全 文 ：中草蔼 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年lo月·1535·
参考文献：
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葛根素对人小细胞肺癌H446细胞周期和相关周期蛋白表达的影响
李娟，胡永华。
(北京大学医学部公共卫生学院，北京100083)
摘要：目的观察葛根素诱导人小细胞肺癌H446细胞周期的阻滞作用，进一步探讨其作用机制。方法采用
MTT法测定葛根素对H446细胞生长的影响；采用流式细胞术检测处理后H446细胞周期分布和周期蛋白cyclin
D。、CDK．和P27表达水平。结果MTT法表明葛根素对H446细胞生长有较强的抑制作用；流式细胞仪检测结果
发现细胞周期阻滞在Go／G，期，量效关系良好，并检测到细胞周期蛋白cyclinD。、CDK。表达减弱，P27表达增强。结
论葛根素可通过诱导细胞周期阻滞而发挥体外抗肺癌作用。其机制可能涉及细胞周期相关蛋白eyclinDz、CDK．
和P27表达的调控。
关键词：葛根素；H446细胞；cyclinDl蛋白；CDK。蛋白；P27蛋白
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)10—1535—03
肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，在我国许
多城市已位居全部恶性肿瘤死因的首位口]。长期大
量的临床证明，化学治疗肿瘤副作用大，植物来源抗
癌药物越来越受到人们的青睐。葛根素是豆科多年
生落叶藤本植物野葛Puerarialob ta(Willd．)
Ohwi或甘葛藤P．thomsoniiBenth．的根中葛根异
黄酮的主要有效成分之一[2]。以往研究表明，葛根总
黄酮具有明显的抗肿瘤作用[3]，但其主要成分葛根
素对人小细胞肺癌H446细胞的影响还不清楚。本
实验的目的在于研究葛根素对人小细胞肺癌H446
细胞生长的抑制作用和对细胞周期的阻滞作用，并
初步探讨其作用机制。
1材料
人小细胞肺癌H446细胞株由中国科学院上海
生命科学院营养所提供；RPMI一1640培养基和胎牛
血清为Gibco公司产品；胰蛋白酶和MTT为
Sigma公司产品；鼠抗人cyclinDl、CDK4、P27单克
隆抗体和羊抗鼠IgG抗体均购自武汉博士德生物
工程有限公司；96孔细胞培养板为美国Corning公
司产品；HERAcell150型C0。培养箱为德国
Heraeus公司产品；LH50A型倒置相差显微镜为日
本Olympus产品；流式细胞仪FACSCalibur为美
国BD公司产品。葛根素，棕黄色粉末(质量分数
90％)，中国药品生物制品检定所产品，批号752—
200511，试验时，用含0．1％二甲基亚砜(DMSO)
的RPMI一1640培养基溶解，一次性滤器滤过除菌。
2方法
2．1 H446细胞悬液制备：将H446细胞培养于含
10％灭活胎牛血清，青霉素及链霉素各100U／mL
的RPMI一1640培养基中，置于37℃、饱和湿度、
5％CO。培养箱中培养，隔日换液，待细胞进入对数
生长期后，贴壁细胞弃去上清液，磷酸盐缓冲液
(PBS)冲洗2次，0．25％胰蛋白酶消化，传化细胞。
2．2 MTT法检测葛根素对H446细胞生长的抑制
作用：将1×104／mLH446细胞悬液接种于96孔细
胞培养板中，每孔100弘L，培养24h后细胞贴壁，
弃去原培养液，分别加入不同终质量浓度的葛根素
(40、80、160、320、640pg／mL)各100弘L，另设不加
药物的对照组，培养72h后，每孔加入20pLMTT
溶液，继续孵育4h终止培养，弃去MTT，每孔加
收稿日期：2007-12—1l
作者简介：李娟(198l一)．女．河南安阳人，北京大学医学部在读博士研究生，主要研究方向为营养与疾病。
E—mail：taozilijuan@126．COrn
·通讯作者胡永华Tel／Faxl(OLO)82801189E—mail：yhhu@bjmu．edu．crl

万方数据
·1536· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月
入150弘LDMS0，振荡10rain，用酶联免疫检测仪
于490nm处检测各孔吸光值(A)值，计算细胞生
长抑制率。
细胞生长抑制率=(1一实验组A值／对照组A值)x
100％
2．3流式细胞仪检测细胞周期和细胞周期蛋白：实
验组160、320、640tlg／mL葛根素作用于H446细
胞72h，对照组只加等量含0．1％DMSO的
RPMI一1640培养基，分别收集各组细胞，每组设5
个复孔，PBS洗3遍，注入预冷的70％乙醇，固定过
夜，1000r／min离心lOrain，弃去乙醇，以PBS洗1
次，重悬于PBS中，加入1mLPI，混匀，4℃避光
反应30min后，用流式细胞仪在488nm波长处检
测细胞周期分布，计算细胞增殖指数(proliferation
index，PI)。
PI=(S+G2／M)／(Go／G1+S+Gz／M)×100％
取冷乙醇固定的细胞，分别加入鼠抗人
cyclinD。、CDK．、p27单克隆抗体工作液100弘L，室
温孵育30min，PBS洗1遍，1000r／min离心5
rain，弃上清，加入羊抗鼠IgG二抗工作液100肛L，
避光室温孵育30min，PBS洗1遍，1000r／min离心
5min，弃上清以去除未结合的荧光二抗，加入0．1
mLPBS后，上机检测细胞周期蛋白表达情况。结果
判定：蛋白表达定量分析以荧光指数(FI)表示其相
对量。FI>1．0，为阳性表达，FI<1．0，为阴性表达。
FI=实验组蛋白表达的平均荧光强度／对照组蛋白表达
的平均荧光强度
2．4统计学处理：数据用z士s表示，两组间比较用
t检验，多组间比较用单因素方差分析，应用SPSS
13．0统计软件计算，所有实验结果均重复3次。
3结果
3．1葛根素对H446细胞生长的影响：与对照组比
较，较高质量浓度的葛根素(80～640pg／mL)对
H446细胞的生长具有抑制作用，并呈现良好的剂
量依赖关系，随着药物质量浓度的增加，其抑制生长
的作用逐渐增强，结果见表1。
3．2 葛根素对H446细胞周期和PI的影响：葛根
素可以改变H446细胞周期分布，H446细胞G。／G。
期明显升高，S期和G：／M期均明显下降。细胞周期
动力学显示，与对照组相比，H446细胞PI减小。且
这种效应具有良好的剂量依赖关系，结果见表2。
3．3 葛根素对H446细胞周期蛋白cyclinD。、
CDKt和P27表达的影响：以FI进行蛋白表达分
析，经320pg／mL葛根素作用72h后，H446细胞
中cyclinD，、CDK。蛋白阴性表达，P27蛋白阳性表
达，结果见表3。
寰1 葛根素对H446细胞生长的抑制作用(；士s，厅=5)
Table1 InhibitionofpuerarinonH446cellgrowth
(；士s。矗一5)
与对照组比较：一P<0．01
**P裹2葛根素对H446细胞周期和PI的影响(；士$。万一5)
Table2 EffectofpuerarinoncellcyclesandPI
ofH446cells(；士$，n=5)
．．．． 剂量／ 细胞周期分布／，i组尉—— PI／，；
(Jlg·mL—1)Go／G, S G2／M
对照 一
葛根素 160
320
640
与对照组比较：。P<0．05一P。P<0．05一P<0．01wcontrolgroup
寰3葛根素对H446细胞周期蛋白cyclinD。、CDK．
和P27蛋白表达的影响(工士$，厅=5)
Table3 EffectofpuerartnonexpressionofcyclinDI，
CDK4，andP27proteininH446cells
(j士s，万=5)
与对照组比较：一P<0．01
～P<0．01T25controlgroup
4讨论
癌症是全球范围内死亡率最高的疾病之一，在
寻找疗效好，副作用少的理想抗癌药物过程中，植物
来源的抗肿瘤药越来越受到人们的重视“]。葛根是
药食同源的山地植物，在我国长期作为食用和药用
植物 本研究采用人小细胞肺癌H446细胞株作为
代表细胞株，用葛根素进行体外抑瘤实验。结果表
明，葛根素对H446细胞具有增殖抑制作用，且此作
用呈现良好的剂量依赖关系。
肿瘤共有的生物学特性是失控性生长，其主要
分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增殖过多和／或
凋亡减少[5]。本研究通过流式细胞仪检测药物作用
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万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年lo月·1537·
后H446细胞周期的改变，发现细胞周期的阻断时
相发生变化，S期与G：期比例下降，G。期细胞不能
通过细胞周期检测点进入S期而发生Go／G。期阻
滞，阻断DNA合成，干扰人小细胞肺癌H446细胞
周期正常进行，细胞增殖活力下降，从而抑制H446
细胞的分裂和增殖。
细胞周期主要由细胞周期蛋白(cyclin)、细胞
周期蛋白依赖性激酶(cyclin—dependentkinase，
CDK)以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白
(cyclin—dependentkinaseinhibitors，CKI)所构成
的网络系统调节。CDK．与cyclinD，结合形成复合物
通过磷酸化激活相应底物，推动细胞周期前进Es]。
p27蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白
(CKI)家族的一个重要成员[7]，其通过与cyclinD。
竞争性结合CDK．以及抑制cyclinD，一CDK．复合物
的活性而发挥限制细胞周期进程的作用。cyclinD。
与p27分别是调节G。／S期检查点重要的正性和负
性调节因子。本研究中流式细胞仪测定结果显示，经
葛根素作用后，H446细胞中cyclinDl、CDK．蛋白
表达下降，而p27蛋白表达升高。以上结果提示，葛
根索抑制H446细胞生长是通过调节细胞周期蛋白
cyclinDhCDK．和p27之间的表达比例，使H446
细胞不能通过G。／S期检查点，从而阻滞细胞周期
进程来实现的。
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淫羊藿提取物对急性心肌缺血模型犬血气的影响
王景祥1，于静1，吕文伟2，祁功才3，陈霞2。
(1．吉林省柳河医院，吉林柳河135300}2．吉林大学白求恩医学院药理学教研室，吉林长春130021，
3．吉林大学中日联谊医院血管外科，吉林长春130031)
摘 要：目的 观察淫羊藿提取物对急性心肌缺血模型犬血气的影响。方法 将实验犬24只，随机分为4组(每组
6只)：模型组、阳性对照药地奥心血康胶囊组及淫羊藿提取物(生药52．0、104．0mg／kg)组。采用结扎麻醉开胸犬
左冠状动脉前降支制备急性心肌缺血模型，经十二指肠1次性给药。观察240min内对冠脉流量(CBF)动、静脉血
氧饱和度，动、静脉氧分压．心肌耗氧量．心肌氧摄取率的影响。结果淫羊藿提取物增加CBF、静脉血氧饱和度、静
脉氧分压，降低心肌氧摄取率。结论淫羊藿提取物对实验性心肌缺血犬的心肌有保护作用。
关键词：淫羊藿提取物l心肌缺血；血氧饱和度；氧分压；心肌氧摄取率
中围分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)10—1537—04
淫羊藿HerbaEpimedii为小檗科淫羊藿属植
物，始载于《神农本草经》。本品辛、甘、温，归肝、肾
经。具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效。淫羊藿提
取物中主要成分是淫羊藿苷。现代药理学研究表明，
淫羊藿提取物减少急性心肌缺血犬心肌缺血程度和
范围，缩小缺血心肌的梗死面积，降低血清中磷酸肌
酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性，降低血
清中游离脂肪酸、过氧化脂质的量，提高超氧化物歧
化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)活
性[1]，对异丙肾上腺素所致的大鼠急性心肌缺血有
保护作用‘21。为全面研究淫羊藿提取物抗心肌缺血
作用，本实验采用结扎犬左冠状动脉前降支造成的
心肌缺血模型，从氧代谢方面来探讨淫羊藿提取物
对犬急性心肌缺血的保护作用。
收稿日期：2008-01—18
作者简介：王景祥(1962一)．男．吉林省九台市人，主治医师，主要从事心功能检测工作．
*通讯作者胨曩Tel：(0431)85619799

万方数据
葛根素对人小细胞肺癌H446细胞周期和相关周期蛋白表达的
影响
作者： 李娟， 胡永华
作者单位： 北京大学医学部公共卫生学院,北京,100083
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(10)
被引用次数： 6次

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