲状腺
和腹部脂肪中可作为合适的内参基因 , His3、
β-ACT可在肝脏、肾脏和甲状腺中作为内参基
因, 而UBQ由于表达水平的变化不适合在猪组织
中作为内参基因。
此外, Albershardt等(2012)对UBC (ubiquitin C)
等5种基因进行比较筛选鼠淋巴细胞的内参基因
的结果表明UBC为qPCR最佳内参基因, 而β-ACT
表达不稳定。Yang等(2013)对尼罗罗非鱼(Oreo-
chromis niloticus)不同组织中选择内参基因GAP-
DH、UBCE、18S rRNA、B2M、β-ACT、α-TUB、
EF-1α进行比较发现UBCE表达最稳定, 适合在感
染海豚链球菌后小肠、肝、脑、肾、脾和感染无
乳链球菌的肝、肾组织中作为内参基因, EF-1α在
感染海豚链球菌或无乳链球菌的心脏和肌肉中表
达最稳定, GAPDH在感染无乳链球菌后的肠道和
植物生理学报1122
脑中表达最稳定 , 在正常情况下 , UBCE和18S
rRNA在各组织中表达最稳定。
综上所述, 在动植物常用内参基因(表1)作为
标准化的因子, 已被广泛应用于不同生理条件、
不同组织的不同发育阶段, 然而, 对于内参基因的
选择仍存在一些争议, 例如: 关于18S rRNA作为内
参基因的使用, 目前仍有不同的观点, 18S rRNA末
端没有poly(A)加尾, 当使用Oligo-dT引物进行反转
录或仅以mRNA为模板时, 18S rRNA不能作为内参
(Stürzenbaum和Kille 2001), 而且, 18S rRNA与目的
mRNA转录本相比表达丰度过高, 在qPCR数据分
析时很难扣除基线值等(Vandesompele等2002)。
普遍认同的内参基因表达水平在各个条件下并不
稳定, 许多实验已证明, 使用合适单一的内参基因
能衡量出目标基因的变化, 对于目标基因表达分
析更精确的实验, 建议使用两个或多个基因作为
内参基因。
2 选择合适内参基因的标准与方法
2.1 选择合适内参基因的标准
理想的内参基因是在所有生理条件下都适用
的基因 , 应该满足以下条件 : (1)不存在假基因
(pseudogene), 以避免基因组DNA的扩增; (2)高度
或中度表达, 排除太高或低表达; (3)稳定表达于不
同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞), 不受
任何实验处理的影响, 并且稳定性应该等价于靶
基因的转录或其扩增受损应伴随着相对靶基因转
录数量的减少; (4)基因扩增后, 将反映在RNA的质
量、数量和/或互补DNA (cDNA)的合成效率的变
化; (5)表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无
关; (6)不受任何内源性或外源性因素的影响, 如不
受任何实验处理措施的影响。排除内参基因的条
件则为: (1)在正常和异常的细胞/组织中的表达存
在差异; (2)呈现细胞周期依赖的表达; (3)定位于x
染色体(Wan等2010; 陈凤花和王琳2005)。
许多研究证实, 理想的内参基因并不存在, 不
同的处理因素以及不同组织中内参基因表达的稳
定性是不一致的(Mohelnikova-Duchonova等2012;
Albershardt等2012; Luo等2014)。因此, 在进行标
化基因选择时, 应根据不同实验条件进行仔细的
分析和确证, 从而选择合适的内参基因。对于目
标基因表达水平要求精确时, 传统的单一内参基
因存在一定的局限, 建议使用两个或多个基因作
为内参。
2.2 选择合适内参基因的分析方法
目前, 用于评价不同实验条件下内参基因稳定性
的分析方法有多种, 其中基于Excel的统计学软件分
析方法有geNorm、NormFinder、BestKeeper。可以
免费下载geNorm [http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/
genorm] (Garson等2005)、NormFinder [http://www.
mdl.dk/publicationsnormfinder.htm] (Andersen等2004)
和BestKeeper [http://www.gene-quantification.de/best-
keeper.html] (Pfaffl等2004)软件, 分别细述如下。
表1 动植物常用内参基因
Table 1 Commonly used reference genes for animals and plants
中文全称 英文简称 特点
肌动蛋白 ACT 占细胞蛋白质的5%~10%, 高度保守, 表达量高且稳定
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH 在多种组织中表达水平高, 同种细胞组织中表达量恒定
组蛋白 His 真核生物染色体基本结构蛋白, 基因保守
次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 HPRT 体内分布广泛, 胞质酶, 是诊断某些疾病的靶点基因
RNA聚合酶II RNA Pol II 基因表达的关键酶, 真核细胞中保守
微管蛋白 TUB 基因保守, 细胞骨架组成部分, 具支架、胞内运动等功能
泛素 UBI/UBQ 真核细胞中的标记蛋白, 具有高度保守性
泛素结合酶 UBCE 具有高度保守的泛素结合结构域
核糖体RNA 18S rRNA 核糖体RNA, 是保守基因, 对维持细胞代谢有重要作用
亲环蛋白 CYP 生物体内普遍存在, 高度保守的多功能蛋白质
RNA聚合酶II转录因子 RPII 与RNA聚合酶II结合的蛋白质因子, 参与转录起始过程
核糖体蛋白S3 RPS3 组成核糖体的主要成分, 在部分组织中高表达
翻译延伸因子 EF 主要翻译因子之一, 基因及表达调控高度保守
　　参考Nicot等(2005)、Cornejo等(2010)、Beato和Eisfeld (1997)、Davidson等(1991)和Trandinh等(1992)文献。
张玉芳等: 基因表达研究中内参基因的选择与应用 1123
2.2.1 geNorm 该程序是Vandesompele等(2002)开
发的专门用于分析内参基因稳定性的程序。其依
据的原则是两个理想内参基因表达水平的比值应
该在所有标本中一致, 不论在何种实验条件或者
细胞类型。该方法不受基因间极端比值和表达丰
度差别的影响, 变异度比值的增加意味着二者中
其一或全部基因表达稳定性的降低(胡金川2008)。
通过计算内参基因表达稳定性的M值, 进而分析内
参基因在不同样品中的表达稳定性, M值越大, 稳
定性越差; 反之, 稳定性越好。还可以对标准化因
子(normalization factor)的配对变异(pairwise varia-
tion) V值进行分析, 以确定所需内参基因的最适数
目。将Vn/Vn+1比值与默认的V值(0.15)进行比较, 如
果Vn/Vn+1大于0.15, 则有必要引入第n+1个基因; 反
之, 则不必引入新的内参基因。geNorm程序可以
用于确定不同实验条件下最适内参基因的数量,
并选择出最优组合, 而不是通常地使用单一内参
基因。这将有利于系统偏差的校正, 从而获得更
加可靠的表达分析结果。
qbasePLUS也称为geNormPLUS (http://www.bioga-
zelle.com/qbaseplus), 是一种改进geNorm和qbase
的新统计学算法, 与前身基于Microsoft Excel的算
法相比, 这种结合计算方法代替许多手工预算, 加
快了分析速度。同时, 能通过整体分析自动处理
丢失的数据, 筛选出最适内参基因, 并能对内参数
目与类型给出专业化的建议。
2.2.2 NormFinder 该程序是由Andersen等(2004)
设计, 用于在不同条件下筛选合适内参基因的统
计学分析软件。NormFinder是基于一个固定的统
计学框架方差分析, 它通过测定每个基因的稳定
值, 来估计基因表达稳定性评价候选参照基因的
整体和样本子群之间的变化(Ferreira和Cronjé 2012)。
NormFinder的运行原理与geNorm程序类似, 也是
通过计算基因表达稳定值, 然后根据稳定值的大
小排序, 值越大稳定性越差; 反之, 稳定性越好。
但是不足的是, 它只能选择1个最合适的内参基
因。而geNorm程序则能够选出合适的内参基因组
合及最适基因数量。
2.2.3 BestKeeper 该程序是Pfaffl等(2004)编写的
用于分析基因表达稳定性及基因表达水平的程
序。其原理是通过将原始数据导入BestKeeper的
Excel表中, 然后对内参基因进行单独分析, 并在每
个基因之间通过比较Ct值产生配对的相关系数
(r)、变异系数(CV)和标准偏差(SD), 根据其值的
大小进行比较, 选择表达最稳定的基因, 相关系数
高, 并且标准偏差和变异系数越小, 稳定性越好;
反之, 稳定性越差。其不同于geNorm和NormFind-
er的优点是不但可以分析内参基因表达的稳定性,
而且可以比较目标基因的表达水平。与geNorm程
序相比, BestKeeper程序只能计算一次配对相关系
数, 当排除某个基因后该程序不能重新计算(Wood
等2008)。
这3个软件都是基于候选内参基因实时定量
PCR的Ct值, 通过不同的统计学分析方法, 在不同
类型的组织、不同的发育阶段和不同处理条件下,
筛选合适的内参基因, 以保证相对基因表达量的
可靠性。在筛选合适内参基因时, 可将这3种统计
学软件综合利用。geNorm、NormFinder和Best-
Keeper等是常用于评价内参基因表达稳定性的软
件, 如果软件分析结果之间彼此存在差异可能是
由于这些软件具有不同的算法造成的(Vandesom-
pele等2002; Andersen等2004; Pfaffl等2004; Ponton
等2011)。因此, 在筛选合适内参基因时, 应根据具
体情况而定。
3 结语
在同一物种同一内参基因的稳定性, 在不同
生理条件下通常并不稳定。而在不同物种中同源
内参基因也没有绝对的通用性, 它们的稳定性不
尽相同。因此, 在所有条件下都稳定表达的理想
内参基因并不存在, 在研究目标基因表达水平时,
应根据具体条件选择合适的内参基因。geNorm、
BestKeeper和NormFinder三种分析软件, 可根据统
计学方法筛选出最优内参基因, 为选择合适内参
提供方法。同时, 很多关于内参基因选择的研究
者都建议, 在基因表达分析中, 同时使用2个或多
个内参基因有助于调整系统偏差, 更有利于得到
准确的基因表达定量结果, 这对于研究表达水平
时, 只存在细微差异的基因尤其重要。
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