全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (7): 973~982 doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0130 973
收稿 2014-04-08 修定 2014-06-13
资助 国家自然科学基金项目(31371709)。
* 通讯作者(E-mail: chenjunying3978@126.com; Tel: 0371-
63558122)。
基于cDNA-AFLP技术的玉米种子劣变相关基因分析
张景龙, 杨伟飞, 吕伟增, 曹广灿, 陈军营*
河南农业大学农学院, 郑州450002
摘要: 以人工控制劣变处理(温度45 ℃, 相对湿度100%) 3 d的玉米杂交种‘郑单958’种子为材料, 通过cDNA-AFLP技术, 共获
得约5 400个转录本。对差异片段进行测序分析, 最终获得122个种子劣变相关基因序列(DRS), 其中, 上调表达74个, 下调表
达48个, 功能涉及初生代谢、次生代谢、蛋白代谢、转录与调控、胁迫响应、信号转导和运输。采用qRT-PCR技术分析
了11个上调表达差异基因的表达模式, 结果显示不同基因的表达模式存在较大差异, 说明不同基因在种子劣变中可能扮演
不同角色。
关键词: 玉米种子; 人工控制劣变处理; cDNA-AFLP; 种子劣变相关基因
Analysis of Genes Related to Seed Deterioration in Maize (Zea mays) Based on
cDNA-AFLP Approach
ZHANG Jing-Long, YANG Wei-Fei, LÜ Wei-Zeng, CAO Guang-Can, CHEN Jun-Ying*
College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: Hybrid seeds of maize (Zea mays) cultivar ‘Zhengdan 958’ after 3 d of controlled deterioration treat-
ment (CDT) (temperature: 45 ℃, relative humidity: 100%) were used as the materials and about 5 400 tran-
script-derived fragments (TDFs) were obtained by cDNA-AFLP approach. 122 deterioration relevant sequences
(DRSs) obtained by bioinformatics analysis, in which 74 were up-regulated and 48 were down-regulated, were
involved in primary metabolism, secondary metabolism, protein metabolism, transcription and regulation, stress
response, signal pathway and transportation. The expression patterns of 11 differential genes up-regulated were
analysed by qRT-PCR and the result showed that these genes displayed different expression patterns, suggesting
that they might have different roles in seed deterioration.
Key words: maize seeds; controlled deterioration treatment; cDNA-AFLP; genes related to seed deterioration
玉米是世界重要的粮食作物, 也是重要的工
业原料。玉米种子的质量对产量和品质有重要影
响。种子活力是种子质量的重要组成部分, 高活
力的种子表现为大田出苗快而整齐、健壮, 生长
旺盛, 抗逆性强, 高产优质, 耐藏性好。种子活力
的保持由种子本身的遗传特性和环境条件共同决
定, 即使处于最佳的环境条件下, 随着贮藏时间的
延长, 种子内部也会发生一系列生理生化, 如活性
氧(reactive oxygen species, ROS)的产生和积累, 引
起脂质过氧化反应, 使膜结构受到损伤, 细胞完整
性遭到破坏(Kranner等2011); 多种功能蛋白的氧
化、降解、酶蛋白的变性和失活(Yang等2007), 核
酸(DNA和RNA)受损(Gallardo等2002, 2001)等, 最
终造成种子活力下降甚至丧失, 给农业生产带来
极大损失。Rajjou等(2008)研究认为, 种子活力下
降的原因在于贮藏导致种子萌发的蛋白组发生变
化, 低活力种子在发芽过程中不能合成种子萌发
所需的蛋白质, 因此, 一些蛋白质在种子活力维持
中具有重要作用。对种子劣变的生理生化及分子
生物学已有比较深入的研究, 但是种子劣变的分
子机理仍不清楚。玉米作为种子生理学研究的模
式材料, 具有粒大、种胚和胚乳易分离、操作方
便等优点。以玉米种子为材料, 阐明其劣变的分
子事件, 对揭示种子劣变的分子机理有重要的理
论和实践意义。
cDNA-AFLP技术将RT-PCR和AFLP技术相结
合, 具有重复性好、假阳性低、可检测低丰度表
达的mRNA、能准确反映基因间的表达差异等优
点, 已广泛应用于植物不同处理下差异基因的相
关分析(Claverie等2012; Yin等2010), 然而利用
植物生理学报974
cDNA-AFLP技术研究有关种子劣变相关差异表达
基因则不多见。本研究以劣变处理的玉米种子为
材料, 利用cDNA-AFLP技术研究筛选玉米种子劣
变相关的差异表达基因, 旨在为进一步揭示玉米
种子劣变的分子机制提供理论依据。
材料与方法
1 植物材料
玉米(Zea mays L.)杂交种‘郑单958’种子购于
河南省农业科学院秋乐种业公司。
人工控制劣变处理参照Basak等(2006)的方
法, 并略有改动。取形状大小整齐一致的完整种
子置于网上, 分散均匀, 于恒温箱中高温(45 ℃)、
高湿(相对湿度100%)处理1~5 d, 以未经处理的种
子为对照, 处理后的种子在室温下风干(保持水分
与处理前一致), 备用。
2 种子发芽率和种胚生活力的测定
玉米发芽实验参考Zhang等(2011)的方法, 略
有改动。取30粒处理种子均匀置于湿润的砂床中,
在恒温(温度30 ℃)、恒湿(相对湿度70%)、光照强
度13 µmol·m-2·s-1、14 h/10 h光照/黑暗交替的条件
下, 培养1周, 每个处理3次重复。每天定时观察记
载, 1周后统计发芽率。
种胚生活力的测定参考邹琦(2000)书中的方
法。将充分吸胀种子的种胚完整取下, 35 ℃下用
0.1%的氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium
chloride, TTC)溶液染色1 h后, 用蒸馏水冲洗2~3次,
观察种胚染色。
3 RNA的提取与双链cDNA的合成
根据TransZol Plant (TransGen)试剂盒的操作
说明, 提取高质量的玉米种胚总RNA。参照Prime-
Script Double Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)
的说明书合成双链cDNA, 用NanoDrop 2000测
定cDNA的浓度和质量 , 将样品浓度调整为100
ng·µL-1。
4 cDNA-AFLP分析
cDNA-AFLP技术流程及体系参考Yang等
(2011)的方法进行: 用内切酶MseI和EcoRI (Fer-
mentas)对1 µg双链cDNA进行双酶切后, 用T4连接
酶(TaKaRa)将EcoRI和MseI的退火接头与酶切产
物相连接(表1)。用预扩增引物E0、M0对连接产
物进行预扩增, 程序为: 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s,
56 ℃ 40 s, 72 ℃ 60 s, 25个循环; 72 ℃ 7 min。将预
扩增产物稀释2 0倍 , 用选择性引物 ( E 1 ~ E 1 6 ,
表1 cDNA-AFLP中所用到引物的序列
Table1 Sequences of primers used in cDNA-AFLP
引物名称 序列 引物名称 序列
EcoRI接头1 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3 MseI接头1 5-GACGATGAGTCCTGAG-3
EcoRI接头2 5-AATTGGTACGCAGTCTAC-3 MseI接头2 5-TACTCAGGACTCAT-3
E0 5-GACTGCGTACCAATTC-3 M0 5-GATGAGTCCTGAGTAA-3
E1 5-GACTGCGTACCAATTCAA-3 M1 5-GATGAGTCCTGAGTAAAA-3
E2 5-GACTGCGTACCAATTCAC-3 M2 5-GATGAGTCCTGAGTAAAC-3
E3 5-GACTGCGTACCAATTCAG-3 M3 5-GATGAGTCCTGAGTAAAG-3
E4 5-GACTGCGTACCAATTCAT-3 M4 5-GATGAGTCCTGAGTAAAT-3
E5 5-GACTGCGTACCAATTCCA-3 M5 5-GATGAGTCCTGAGTAACA-3
E6 5-GACTGCGTACCAATTCCC-3 M6 5-GATGAGTCCTGAGTAACC-3
E7 5-GACTGCGTACCAATTCCG-3 M7 5-GATGAGTCCTGAGTAACG-3
E8 5-GACTGCGTACCAATTCCT-3 M8 5-GATGAGTCCTGAGTAACT-3
E9 5-GACTGCGTACCAATTCGA-3 M9 5-GATGAGTCCTGAGTAAGA-3
E10 5-GACTGCGTACCAATTCGC-3 M10 5-GATGAGTCCTGAGTAAGC-3
E11 5-GACTGCGTACCAATTCGG-3 M11 5-GATGAGTCCTGAGTAAGG-3
E12 5-GACTGCGTACCAATTCGT-3 M12 5-GATGAGTCCTGAGTAAGT-3
E13 5-GACTGCGTACCAATTCTA-3 M13 5-GATGAGTCCTGAGTAATA-3
E14 5-GACTGCGTACCAATTCTC-3 M14 5-GATGAGTCCTGAGTAATC-3
E15 5-GACTGCGTACCAATTCTG-3 M15 5-GATGAGTCCTGAGTAATG-3
E16 5-GACTGCGTACCAATTCTT-3 M16 5-GATGAGTCCTGAGTAATT-3
张景龙等: 基于cDNA-AFLP技术的玉米种子劣变相关基因分析 975
M1~M16, 共256种引物组合)进行选择性扩增, 程
序为: 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s, 65 ℃ 40 s (每个循环
降低0.7 ℃), 72 ℃ 60 s, 12个循环; 95 ℃ 30 s, 56 ℃
40 s, 72 ℃ 60 s, 25个循环; 72 ℃ 7 min。选择扩增
产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行初步筛选, 再用
6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行分离。
5 差异片段的回收、克隆及测序
用灭菌的刀片切取差异明显的条带, 利用康
为公司的PolyGel Extraction Kit对差异片段进行回
收。回收产物用相应的选择扩增引物、预扩增程
序进行扩增 , 扩增结果用1.5%的琼脂糖凝胶电
泳。用GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas), 对
条带明亮清晰、没有杂带的扩增产物进行二次回
收。将回收产物连接到pMD-19T (TaKaRa)载体中,
连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中, 挑取阳
性单克隆送至北京三博生物技术公司测序。
6 差异基因的功能分析
利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
的BLASTX程序, 在蛋白质水平上进行特异表达基
因的同源性比较, 对匹配的基因进行GO功能注释,
根据注释结果对差异表达基因进行功能分类。
7 差异基因在不同劣变种子中的表达模式分析
为研究差异基因在不同处理时间下的表达模
式, 根据基因功能注释及分类, 选取部分劣变相关
基因进行qRT-PCR。将上述所提取的各处理种胚
的总RNA, 用RevertAid First Strand cDNA Synthe-
sis Kit (Fermentas)反转录为单链cDNA。应用iQ5
Real-Time PCR System (Applied Biosystems), 以各
处理时间点cDNA为模板, 进行qRT-PCR扩增。按
照TransStart® Top Green qPCR SuperMix试剂盒
(TransGen)说明书配置反应体系, 扩增程序为95 ℃
3 min; 95 ℃ 30 s, 59 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 40个循环;
72 ℃ 4 min。
实验结果
1 不同劣变时间对种子发芽及种胚活力的影响
不同劣变处理的种子, 其发芽率存在较大差
异: 劣变1 d的种子发芽率几乎没有明显变化; 然
而, 随着处理时间的延长, 发芽率出现不同程度的
降低, 劣变3~5 d的种子发芽率下降幅度较大(表2
和图1-A)。可见, 劣变3 d可能是种子活力下降的
拐点。
TTC染色是种子生活力鉴定的有效方法, 种
胚染色越深表示种胚生活力越高。TTC染色的结
果显示, 劣变3和5 d的种子, 其种胚染色较浅(图
表2 不同劣变处理对种子萌发的影响
Table 2 Effect of different deterioration treatments
on seed germination
劣变处理时间/d 发芽率/%
0 (对照) 100.00±0A
1 100.00±0A
2 83.34±3.09B
3 38.33±4.35C
4 18.89±1.92D
5 12.89±1.39E
不同大写字母表示0.01水平差异显著。
图1 不同劣变处理对种子发芽及种胚生活力的影响
Fig.1 Effects of different deterioration treatments on seed germination and vitality of embryos
A: 室内发芽情况; B: 种胚染色情况。
植物生理学报976
1-B), 说明种子劣变3 d后种胚生活力明显降低, 而
发芽率的降低可能是由于种胚活力下降造成的。
2 cDNA-AFLP分析
由于劣变3 d的种子发芽率及种胚活力明显降
低, 因此, 用以进行cDNA-AFLP分析。
从256种选择性扩增引物组合中, 筛选出139
种选择性较强的引物组合, 进行选择扩增, 其产物
用PAGE进行分离, 部分结果见图2, 共产生约5 400
条带, 每对引物平均扩增条带约40条。在获得的
条带中, 差异表达的条带有212条, 其中85条抑制
表达, 127条诱导表达, 说明人工劣变诱导了大量基
因的表达。
图2 选择性扩增产物的PAGE结果
Fig.2 Result of PAGE of selective amplification products
M: 分子量标记; C: 对照; T: 劣变处理3 d。
3 差异片段的二次回收、测序及序列同源性分析
对回收的212条片段进行二次PCR扩增, 用
1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物, 部分结果
如图3所示。选择带型明亮、清晰的129条带进行
二次回收及测序, 得到122条种子劣变相关基因序
列(deterioration relevant sequence, DRS), 其中74条
上调表达, 48条下调表达。
利用BLASTX程序对得到的DRS进行序列同
源性分析, 对匹配的基因进行GO功能注释, 根据注
释结果对差异表达基因进行功能分类。结果表明:
122个DRS中, 涉及初生代谢的15个, 占12.30%, 10
个上调, 5个下调; 参与次生代谢的2个, 占1.64%,
均上调; 与蛋白代谢相关的基因有9个, 占7.38%, 6
个上调, 3个下调; 转录与调控的相关基因有13个,
图3 差异片段的二次扩增产物
Fig.3 Second amplification products of differential displayed TDFs
M: DL2000 DNA Marker; 1~23: 二次扩增产物。
张景龙等: 基于cDNA-AFLP技术的玉米种子劣变相关基因分析 977
占10.66%, 10个上调, 3个下调; 胁迫响应相关的基
因有9个, 占7.38%, 6个上调, 3个下调; 信号转导相
关功能的基因有9个, 占7.38%, 6个上调, 3个下调;
具有运输作用的有5个, 占4.10%, 4个上调, 1个下
调; 推定蛋白相关基因有11个, 占9.02%, 7个上调,
4个下调; 此外的49个均未匹配序列, 占40.16% (表
3和图4)。这些差异基因在种子劣变中可能扮演不
同的角色。
表3 差异表达基因的BLASTX比对分析
Table 3 BLASTX analysis of differentially expressed unigenes
功能 序列编号 长度/bp 登录号 一致性/% 序列描述 表达
初生代谢 DRS4 179 NP_001148641.1 96 菱形类蛋白(玉米) 下调
DRS5 478 DAA36743.1 100 3-异丙基苹果酸脱氢酶(玉米) 下调
DRS12 261 AAD25640.1 89 细胞质乌头酸水合酶(拟南芥) 上调
DRS14 326 ACG25447.1 100 细胞色素C (玉米) 上调
DRS17 295 EOY27594.1 34 三十四肽重复序列类超家族异构体1 (可可) 下调
DRS29 113 EMT14043.1 92 Rop鸟嘌呤核苷酸交换因子2 (山羊草) 上调
DRS34 191 EOX90866.1 82 依赖Fe (II)的2-酮戊二酸加氧酶1超家族蛋白 上调
异构体(可可)
DRS38 243 EOX98597.1 64 酰胺酶(可可) 上调
DRS41 280 XP_004960069.1 100 含有WD40重复的剑蛋白P80B1同源亚基(粟) 上调
DRS47 191 BAA10929.1 84 细胞色素P450类-TBP (烟草) 上调
DRS51 384 CAA80822.1 99 乙酰辅酶A羧化酶(玉米) 上调
DRS54 339 EMT31822.1 96 DEAD-box ATP-依赖的RNA解旋酶39 (粟) 上调
DRS70 486 NP_001148255.1 100 聚半乳糖醛酸酶(玉米) 下调
DRS71 270 NP_001183052.1 96 肌苷-5-单磷酸脱氢酶(玉米) 下调
DRS78 231 AAQ88396.1 100 非光合作用的NADP苹果酸酶(玉米) 上调
次生代谢 DRS43 390 ABD77587.1 69 牻牛儿基二磷酸合酶(葡萄) 上调
DRS66 145 AFW88361.1 100 异常花粉传输基因1 (玉米) 上调
蛋白代谢 DRS6 111 NP_001150268.1 100 含7个泛素单体的聚泛素(玉米) 下调
DRS11 286 EMS49989.1 59 Nicastrin分泌蛋白(乌拉尔图小麦) 下调
DRS20 262 CAC27136.1 68 40S核糖体蛋白S2 (挪威云杉) 上调
DRS31 203 XP_002436740.1 82 完整膜的单C2结构域蛋白(高粱) 上调
DRS39 344 XP_004951977.1 92 天冬氨酸蛋白酶类蛋白2类(粟) 上调
DRS59 426 AAG15406.1 96 胞嘧啶-5 DNA甲基转移酶MET1 (玉米) 下调
DRS68 281 ABG66256.1 86 含Agenet域的蛋白质(粳稻) 上调
DRS74 148 ABF94073.1 82 YT521-B类家族蛋白(粳稻) 上调
DRS77 217 NP_001140776.1 98 真核翻译起始因子3亚基3 (玉米) 上调
转录与调控 DRS2 355 XP_004965630.1 64 CCAAT/增强子结合蛋白α肽(粟) 上调
DRS10 236 ACG33646.1 93 同源结构域亮氨酸拉链蛋白CPHB-5 (玉米) 下调
DRS16 469 BAC16155.1 34 DNA结合蛋白(粳稻) 下调
DRS19 184 ACG26325.1 91 锌指A20含有AN1域的蛋白质(玉米) 下调
DRS23 174 XP_004962682.1 74 转录起始因子TFIID亚基8类(粟) 上调
DRS26 159 XP_004974262.1 83 RNA聚合酶II转录调节亚基15A的X2亚型(粟) 上调
DRS32 202 EMS56680.1 97 MutS蛋白类蛋白5 (乌拉图小麦) 上调
DRS40 367 DAA49099.1 100 AP2/EREBP转录因子超家族蛋白(玉米) 上调
DRS45 191 XP_004975974.1 85 SWI/SNF复合物亚基SWI3类(粟) 上调
DRS60 218 XP_004969398.1 88 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶6调节亚基3类 上调
异构体X3 (粟)
DRS65 113 AFW87466.1 100 双组分响应调节蛋白家族(玉米) 上调
DRS67 164 XP_004969396.1 91 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶6调节亚基3类 上调
异构体X1 (粟)
DRS75 343 XP_004984288.1 78 RNA聚合酶II的转录调节亚基26b样异构体X2 (粟) 上调
胁迫响应 DRS3 275 EOY21637.1 62 锚蛋白重复结构域的蛋白50异构体1 (可可) 下调
植物生理学报978
表3 (续)
功能 序列编号 长度/bp 登录号 一致性/% 序列描述 表达
DRS8 229 AFW83880.1 80 染色体浓缩(RCC1)家族蛋白(玉米) 上调
DRS9 508 NP_001150142.1 92 REC-A蛋白的抗原决定簇(玉米) 下调
DRS18 234 CAC16168.1 81 热休克蛋白70 (玉米) 上调
DRS24 185 AAP54660.2 73 反转录转座子(粳稻) 上调
DRS57 206 XP_004974224.1 88 DnaJ同源亚家族C成员28 (粟) 上调
DRS63 311 NP_001185277.1 69 含WD-40重复的转导蛋白(拟南芥) 上调
DRS79 478 EMT25634.1 78 热休克蛋白70 kDa的同源蛋白质(山羊草) 下调
DRS80 388 NP_001148098.1 97 70 kDa热休克蛋白1 (玉米) 上调
信号转导 DRS1 202 NP_178383.1 95 蛋白激酶2B (拟南芥) 上调
DRS7 395 EMT12543.1 74 含BRCT结构域的蛋白(山羊草) 上调
DRS21 198 DAA56330.1 58 蛋白激酶超家族蛋白(玉米) 下调
DRS22 209 AFW62440.1 100 蛋白激酶超家族蛋白(玉米) 下调
DRS42 277 ACG29079.1 100 β亚型55 kDa丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A的 上调
调节亚基(玉米)
DRS46 109 AFW78701.1 100 CBL-相互作用蛋白激酶家族蛋白(玉米) 上调
DRS48 271 XP_004982061.1 95 磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶1类(粟) 上调
DRS53 214 DAA52636.1 94 Ras蛋白RHN1 (玉米) 上调
DRS62 435 DAA55934.1 93 snRK/SAPK家族蛋白激酶(玉米) 上调
运输作用 DRS33 181 NP_001149529.1 100 叶绿体脂质运载蛋白(玉米) 上调
DRS44 256 XP_004951476.1 95 根毛缺陷蛋白(粟) 上调
DRS61 503 EMT18628.1 65 叶绿体移位蛋白159 (山羊草) 上调
DRS56 124 XP_004982872.1 90 X2亚型输出蛋白-4类(粟) 上调
DRS72 659 DAA43264.1 99 外膜蛋白孔蛋白(玉米) 下调
推定蛋白 DRS13 213 NP_001132458.1 96 假定蛋白(玉米) 下调
DRS15 288 ACG26588.1 83 假定蛋白(玉米) 下调
DRS25 336 NP_001130192.1 91 假定蛋白(玉米) 上调
DRS30 116 ACN27367.1 100 未知(玉米) 上调
DRS35 123 NP_001142741.1 98 假定蛋白(玉米) 上调
DRS36 195 DAA38632.1 100 假定蛋白ZEAMMB73_690745 (玉米) 下调
DRS49 117 YP_588306.1 100 假定蛋白(线粒体) (玉米) 上调
DRS50 263 DAA56642.1 99 假定蛋白ZEAMMB73_062442 (玉米) 上调
DRS58 498 AFW71278.1 98 假定蛋白ZEAMMB73_814297 (玉米) 下调
DRS69 335 NP_001130192.1 91 假定蛋白(玉米) 上调
DRS76 229 AFW81329.1 97 假定蛋白ZEAMMB73_795136 (玉米) 上调
4 部分劣变相关基因的表达模式
根据cDNA-AFLP的结果, 选取11个涉及不同
代谢过程、上调表达的DRS (DRS1、DRS2、
DRS14、DRS20、DRS24、DRS40、DRS47、
DRS48、DRS77、DRS78、DRS80), 利用Primer
5.0软件设计特异性引物(表4), 以玉米基因Actin1
为定量分析的内参基因, 进行qRT-PCR, 分析其在
不同劣变处理时间下基因的表达模式。结果显示:
DRS78、DRS14、DRS47、DRS77、DRS48、
DRS2和DRS80在劣变1~5 d, 表达量逐渐增加;
DRS40和DRS24在劣变1 d时显著上调表达, 劣变2
d时表达量下降 , 劣变3~5 d表达量逐渐增大 ;
图4 差异表达基因的功能分布
Fig.4 Functional distribution of differentially expressed genes
张景龙等: 基于cDNA-AFLP技术的玉米种子劣变相关基因分析 979
DRS20和DRS1在劣变处理1 d时表达量增加, 劣变
处理2 d时表达量减少, 劣变3 d时大幅增加, 劣变
4~5 d表达量小幅减少(图5)。以上11个基因的qRT-
PCR表达模式符合其cDNA-AFLP表达谱特征, 在
种子劣变中可能扮演不同角色。
讨 论
1 cDNA-AFLP技术在种子劣变相关基因研究中
的应用潜力
cDNA-AFLP在基因分离及其表达分析研究
领域应用广泛。Rampino等(2011)、Liu等(2012)分
别用cDNA-AFLP技术在硬粒小麦及玉米中分离出
一些衰老及胁迫相关的基因。本研究利用该技术
得到122条DRS, 功能涉及初生代谢、信号转导、
蛋白合成和运输等过程, 说明cDNA-AFLP技术可
以用于种子劣变相关基因的分析。
2 劣变处理对种子基本代谢过程的影响
细胞色素C是位于线粒体膜间隙的电子传递
元件, 它的增加会导致细胞凋亡(Yang等1997; Liu
等1996)。NADP参与调控细胞防御系统(Casati等
1999; Pinto等1999), 在NaCl胁迫下显著上调表达
(Chi等2004)。细胞色素P450对ROS的积累和导致
细胞死亡物的合成有促进作用(Kim等2009)。本研
究发现在劣变过程中, 细胞色素C、NADP和细胞
色素P450表达量逐渐增加, 可能是种子劣变的重
要因素。
蛋白合成的紊乱也是种子劣变的原因。真核
起始因子3 (eIF3)可以与游离的40S核糖体亚基结
合, 防止无翻译活性核糖体的形成; eIF3的部分亚
基具有调控细胞周期生长的作用(Dong和Zhang
2006; Shen等2004)。本研究获得的编码40S核糖体
蛋白S2基因在种子劣变过程中表现为先降低后增
加, 而eIF3的表达量逐渐增加, 说明人工劣变可能导
致种胚细胞蛋白质合成紊乱, 从而影响种子活力。
3 劣变处理对信号转导过程的影响
多磷酸肌醇(PPIs)是细胞的重要信号分子
(Krauß和Haucke 2007; Di Paolo和De Camilli 2006;
Wang等2006; Oude Weernink等2007)。蛋白激酶参
表4 差异表达基因的qRT-PCR检测
Table 4 qRT-PCR detection of differentially expressed genes
序列编号 引物方向 引物序列 退火温度/℃ 产物长度/bp
Actin1 上游 5-GTATGAGCAAGGAGATCAC-3 58.9 194
下游 5-TTAGAAGCACTTCATGTGG-3 59.0
DRS1 上游 5-GCCACAAACCAGAGTAAT-3 58.7 137
下游 5-CATGTATCCACACAAGTCA-3 58.7
DRS2 上游 5-AGAATCCTGTCCTTCGTT-3 59.3 82
下游 5-CAGAATAGGAACGCTAAGG-3 58.9
DRS14 上游 5-GGTCGGATTGAATAAATGAAC-3 59.1 117
下游 5-TTGGATACAACAAGTCTGATT-3 59.3
DRS20 上游 5-TGAGACAGTAGAGGCTTAG-3 59.0 149
下游 5-AACTTGACAGTACAGAACAG-3 59.1
DRS24 上游 5-GACCTGAGAGAAGATCCA-3 59.0 142
下游 5-AGATTGATGAGTCCTGAGT-3 59.2
DRS40 上游 5-CTAGTCCTGAATGGCAATG-3 59.3 81
下游 5-TGAGTCCTGAGTAAGTAGTT-3 59.4
DRS47 上游 5-GGCGTGCTCTTATTGATAT-3 59.4 97
下游 5-GCTCTCCATTCACCTTATG-3 59.2
DRS48 上游 5-GACTGCTCTGATGTGATG-3 58.9 112
下游 5-CTTGACTGTATGTTCCTGG-3 59.0
DRS77 上游 5-ATCTTCAGTACAGCCAGG-3 58.8 100
下游 5-GAGGAGTGAGGTCGTTTC-3 59.8
DRS78 上游 5-CTGCGTACCAATTCTACAA-3 58.9 77
下游 5-GCTGAAGTTACTGGACAC-3 58.9
DRS80 上游 5-TTGCGAAGAAGATGTATCC-3 59.2 100
下游 5-TTGGGTGGTACAAATTGAG-3 59.0
植物生理学报980
图5 劣变相关差异表达基因的qRT-PCR分析
Fig.5 qRT-PCR analysis of the differentially expressed genes related to deterioration
与葡萄糖代谢、细胞凋亡及增殖等多种重要过程,
Kusano等(2008)认为磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶3对
促进拟南芥根的生长具有重要作用。本研究获得
的磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶1类基因在种子劣变
处理过程中表达量逐渐增加; 蛋白激酶2B基因在
种子劣变1 d时表达量明显增加, 劣变2 d时明显下
调表达, 之后又大幅上调。这种表达方式可能会
造成种子正常信号转导过程的紊乱, 导致种子活
力下降。
4 种子对劣变处理的积极响应
AP2/EREBP是与植物抗逆性关系密切的一类
转录因子, 拟南芥中转录因子DREB2A的过表达可
以增强植物的耐热性(Sakuma等2006), 玉米中转录
因子ZmDREB1A的表达可以增强玉米对干旱和寒
冷等胁迫的耐受性(Qin等2004)。另外, 高温诱导
的热休克蛋白(HSP)在减轻逆境对植物的伤害也
具有重要作用(Oono等2003; Basha等2004; Rizhsky
等2004)。本研究获得的AP2/EREBP转录因子及
HSP70在种子劣变过程中, 表现为上升趋势, 说明
种胚细胞对外界刺激具有积极响应, 以降低胁迫
对细胞的伤害。因此, 增强AP2/EREBP转录因子
及HSP70基因的表达可能在延长种子寿命、提高
张景龙等: 基于cDNA-AFLP技术的玉米种子劣变相关基因分析 981
种子活力的遗传改良方面具有一定积极作用。
反转录转座子是一类可移动的遗传因子, 在
真核生物中广泛存在(Schulman等2012), 是导致植
物突变及基因组遗传和进化的重要原因(Kashkush
等2003; Alix等2005; Wang等2010), 胁迫可以激活
植物中的反转录转座子的活性(Bui和Grandbastien
2012)。本研究检测到的反转录转座子, 可能有助
于进一步研究玉米基因突变和进化机理。
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