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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）
发布的最新资料显示［1］，2011 年全球商业化种植的
转基因作物面积持续增加，达到 1.6 亿 hm2，实现连
续 15 年（1996-2011 年）的增长。其中转基因玉米
种植面积达到 5 100 万 hm2，占到总面积的 32%。而
与此同时，我国也把转基因作物研发作为一项国家
战略加以推进，新育成转基因作物品种越来越多，
转基因玉米、水稻等主粮作物的商业化也将被提上
日程。
然而科学界对于转基因植物的安全性备存争议，
使其存在一定的不确定性。普遍观点认为转基因食
品安全以及生态安全性还有待长期、持续的跟踪研
究。因此，我国目前一方面在加大转基因研发力度，
同时也在强化对转基因的监管，严控农业转基因污
染、保障我国转基因产业健康发展。而快速、高效、
收稿日期 ：2012-06-20
作者简介 ：吴明生，男，硕士，研究方向 ：种子质量检测 ；E-mail: wcxchp2010@yahoo.cn
转基因玉米种子快速筛查方法研究与应用
吴明生  云晓敏  宋歌  牛茜  彭瑞迪
（北京市种子管理站，北京 100088）
摘 要 ： 转基因种子快速筛查技术研究与应用对于加强农业转基因生物安全管理至关重要。将 DNA 热碱提取法和复合荧光
PCR 技术相结合，建立起玉米种子转基因成分快速筛查方法。结果显示，该方法不仅能保证检测的准确性和灵敏性，而且还大大
降低假阳性发生率，提高转基因筛查的效率，适合大批量样品的快速检测。
关键词 ： 转基因 玉米种子 快速 筛查方法
Study and Application of a Rapid Screening Method for
GM Maize Seeds
Wu Mingsheng Yun Xiaomin Song Ge Niu Qian Peng Ruidi
（Beijing Seed Administration Station，Beijing 100088）
Abstract:  A rapid and high efficient screening method of GM crop seeds is the important technical support for strengthening regulation
of the agricultural GMO. In this paper, a rapid screening method of GM maize seeds was established by integrating the DNA extraction method of
hot alkaline and the multiplex real-time fluorescent PCR technology. The results showed that the rapid screening method can not only ensure the
detection accuracy and sensitivity, but also greatly reducing false-positive incidence and improve the efficiency of the GMO screening, and which
is suitable for the rapid detection of large numbers of samples.
Key words:  Transgenic Corn seed Rapid Screening method
准确的转基因检测技术研究及应用是加大农业转基
因监管力度，提高科学管理水平的重要手段之一。
DNA 快速提取和高效的 DNA 扩增技术是影响
转基因种子快速检测的关键环节。本研究将热碱法［2］
用于玉米种子粉末样品的 DNA 提取，实现了 DNA
的快速提取。同时根据中国转基因作物检测与监测
网和转基因作物数据库（GM Crop Database）提供的
信息，对目前商业化的转基因玉米品种的分子特征
进行了分析，统计了常用的外源基因在这些品种的
分布情况（表 1）。选择覆盖面广，使用频率高的 3
个外源基因，即 CaMV35S 启动子、NOS 终止子和
Bar 基因作为检测的靶标基因形成组合，通过体系
优化，形成复合荧光 PCR 体系，建立了高效的转基
因玉米筛查系统。该方法特异性强、灵敏度高、重
现性好，适用于转基因玉米成分的大规模筛查检测，
2013年第1期 103吴明生等 ：转基因玉米种子快速筛查方法研究与应用
而且应用实时荧光 PCR 方法可大大提高检测效率，
表１ 商业化转基因玉米转化体外源基因应用频数分析
序号 转基因玉米转化体
外源元件
P-CaMV35S T-NOS BAR PAT CP4-EPSPS
1 CBH-351 + + + - -
2 MS3 + + + - -
3 MS6 + + + - -
4 NK 603 + + + - +
5 Bt11 + + - + -
6 LY038 + + - - -
7 MON 80100 + + - - +
8 MON 802 + + - - +
9 MON 809 + + - - +
10 MON 832 + + - - +
11 MON 88017 + + - - +
12 MON 863 + + - - -
13 MON89034 + + - - -
14 DBT418 + - + - -
15 B16 + - + - -
16 Bt176 + - + - -
17 MON 810 + - - - -
18 676 678 680 + - - + -
19 59122 + - - + -
20 T14 + - - + -
21 T25 + - - + -
22 TC1507 + - - + -
23 GA 21 - + + + -
24 MIR604 - + - + -
25 3272 - + - - -
26 DAS-06275-8 - - + - -
+ ：表示含有 ；- ：表示不含有
降低检测过程中样品交叉污染和环境的污染。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验样品 转基因玉米阳性参照样品 BT176
和 BT11 由中国农业科技发展中心提供 ；阴性玉米
样品农大 108 和郑单 958 由本实验室收集，所有样
品经粉碎后 4℃保存备用。
1.1.2 生化试剂 定量反应用配套试剂盒 TaqMan
Universal PCR Master Mix 购自美国应用生物系统公
司（Applied Biosystems，ABI）。 植 物 新 型 基 因 组
DNA 提取试剂盒、Taq 酶、dNTPs、DNA Marker 购
自北京天根生化科技有限公司，实时荧光 PCR 所用
的探针和引物序列见表 2，分别采用 HEX，FAM，
Cy3 三种不同荧光标记对 3 个基因的进行标记，由
上海英骏生物技术有限公司合成。其余试剂由北京
化学试剂公司提供。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取与质量检测
1.2.1.1 快速提取法 称取 50 mg 玉米粉末样品加
入 1.5 mL Eppendorf 离心管中，加入 200 μL NaOH
溶液（0.1 mol/L），涡旋震荡 30 s，将离心管放在沸
水浴中加热 5 min 后加入 200 mL Tris-HCl 溶液（10
mmol/L、pH2.0），涡旋震荡 10 s，上清液即可作为
DNA 模板用于扩增。
1.2.1.2 试剂盒法 参照试剂盒使用说明书。
1.2.1.3 质量检测 采用 1.0% 琼脂糖凝胶对两种方
法提取的 DNA 进行电泳检测。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期104
表 2 引物和探针序列信息
检测基因 引物和探针序列（5-3） 扩增片段（bp） 来源
zSSIIb F ：CCAATCCTTTGACATCTGCTCC 83 ［3］
R ：GGTGCTCGCGCTGCTG
P ：FAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAMRA
CaMV35S F ：ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT 101 ［4］
R ：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT
P ：HEX-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ-1
NOS F ：CATGTAATGCATGACGTTATTTATG 91 ［5］
R ：GCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTAT
P ：FAM-TGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAAT-BHQ-0
BAR F ：ACAAGCACGGTCAACTTCC 60 ［6］
R ：GAGGTCGTCCGTCCACTC
P ：Cy3-TACCGAGCCGCAGGAACC-BHQ-2
1.2.2 实时荧光 PCR 实时荧光 PCR 扩增采用 ABI
公司提供的试剂盒，反应在 20 μL 的体系中进行，其
中 2×TaqMan Universal PCR Master mix 10 μL，DNA
模板 1 μL，3 个基因的正反向引物各 0.25 μL（10-
20 μmol/L）， 探 针 0.5 μL（5-10 μmol/L）。 扩 增 在
ABI7300 型实时荧光定量 PCR 仪上进行，扩增程序
采用两步法 ：95℃预变性 10 min ；95℃变性 20 s，
60℃退火 1 min，40 个循环。
2 结果
2.1 DNA提取质量分析
琼脂糖凝胶电泳检测结果（图 1）显示，热碱
法提取的 DNA 与试剂盒法提取的 DNA 相比，DNA
提取的量较少，没有明显的亮带，弥散现象较为严重，
这主要是因为 DNA 在热碱条件下存在降解。但是以
两种方法提取的 DNA 为模板，通过实时荧光 PCR
方法对玉米内源基因 zSSIIb 进行检测，结果（图 2）
显示，两种 DNA 模板扩增效率差异不大，CT 值相
差约 2 个循环，这主要可能因为荧光 PCR 方法扩增
的 DNA 片段小（100 bp 左右），而且方法的灵敏性
好，对 DNA 模板用量的要求不高。
2.2 复合荧光PCR体系的建立
为降低不同引物之间的竞争以及荧光背景干扰，
将 3 个被检基因的引物和探针浓度设置不同梯度组
合，通过组合之间对比优化分析，最终确立 3 个被
检基因的引物及探针合适浓度。其中 CaMV35S 启动
子的引物和探针终浓度都为 200 nmol/L ；NOS 终止
子和 BAR 基因的引物终浓度都为 250 nmol/L，探针
终浓度都为 300 nmol/L。优化好的体系可对含量为 1%
转基因阳性参照（BT11 和 BT176 混合样）的 3 个基
因进行有效扩增，CT 值都位于 30-34 之间（图 3）。
2.3 特异性和灵敏度检测
为检测复合荧光 PCR 的特异性和灵敏度，利用
热碱法提取阳性参照样品的 DNA，并通过梯度稀释
获得的转基因含量 0%、0.01%、0.05%、0.1% 和 0.5%
的 DNA 模板，用复合荧光 PCR 法进行扩增。结果
显示，该方法特异性好，阴性样品均没有扩增曲线，
阳性样品含有的外源基因都获得扩增，如 BT11 的
CaMV35S 启动子和 NOS 终止子，BT176 的 CaMV35S
启动子和 Bar 基因。灵敏度分析结果（表 3）显示，
含量≥ 0.1% 样品的 3 个目的基因都得到有效扩增
（CT 值 <38），且不同重复间曲线重合性好，含量小
于 0.1% 样品扩增曲线出现不稳定，不同重复间曲线
重合性差。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
图 1 热碱法提取 DNA 电泳检测结果
1-3 ：热碱法 ；7-10 ：试剂盒法 ；M ：DNA Marker
2013年第1期 105吴明生等 ：转基因玉米种子快速筛查方法研究与应用
2.4 样品的实际检测
利用建立的快速方法，对 2011 年在北京区域
试验和预备试验的 235 份玉米品种进行了复测，检
测结果（未显示）与先前常规方法（试剂盒提取
DNA，普通 PCR 检测）检测结果完全一致，而且弱
阳性结果情况发生概率小（2%），复检的样品少，
省事省力，说明该方法具有很强的实用性，适合大
批量样品的快速检测。
3 讨论
随着我国以及全球转基因研究的不断深入，批
准进行商业化种植或作为加工原料进口的转基因产
品将持续增加。为确保转基因产品监管到位，保障
农业转基因生物安全，加大转基因产品抽检力度势
在必行，涉及转基因检测的样品量将逐年递增，因
此对转基因检测技术提出更高的要求，急需建立快
速高效的检测方法。
提高转基因检测的效率，首先需要从试验方法
上进行改进。同其它分子检测一样，DNA 成功提取
是进行检测的关键，而 DNA 提取因方法不同，繁琐
程度差异较大［7，8］，从而影响整个检测的效率，因
1.0e+000
1.0e+001
1.0e+001
1.0e+002
1.0e+003
1.0e+004
1.0e+005
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 3534 36 37 38 39 40
Cycle Number
A
B
图 2 热碱法提取 DNA 实时荧光 PCR 结果
A ：热碱法 ；B ：试剂盒法 ；检测基因 ：zSSIIb
1.0e+000
1.0e+001
1.0e+001
1.0e+002
1.0e+004
1.0e+005
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 3534 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
Cycle Number
A
B C
A ：CaMV35S 启动子 ；B ：NOS 终止子 ；C ：BAR 基因
图 3 三重复合实时荧光 PCR 结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期106
样品
含量
（%）
CT 值
CaMV35S NOS BAR
Rep.1 Rep.2 Rep.3 Rep.1 Rep.2 Rep.3 Rep.1 Rep.2 Rep.3
BT176 0.0 none none none none none none none none none
BT176 0.01 none none none none none none none none none
BT176 0.05 39.91 none 39.83 none none none none 39.87 38.93
BT176 0.1 37.54 37.39 37.82 none none none 36.54 36.97 36.82
BT176 0.5 33.16 33.27 33.42 none none none 33.16 32.27 33.21
BT11 0.0 none none none none none none none none none
BT11 0.01 39.56 none 39.96 none none none none none none
BT11 0.05 38.36 39.01 39.82 39.91 38.39 39.76 none none none
BT11 0.1 36.56 36.91 36.82 37.76 37.39 37.52 none none none
BT11 0.5 33.16 32.96 32.62 33.86 33.67 33.72 none none none
表 3 实时荧光复合 PCR 特异性与灵敏度检测
此根据检测的需求选择合适的 DNA 提取方法显得
非常重要。本研究在利用热碱法快速提取玉米种子
胚 DNA 并成功进行 SSR-PCR 检测的研究基础上［2］，
建立了玉米种子粉末 DNA 快速提取法，虽然该方法
提取的 DNA 质量不高，但是针对荧光 PCR 灵敏度
高、扩增特异性强以及扩增片段小的特点，完全可
以满足后续检测的质量要求。另外，该方法成本低廉，
相对于试剂盒方法，DNA 提取费用可以忽略不计。
其次要从策略上进行改进，针对目前繁多的外
源基因和转化体，对于大批量样品的检测，不可能
对其进行所有外源基因和转化体的鉴定，只有系统
分析转化体的分子特征，筛选使用频率高的一些外
源基因作为靶标基因进行筛查，对于筛查结果为阳
性的样品再进行转化体鉴定将大大提高检测的效率。
本研究通过分析目前商业化转基因玉米转化体的分
子特征，确定 CaMV35S 启动子、NOS 终止子和 Bar
3 个基因为筛查基因，能覆盖目前所有商业化的玉
米转化体，并且通过体系优化，建立同时检测 3 个
基因的复合荧光 PCR 方法，仅通过一次 PCR 扩增，
只要有一个基因检测结果为阳性，就可以确定该样
品含转基因成分，进而采用二分法进行品系鉴定，
方便快捷，适合大量样品快速检测。
4 结论
将 DNA 热碱提取法和复合荧光 PCR 技术相结
合，建立起玉米种子转基因成分快速筛查方法，实
现了 DNA 快速提取和 PCR 高效扩增有效结合，不
仅能保证检测准确性和灵敏性，而且还大大降低假
阳性发生，适合大批量玉米种子样品的快速筛查检
测，为农业转基因安全监管提供重要的技术支撑。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）