全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (1): 68~7668
收稿 2013-11-01　　修定 2013-11-21
资助 国家重点基础研究发展计划(2009CB118505)和国家自然
科学基金(31171474和31371553)。
* 通讯作者(E-mail: qwmeng@sdau.edu.cn; Tel: 0538-
8249606)。
抑制番茄叶绿体DnaJ蛋白基因的表达降低转基因番茄的抗高温能力
孔凡英, 邓永胜, 尹波, 吕巍, 孟庆伟*
山东农业大学生命科学学院, 作物生物学国家重点实验室, 山东泰安271018
摘要: DnaJ蛋白是广泛存在于植物细胞内的一种分子伴侣。在胁迫条件下它能够保护细胞内蛋白质等结构的稳定性。本
研究克隆到一个番茄叶绿体DnaJ蛋白基因(LeCDJ1)。半定量PCR分析表明LeCDJ1的表达受NaCl、高温、PEG及ABA的
诱导。利用反义抑制的方法获得了LeCDJ1抑制表达的转基因番茄。高温条件下, 转基因株系较野生型表现出较严重的光
系统II (PSII)光抑制, 较低的D1蛋白含量, 较高的超氧阴离子(O2¯· )、过氧化氢(H2O2)含量, 及较低的抗坏血酸过氧化物酶
(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。这些结果表明, 抑制LeCDJ1的表达降低了转基因番茄的抗高温能力。
关键词: D1蛋白; DnaJ蛋白; 高温胁迫; 光系统II; 活性氧; 番茄
Suppression of a Tomato Chloroplast DnaJ Protein Gene Reduced Heat Tolerance
in Transgenic Tomatoes
KONG Fan-Ying, DENG Yong-Sheng, YIN Bo, LÜ Wei, MENG Qing-Wei*
State Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Sciences, Shandon Agricultural University, Tai’an, Shandong 271018, China
Abstract: DnaJ proteins are ubiquitous molecular chaperones contributing to cellular protein conformation
stability under stress conditions. In this study, the full length of a tomato chloroplast DnaJ protein gene
(LeCDJ1) was cloned and analyzed. The LeCDJ1 expression was up-regulated by NaCl, heat, PEG and ABA.
Antisense-mediated suppression of LeCDJ1 transgenic tomato was obtained. The transgenic tomato showed
more serious PSII photoinhibition, less D1 protein content, higher superoxide radical (O2¯· )
and hydrogen
peroxide (H2O2) content and lower scorbate peroxidase (APX) and superoxide dismutase (SOD) activity than
WT under heat stress. These results indicated that LeCDJ1 suppression reduced heat tolerance in transgenic
tomatoes.
Key words: D1 protein; DnaJ protein; heat stress; photosystem II; reactive oxygen species; tomato
全球变暖和气候的变化使高温成为限制植物
生长的主要非生物胁迫因子之一。高温破坏细胞
内蛋白质正确的空间构象, 诱导产生大量的活性
氧(ROS), 引起植物PSII的光抑制。为了生存, 植物
进化出了许多机制以适应高温, 包括诱导产生热
激蛋白(Hsp; Schlesinger 1990)。
DnaJ蛋白是Hsp40家族的一员, 是广泛存在于
植物细胞内的一种分子伴侣。它作为Hsp70的辅
伴侣分子, 促进其ATP酶活性, 促进低底物结合能
力的ATP结合的Hsp70向高底物结合能力的ADP结
合的Hsp70转化, 帮助Hsp70完成蛋白质折叠、解
折叠、向特定细胞器运输和调节蛋白复合物解聚
等功能(Hartl和Martin 1996)。DanJ蛋白最早是在
E. coli中发现的(Georgopoulos等1980), 以后在真核
生物中, 包括人类、动物、植物、酵母等都发现
它们的同源蛋白(Bukau和Horwich 1998; Craig等
2006; Goffin和Georgopoulos 1998; Liberek等1991;
Miernyk 1999)。J结构域是J蛋白最重要的结构域,
也是与Hsp70结合的主要区域。除了J结构域外, E. coli
DnaJ蛋白还有G/F结构域、锌指结构域和羧基末
端区等。根据DnaJ蛋白的结构将其分为三类, 其
中第三类DnaJ蛋白只含有J结构域(Cheetham和Caplan
1998)。在植物细胞内, J蛋白广泛分布于细胞质、
叶绿体、线粒体、内质网等各种细胞器(Nicoll等
2006; Orme等2001; Thomas和Baneyx 1996; Voos和
Rottgers 2002)。DanJ蛋白是广泛的胁迫响应因子,
在非生物胁迫响应中起着重要的作用。很多研究
表明 , DnaJ蛋白参与了植物的高温胁迫响应。
THERMOSENSITIVE MALE STERILE 1 (TMS1),
孔凡英等: 抑制番茄叶绿体DnaJ蛋白基因的表达降低转基因番茄的抗高温能力 69
一个拟南芥DnaJ蛋白在拟南芥花粉管耐热性中起
着重要的作用(Yang等2009); 敲除拟南芥AtDjB1,
降低了突变体的耐热性(Zhou等2012)。
高温能够影响植物细胞的许多过程, 包括光
合作用。高温破坏PSII的天线系统、放氧复合体
和PSII反应中心等的结构。PSII的热稳定性很低,
是高温破坏的主要目标之一。人们很早就发现高
温胁迫容易引起植物PSII的光抑制。向离体的类
囊体膜添加外源叶绿体Hsp21在高温处理时对PSII
具有保护作用(Heckathorn等1998), 说明在温度逆
境条件下Hsp对光合系统有一定的保护作用。研
究表明, Hsp70分子伴侣系统参与PSII失活反应中
心的修复。早在1999年德国的Schroda等就发现衣
藻叶绿体定位的Hsp70参与光保护及光抑制后PSII
的修复。进一步实验证明, 5%~25%的Hsp70可以
和类囊体膜相互作用。不久之后, Yokthongwattana
等(2001)发现绿藻叶绿体Hsp70B也参与PSII的修
复。绿藻细胞发生严重的光破坏时, Hsp70B的转
录水平会迅速提高, 蛋白也大量积累, 并且Hsp70B
与已被破坏但未被降解的D1蛋白、D2蛋白、
CP47等形成大约320 kDa的复合体。推测Hsp70B
的作用是稳定解体的PSII核心复合体, 促进D1蛋
白的降解和置换过程。可见, Hsp70在PSII失活反
应中心的修复过程中发挥着重要的作用。Chen等
(2010)发现拟南芥叶绿体定位的3个小DnaJ蛋白
AtDnaJ8、AtDnaJ11和AtDnaJ20能够维持强光条
件下PSII复合体结构的稳定性, 促进光合作用。作
为Hsp70的辅伴侣分子, DnaJ蛋白在PSII修复过程
中的具体作用是什么有待进一步的探讨。
为此, 我们克隆了一个番茄叶绿体定位的第3
类DnaJ蛋白基因(LeCDJ1), 并且在GenBank数据库
内注册(GQ925907)。前期研究结果表明, 该基因
参与维持低温胁迫条件下PSII的稳定性(Kong等
2013b), 过表达该基因提高了转基因番茄的高温抗
性(Kong等2013a)。本研究发现反义抑制该基因的
表达加剧了转基因番茄在高温胁迫下PSII的光抑
制和ROS的积累。
材料与方法
1 植物材料及处理
以番茄(Lycopersicon esculentum Mill.) “中蔬
六号”野生型和反义抑制LeCDJ1表达的转基因株
系(Kong等2013b)为试材。种子于MS培养基生根
后分别播种于塑料盆中, 以蛭石作基质, Hoagland
培养液培养。于室温(25±2) ℃, 光照800 µmol·m-2·s-1,
湿度50%~60%的条件下生长。将生长2个月左右的
番茄置于光照培养箱中进行处理, 光照强度为200
µmol·m-2·s-1。处理方法分别为: 高温处理为42 ℃处
理24 h; 盐胁迫处理用含200 mmol·L-1 NaCl的Hoag-
land营养液浇灌3 d; PEG处理用含20% PEG-6000的
Hoagland营养液浇灌24 h。ABA处理用终浓度为
100 μmol·L-1的ABA喷施番茄叶片, 持续光照24 h。
2 测定项目与测定方法
2.1 LeCDJ1基因全长的克隆
番茄总RNA的提取采用Trizol抽提法, 具体步
骤按照天根RNA提取试剂盒说明书进行(天根, 北
京)。反转录按照Fermentas反转录试剂盒说明书
进行。根据GenBank已知序列设计引物进行聚合
酶链式反应(PCR), PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检
测扩增片段。将所得的PCR产物与pMD-18T克隆
载体连接, 转化大肠杆菌。通过菌落PCR快速筛选
得到阳性克隆, 将鉴定好的菌液寄往上海生物工
程公司测序。用Blast、DNAman或DNAclub软件
将所得片段序列与来源于其他植物的同源序列进
行序列比较, 发现该基因是我们所要克隆的目的
基因, 并且没有移码现象。
2.2 半定量PCR
番茄总RNA的提取及反转录按照上述方法进
行。以EF-1α (GenBank登录号X144491)为Actin。
具体步骤如下: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性30 s,
54 ℃退火40 s, 72 ℃延伸40 s, 28个循环; 72 ℃后
延伸5 min。所用引物如下: EF-1α正向引物5′-
GGAACTTGAGAAGGAGCCTAAG-3′, 反向引物
5′-CAACACCAACAGCAACAGTCT-3′; LeCDJ1正
向引物5′-ACTCAGCGAAGAAGAAGACTAG-3′,
反向引物5′-GGTGATACTTAAGAGCAAGCTG-3′。
2.3 叶绿素荧光参数测定
叶绿素荧光参数测定参考van Kooten和Snel
(1990)的方法, 采用Hansatech公司生产的脉冲调制
式便携荧光仪FMS2测定。处理过程中Fv/Fm在黑
暗适应25 min后测定。公式为: Fv/Fm=(Fm–Fo)/Fm;
ΦPSII=(Fm′–F s′ ) /Fm′ ; qP=(Fm′–F s′ ) / (Fm′–F o′ ) ;
NPQ=Fm/Fm′–1; qI=Fm/Fmr–1; qE=Fm/Fm′–Fm/Fmr。其
中, Fo为充分暗适应的初始荧光, Fm为充分暗适应
植物生理学报70
的最大荧光, Fm′为光下最大荧光, Fs′为稳态荧光, Fo′
为光下初始荧光, Fmr为暗弛豫荧光。每处理重复3
次, 每重复测定5株, 结果以平均值±标准误表示。
2.4 Western blot分析
类囊体膜的制备根据Zhang等(1999)的方法, 略
加改动。提取的类囊体膜蛋白通过含有6 mol·L-1尿
素的15%的SDS-PAGE进行分离。分离的蛋白质通
过半干转膜法转移到PVDF膜上, 以D1蛋白抗体为
一抗, 过氧化物酶标记的羊抗兔的IgG为二抗。用4-
氯-1-萘酚显色法显示蛋白质浓度并用数码相机拍
照。为了保证上样量一致, 每孔上20 μg叶绿素。
2.5 O2¯·与H2O2的染色
O2¯·的染色: 将叶片直接浸泡在25 mmol·L-1磷
酸缓冲液(pH 7.6)溶解的NBT (0.1 mg·mL-1)溶液中,
在25 ℃黑暗培养16 h。放于乙醇:乳酸:甘油(3:1:1)
固定液中煮沸10 min, 冷却, 将叶片转入新鲜的固
定液中。室温下过夜, 照相。
H2O2的染色: 染色溶液为0.1 mg·mL
-1 3,3′-二
氨基联苯胺(DAB), 用50 mmol·L-1 Tris-醋酸(pH
5.0)溶解。将叶片浸泡在染色液中, 25 ℃黑暗培养
过夜。放于乙醇:乳酸:甘油(3:1:1)固定液中煮沸10
min, 冷却, 将叶片转入新鲜的固定液中。室温下
过夜, 照相。
2.6 O2¯·与H2O2含量的测定
O2¯·含量的测定参照王爱国和罗广华(1990)的
方法。
H2O2含量的测定: 取0.2 g样品, 加入丙酮抽
提, 提取液在钛盐(TiCl4)与浓HCl的混合物和浓氨
水反应, 将所生成的过氧化物离心沉淀。沉淀溶
于1 mmol·L-1 H2SO4中, 于415 nm下测定吸光值。
结果以µmol·g-1 (FW)表示, 用溶于3%三氯乙酸的
H2O2作标准曲线。每处理重复3次, 结果以平均值±
标准误差表示。
2.7 APX和SOD活性的测定
APX活性测定参照Mishra等(1993)的方法, 以
每分钟氧化1 μmol AsA的酶量为一个酶活单位。
SOD活性的测定参照Bartoli等(2000)的方法。
实验结果
1 LeCDJ1基因及其编码蛋白序列分析
由测序结果可知, 我们获得的LeCDJ1基因
cDNA全长为814 bp, 在第101个核苷酸处为起始密
码子ATG, 在584个核苷酸处为终止密码子TGA
(图1中长方形标出)。其编码区为483 bp, 由此推断
图1 番茄LeCDJ1基因序列及其由此推导的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of LeCDJ1 from tomato
方框为起始密码子ATG和终止密码子TGA; 下划线为赖氨酸(K)残基; 椭圆为HPD模块。
孔凡英等: 抑制番茄叶绿体DnaJ蛋白基因的表达降低转基因番茄的抗高温能力 71
该蛋白应包含161个氨基酸残基。该序列编码的
氨基酸具有明显的DnaJ蛋白家族J结构域的特征。
J结构域由4个α-螺旋组成, 第2个螺旋的表面富含
带正电荷的赖氨酸(K, 图1中下划线标出), 第2个螺
旋和第3个螺旋之间有极为保守的组氨酸、脯氨
酸、天冬氨酸序列, 即HPD模块(Qian等1996, 图1
中椭圆标出)。
利用DNAman软件将该基因编码的氨基酸序
列与GenBank中其他植物氨基酸序列进行比对, 结
果显示番茄LeCDJ1与拟南芥、杨树、蓖麻、大
豆、苜蓿、葡萄的DnaJ8蛋白和豌豆的J8b蛋白高
度同源, 但与拟南芥AtDnaJ11和AtDnaJ20同源性
不高(图2)。研究表明 , 拟南芥AtDnaJ8和豌豆
PsJ8b蛋白主要位于叶绿体基质, 也有小部分与类
囊体膜结合。以上结果表明我们已经成功地克隆
到了番茄DnaJ蛋白基因, 将该基因命名为LeCDJ1,
并在GenBank中注册, 注册号为GQ925907。
2 LeCDJ1基因的表达分析
半定量PCR (RT-PCR)结果表明, 200 mmol·L-1
NaCl、42 ℃和20% PEG-6000处理均能诱导LeCDJ1
的表达(图3)。NaCl和PEG处理条件下番茄LeCDJ1
的表达量随着处理时间的延长而升高(图3-A、C);
42 ℃处理明显上调了LeCDJ1的表达, 并且表达量
在处理6 h时达到最高(图3-B)。ABA是调节植物
环境胁迫响应的重要信号分子。LeCDJ1的表达受
ABA的诱导(图3-D), 说明LeCDJ1对于环境胁迫的
响应极有可能依赖于ABA信号转导途径。
3 抑制LeCDJ1的表达降低了转基因番茄的抗高温能力
为了研究LeCDJ1在植物高温胁迫响应中的
作用, 我们用反义抑制的方法获得了42 ℃处理前
后LeCDJ1表达量均明显下降的转基因株系(图
4-A)。将2个月大小的野生型及转基因植株于42
℃处理24 h前、后分别拍照(图4-B)。结果表明, 处
理前(25 ℃), 野生型与转基因植株生长状况基本一
图2 LeCDJ1与DnaJ8、AtDnaJ11和AtDnaJ20的氨基酸序列比对
Fig.2 Amino acid sequence alignment between LeCDJ1, DnaJ8, AtDnaJ11 and AtDnaJ20
GenBank中DnaJ8蛋白的注册号为: 番茄(Lycopersicon esculentum) CDJ1 (GQ925907); 拟南芥(Arabidopsis thaliana) DnaJ8
(NP_178207.1); 杨树(Populus trichocarpa) DnaJ8 (XP_002304733); 蓖麻(Ricinus communis) DnaJ8 (EEF49240); 豌豆(Pisum sativum)
J8b (ADL32216); 大豆(Glycine max) DnaJ8 (ACU18989); 苜蓿(Medicago truncatula) DnaJ8 (ACJ83936); 葡萄(Vitis vinifera) DnaJ8
(XP_002263153); 拟南芥DnaJ11 (NM_119771.3); 拟南芥DnaJ20 (NM_117457.4)。
植物生理学报72
致。处理后, 野生型与转基因植株的生长均受到
抑制, 叶片萎蔫失水失绿, 但是野生型总体生长状
况好于转基因株系。
4 抑制LeCDJ1的表达加剧了转基因番茄在高温胁
迫下PSII的光抑制
有研究表明, 高温胁迫容易引起植物PSII的光
抑制。为了研究转LeCDJ1基因在高温胁迫下对
PSII的作用, 我们检测了野生型与转基因番茄充分
暗适应的光合机构的初始荧光(Fo)、充分暗适应
的光合机构潜在的PSII光化学效率(Fv/Fm)、作用
光下实际的PSII光化学效率(ΦPSII)、叶绿素荧光
的光化学猝灭(qP)、叶绿素荧光的非光化学猝灭
(NPQ), 以及NPQ的不同组分: 依赖类囊体膜内外
质子浓度差的猝灭(qE)和光抑制相关的猝灭(qI)。
实验结果表明: 正常条件下, 野生型与转基因株系
的这些荧光参数无明显差别(表1)。42 ℃处理12 h
后, 转基因株系尤其是A11表现出较高的Fo、NPQ
和qI, 较低的Fv/Fm和ΦPSII。野生型与转基因株系
的qE在处理后依然没有表现出明显的差别。说明
转基因株系较低的Fv/Fm与较高的Fo有关, 而较高
的NPQ则是由较高的qI引起的。
5 抑制LeCDJ1的表达降低了转基因番茄在高温胁
迫下D1蛋白含量
D1蛋白是PSII的核心蛋白之一, 也是PSII发生
破坏的主要目标。为了探究转基因株系降低的
PSII活性是否与D1蛋白有关, 我们用Western blot
的方法分析了野生型与转基因番茄高温处理前后
的D1蛋白含量。结果表明, 高温处理前野生型和
转基因植株D1蛋白总量没有太大差异, 而经高温
胁迫后野生型和转基因植株D1蛋白含量均有所下
降。与野生型相比, 高温胁迫12 h后, 转反义基因
株系的D1蛋白含量显著下降(图5)。
6 抑制LeCDJ1的表达加剧了转基因番茄在高温胁
迫下ROS的积累
我们分别用NBT和DAB染色的方法分析了
O2¯·和H2O2的含量。结果如图6-A、B, 高温处理后,
转基因株系较野生型具有更深的斑点, 说明转基
因株系积累了较多的O2¯·和H2O2。该实验结果与我
们定量检测O 2¯·和H 2O 2含量的实验结果一致(图
6-C、D)。高温处理后, 野生型及反义株系A5、
A11和A13的O2¯·含量分别增加了1.6、1.9、2.2和2.0
图3 LeCDJ1在番茄中的表达分析
Fig.3 Expression profiles of LeCDJ1 in tomato
A: 200 mmol·L-1 NaCl; B: 42 ℃; C: 20% PEG-6000; D: 100
μmol·L-1 ABA。
图4 转基因株系的筛选(A)及高温条件下野生型及转基因
株系的表型分析(B)
Fig.4 Identification of transgenic plants (A) and growth
analysis of the WT and transgenic plants under heat stress (B)
上图: 处理前(25 ℃); 下图: 42 ℃处理24 h (42 ℃)。
孔凡英等: 抑制番茄叶绿体DnaJ蛋白基因的表达降低转基因番茄的抗高温能力 73
表1 高温条件下野生型及转基因株系的Fo、Fv/Fm、ΦPSII、qP、NPQ、qI和qE
Table 1 Effects of heat stress on Fo, Fv/Fm, ΦPSII, qP, NPQ, qI and qE in WT and transgenic plants
参数 温度/℃ WT A5 A11 A13
Fo 25 107±5.508 115±4.000 112±4.359 108±8.327
42 173±4.509 196±13.892 203±5.568* 192±6.658*
Fv/Fm 25 0.856±0.0078 0.847±0.0106 0.854±0.00500 0.859±0.00889
42 0.665±0.0103 0.618±0.00917 0.613±0.00361* 0.628±0.00854
ΦPSII 25 0.793±0.0147 0.789±0.0145 0.776±0.0119 0.782±0.0127
42 0.487±0.0227 0.454±0.00733 0.411±0.0106* 0.446±0.00261
qP 25 0.876±0.0101 0.882±0.00929 0.879±0.0102 0.879±0.0114
42 0.727±0.0102 0.697±0.00781 0.680±0.0172 0.705±0.00794
NPQ 25 0.571±0.0115 0.576±0.00964 0.582±0.00945 0.569±0.0154
42 3.721±0.135 4.096±0.129** 4.170±0.0829** 4.072±0.174*
qI 25 0.264±0.0179 0.269±0.0110 0.271±0.0122 0.263±0.0139
42 2.167±0.0809 2.534±0.114** 2.598±0.0644** 2.475±0.120**
qE 25 0.307±0.0201 0.307±0.0182 0.311±0.0136 0.306±0.0236
42 1.554±0.0641 1.562±0.0157 1.572±0.0187 1.597±0.0739
　　处理前(25 ℃), 42 ℃处理12 h (42 ℃); 数据用均值±标准误来表示; *: P<0.05, **: P<0.01, 表示在同一温度下转基因株系与WT的差异。
倍, H2O2含量分别增加了1.5、1.9、1.8和1.9倍。
7 抑制LeCDJ1的表达降低了转基因番茄在高温胁
迫下APX和SOD活性
正常条件下, 野生型和转基因番茄叶片的APX
和SOD活性均无明显差异。高温处理12 h后, APX
和SOD的活性均有下降 , 但野生型番茄叶片的
APX和SOD活性明显高于转基因株系(图7)。高温
处理后, 野生型和转基因株系A5、A11和A13的
APX活性分别降低为处理前的91%、74%、69%
和78%。SOD活性变化明显, 分别降低为处理前的
74%、63%、60%和61%。
讨　　论
高温等胁迫条件经常导致植物体蛋白质的变
性。因此, 维持蛋白质结构的稳定对于植物在胁
迫条件下的生存非常重要(Lee和Vierling 2000;
Yang等2010)。作为广泛分布于植物细胞中的分子
伴侣, DnaJ蛋白参与蛋白质的折叠、解折叠、以
及蛋白复合物的聚合和解聚等过程, 维持蛋白质
及其复合体结构的稳定(Wang等2004)。因此, 研
究DnaJ蛋白的功能有助于了解植物的高温胁迫响
应机制。我们克隆到一个叶绿体定位的第三类的
番茄DnaJ蛋白基因——LeCDJ1, 并且发现该基因
参与低温胁迫条件下PSII的维持, 过表达该基因提
高了转基因番茄的温度胁迫抗性(Kong等2013a,
b)。本研究发现, 抑制表达LeCDJ1加剧了PSII的光
抑制和ROS的积累, 降低了APX和SOD的酶活性。
DnaJ蛋白是广泛的胁迫响应因子(Rajan和
D’Silva 2009)。它们的表达受到高温、强光、MV
以及低温等环境胁迫的诱导(Piippo等2006; Scar-
peci等2008)。本实验中, 半定量PCR结果表明,
LeCDJ1的表达受到NaCl、高温以及PEG的诱导
(图3), 暗示LeCDJ1可能在这些环境胁迫响应中具
有重要的作用。已有研究表明, DnaJ蛋白参与了
植物的环境胁迫响应。拟南芥TMS1基因编码一个
DnaJ蛋白的同源蛋白, 该基因敲除突变体花粉管
的伸长在高温条件下明显受到抑制(Yang等2009)。
拟南芥AtDjB1基因编码一个线粒体定位的DnaJ蛋
白, 该基因敲除后降低了细胞内抗坏血酸(ASA)含
量, 加剧了高温条件下ROS的积累, 降低了突变体
的抗高温能力。BIL2也是一个线粒体定位的DnaJ
蛋白, 它在拟南芥对于高盐以及强光胁迫的响应
图5 野生型及转基因株系D1蛋白的Western blot检测
Fig.5 Western blot analysis of D1 protein in WT and
transgenic plants
CK: 上样对照; 为了保证上样量的一致, 每孔上20 μg叶绿素。
植物生理学报74
过程中具有重要作用(Bekh-Ochir等2013)。本实验
中, 我们发现抑制LeCDJ1的表达明显降低了转基
因番茄的抗高温能力(图4)。
人们很早就发现高温胁迫容易引起植物PSII
光抑制, 有研究表明PSII是高温胁迫伤害的初始位
点(Havaux 1993)。高温胁迫能够影响PSII的天线
系统和PSII反应中心。本研究发现, 反义抑制表达
LeCDJ1的转基因番茄较野生型在高温处理后表现
出较低的Fv/Fm和较高的Fo, 说明转基因株系中较
低的Fv/Fm可能是由于较高的Fo引起的(表1)。而Fo
的升高可能是由于捕光复合物从PSII反应中心解
离导致PSII反应中心能量捕获速率降低(Havaux
1993)。这一现象在许多植物经受高温损伤后都被
观察到。Fv/Fm是PSII光化学效率的一个重要指
标。转基因株系较低的Fv/Fm说明它们的PSII的光
抑制程度更为严重。这一点也被转基因株系具有
较高的光抑制相关的非光化学猝灭qI值进一步验
证。qI是NPQ的一个组分。除了qI外, NPQ还包括
qE和qT (状态转换相关; Baker等2007)。本研究只
测定了qE和qI。高温处理后, 转基因株系和野生型
图6 O2¯·和H2O2的NBT和DAB染色分析和定量分析
Fig.6 NBT (A) and DAB (B) staining for O2¯· and H2O2, and quantitative analysis of O2¯· (C) and H2O2 (D)
A: O2¯·的NBT染色分析; B: H2O2的DAB染色分析; C: O2¯·的定量分析; D: H2O2的定量分析; *: P<0.05; **: P<0.01。
图7 高温处理对野生型和转基因番茄叶片APX及SOD活性
的影响
Fig.7 Effect of heat treatment on activities of APX and SOD
in leaves of WT and transgenic plants
A: APX; B: SOD; *: P<0.05; **: P<0.01。
孔凡英等: 抑制番茄叶绿体DnaJ蛋白基因的表达降低转基因番茄的抗高温能力 75
的qE并没有表现出明显的差异, 说明转基因株系中
较高的NPQ是由于较高的qI引起的。而qI的升高可
能与D1蛋白的周转有关。D1蛋白位于PSII反应中
心, 是PSII复合体发生光破坏的靶位点。当D1蛋
白被破坏后, 能够从头合成, 发生PSII的修复循环
(Nishiyama等2006)。一般认为, PSII反应中心的修
复包括如下过程: D1蛋白的降解和移出、D1蛋白
前体的合成、PSII的重新组装和由D1蛋白前体加
工为成熟的D1蛋白(Aro等2004; Mulo等2008)。研
究表明, Hsp70分子伴侣系统参与PSII失活反应中
心的修复。本研究也发现, 高温处理后, 转基因株
系较野生型具有较低的D1蛋白含量, 说明LeCDJ1
在高温条件下能够保护D1蛋白(图5)。
植物叶绿体是ROS产生的主要部位(Lim等
2007)。高温胁迫可以导致ROS产生的增加。产生
的ROS不仅阻碍D1蛋白合成的翻译过程, 还对叶
绿体乃至整个细胞造成氧化伤害(Murata等2007)。
植物具有多种抗氧化机制, 主要包括酶促和非酶
促两种方式。酶促方式包括一些酶类, 如抗坏血
酸过氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)、过
氧化氢酶等; 非酶促方式包括一些低分子量的抗
氧化物质, 如抗坏血酸(AsA)等。Chen等(2010)发
现, 三个拟南芥叶绿体DnaJ蛋白通过调节AtAPX的
基因表达, 调节体内ROS代谢。Zhou等(2012)发
现, 拟南芥线粒体AtDjB1调节细胞内抗坏血酸含
量, 维持高温条件下ROS代谢的平衡。本研究中,
高温条件下, 与野生型相比, 转反义转基因植株具
有更高的O2¯·和H2O2含量, 更低的APX和SOD活性
(图6、7), 说明转反义基因株系较多的ROS的积累
可能是由于较低的APX和SOD活性, 妨碍了ROS的
有效清除引起的。而ROS的大量积累也可能是造
成更严重的光抑制和光破坏的原因之一。
总之, LeCDJ1的抑制表达降低了APX和SOD
的活性, 加剧了高温条件下转基因番茄ROS的积
累, 提高了转基因番茄PSII的光抑制程度。
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