全 文 ：第 44 卷第 4 期 华中师范大学学报(自然科学版) Vo l.44 No.4
2010年 12 月 JOURNAL OF HUAZHONG NORMAL UNIVERSITY(Nat.Sci.) Dec.2010
收稿日期:2010-06-30.
基金项目:国家自然科学基金项目(30960464);甘肃省教育厅研究生导师项目(0901-05);西北师范大学知识与科技创
新工程项目(NWNU-KJCXGC-03-65).
＊E-mail:liuguoan@nw nu.edu.cn.
文章编号:1000-1190(2010)04-0629-04
香茶菜属植物中的三萜化合物
对脂质过氧化和 DNA损伤的保护作用
刘国安＊ , 闵建平 , 张佳佳 , 颉耀强 , 丁 兰 , 杨 红
(西北师范大学 生命科学学院 ,兰州 730070)
摘 要:通过检测对 H2O 2 处理的人外周血单个核细胞的 DNA 损伤 、鼠肝微粒体脂质过氧化和
pBR322 DNA 氧化断裂的保护作用 , 测定了从香茶菜中提取到的 4 种三萜化合物的抗氧化活性.
结果表明 , 4 种化合物在这 3 种体系中发挥着不同的作用.熊果酸在所有体系中保护作用最强;2α,
3β-二羟基-乌苏-12-烯-28-酸在抑制脂质过氧化时活性强 , 而在抑制单链 DNA 断裂中作用较弱;其
异构体 2α, 3α-二羟基-乌苏-12-烯-28-酸作用正好相反;齐墩果酸仅在在 H2O 2 处理的单个核细胞
层 DNA 损伤中具有微弱保护作用.
关键词:三萜化合物;香茶菜;抗氧化活性;彗星电泳;脂质过氧化;DNA 链断裂
中图分类号:Q946 文献标识码:A
唇形科植物香茶菜(labiatae isodon)在世界范
围 ,尤其在中国 、日本和韩国种植广泛.其中许多种
类在中国是很重要的中草药材 ,被用来作为抗炎 、
抗肿瘤 、清热解毒和治疗无明肿痛的药物[ 1] ,但目
前对这些植物药理学的研究还非常有限.
抗癌和抗炎症的机制与抗氧化作用密切相
关[ 2-3] .因此 ,具有抗氧化性的化合物有望成为抗
肿瘤和抗炎症的候选药物.单细胞凝胶电泳也称彗
星电泳技术 ,近些年被广泛应用并得到不断发展.
被广泛用于检测具有潜在抗氧化作用的物质[ 4] .微
粒体 ,尤其是来自光面内质网的部分 ,因含有大量
的多不饱和脂肪酸而易受氧化胁迫的影响 ,已被广
泛作为氧胁迫和抗氧化研究的一种模型.三萜化合
物是香茶菜属植物(Isodon)中的主要次生代谢物 ,
本文中的 4种三萜化合物是从总序香茶菜(Isodon
racemosa (Hemsl)Hara)和兰萼香茶菜(Isodon
japonica (Burm.f).Hara var.galaucocaly x
(maxin)Hara.)中分离提纯 ,经 IR , UV , MS 和
NMR等多种波普技术并结合标样对照鉴定了它
们的结构[ 5-6] .本文检测了它们对经 H 2O 2处理的
人外周血单个核细胞中 DNA 损伤的保护作用 、抑
制小鼠肝微粒体中由 Fe2 +/VC启动的脂质过氧化
作用 ,以及对 AAPH 诱导的质粒 DNA 氧化断裂
的保护作用.
1 材料与方法
1.1 受试化合物与试剂
4 种分离自香茶菜的三萜化合物为熊果酸
(Urso lic acid , UA)、2α, 3β-二羟基-乌苏-12-烯-28-
酸 (2α, 3β , dihydro xy-urs-12-en-28-oid acid ,
HU 1)、2α,3α-二羟基-乌苏-12-烯-28-酸(2α, 3α, di-
hydro xy-urs-12-en-28-oid acid , HU 2)和齐墩果酸
(Oleanolic acid ,OA).结构见图 1.
AAPH(2 , 2-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐)、
琼脂糖 、溴化乙锭 、抗坏血酸和芦丁均购自 Sig-
ma ,质粒 pBR322 购自 SABC ,其他试剂均为国产
分析纯.
1.2 对由 H2O2 处理的单个核细胞 DNA氧化损伤
的保护作用
将新鲜分离的健康人外周单个核细胞分别与
不同浓度的 4 种三萜化合物进行孵育 , 以
50 μmo l/L H 2O 2于 4℃处理 10 min ,通过单细胞
凝胶电泳检测单个核细胞中的 DNA 损伤[ 7]. 细胞
DNA 损伤时因其 DNA 断裂 ,电泳时从核中迁出 ,
华中师范大学学报(自然科学版) 第 44 卷
图 1 从香茶菜属(Labiatae I sodon)植物中分
离提取的 4 种三萜化合物的结构
Fig.1 Structure o f seven t riterpenoids from
Labiatae Isodon
呈彗星状 ,无损伤的细胞 DNA 呈圆形.统计彗星
状细胞所占的百分率 ,可反映 DNA损伤的程度.
1.3 脂质过氧化的测定
微粒体的制备参照文献[ 8] .Wistar小鼠饥饿
过夜后 ,断颈处死并立即取出肝脏 ,匀浆经两次离
心后得微粒体.Low ry 法测定蛋白质浓度.
将小鼠微粒体和不同浓度三萜化合物加入
Fe2+/VC 启动的脂质过氧化反应体系.37℃振荡
孵育 1 h后 ,三氯醋酸终止反应 ,加入硫代巴比妥
酸显色测定脂质过氧化产物丙二醛 ,上清液于
532 nm比色.计算不同化合物的半抑制浓度
(IC50).
1.4 测定单链 DNA 氧化断裂
质粒 pBR322DNA 主要以超螺旋型存在 ,当
受到氧化损伤断链时 , DNA 会先打开一条核酸链
而解为环状 ,当损伤进一步加强时 ,第二条核酸链
也会被打开而呈线型.实验时将100 ng 的 pBR322
质粒 DNA和化合物与 10 μmo l/L 自由基引发剂
AAPH 混匀 , 37℃孵育 1 h.然后将样品进行琼脂
糖凝胶电泳后 ,用 EB 染色 ,于凝胶成像分析系统
中观察照相.
1.5 统计数据
实验重复 3次 ,数据以均值±SD表达.
2 结果与分析
2.1 对单个核细胞中 H2O2 处理的 DNA氧化损伤
的保护作用
如图 2所示 ,细胞经 H2O 2 处理后 ,DNA 损伤
的细胞呈彗星状.未处理细胞只有 9.6%呈彗星
状 ,此为单个核细胞的基础 DNA 损伤.当用
50 μmol/L H 2O 2处理细胞 10 min后 ,有 96.9%的
细胞呈彗星状.槲皮素(quercet in , Q)是实验室经
图 2 单细胞凝胶电泳图细胞
DNA 损伤(有尾)和无损伤(圆形)(×400)
Fig.2 Cells image af te r single cell micro g el
electropho resis.Cells w ith(a long tail)and
without(circular)damaged DNA
常使用的抗氧化剂.实验中作参照.
图 3 三萜化合物对 H2O2 诱导的人外周血
单个核细胞损伤的保护作用
Fig.3 P ro tection of t riterpenoids from H2O 2-induced
DNA damage in human pe riphe ral blood
mononuclear cells(PBMCs)
＊＊＊P≤ 0.001 vs Con , ■P≤0.05 , ■■P≤0.01 ,
■■■P≤0.001 vs H 2O 2
4种化合物的作用从图 3 可看出 , 它们对
H 2O 2 处理的 DNA 氧化损伤具有不同的保护能
力 ,但作用都不强 ,均弱于槲皮素.OA与 UA 的作
用相近 , HU 1和 H U 2的作用相近.
2.2 对脂质过氧化的抑制作用
4种三萜化合物对小鼠肝微粒体的脂质过氧
化均具有抑制作用 ,且存在浓度依赖性.如表 1
中显示.其中 UA 的抑制作用最强 , 程度与槲皮
素相当;HU 1 的抗氧化活性明显强于 HU 2 ,且差
异较大(IC50 HU 1 =33.1 μmo l/L , IC50 HU 2 =
103.9 μmol/L);而 OA 的活性很弱.UA与 OA 的
结构相似 ,仅因 CH3 位置不同 , UA 的抑制作用就
远高于 OA ,比后者高 20倍.4 种三萜化合物对脂
质过氧化的抑制作用的顺序如下:UA > HU 1 >
OA >H U 2 .
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第 4期 刘国安等:香茶菜属植物中的三萜化合物对脂质过氧化和 DNA 损伤的保护作用
表 1 三萜化合物对脂质过氧化的半抑制浓度
Table 1.Ha lf inhibition concentra tion(IC50)
of t riterpenoids on lipid pero xidation
化合物 半抑制浓度 IC50/(μmol/ L)
槲皮素 5.2±0.3
熊果酸(UA) 4.1±1.2
二羟基熊果酸1(HU 1) 33.1±2.5
二羟基熊果酸2(HU 2) 103.9±0.4
齐墩果酸(OA) 90.0±12.9
M eans±SD , N=3
2.3 对链状 DNA氧化断裂的保护作用
为了进一步阐明三萜化合物的抗氧化作用 ,采
用质粒 pBR322 DN A ,由 AAPH 诱导断裂 ,检测
化合物对无细胞体系 DNA 的保护作用.见图 4.
图 4 三萜化合物对 AAPH 引起的 pBR322DNA
断裂的保护作用
Fig.4 Effects o f triterpeno ids on pBR322 DNA
strand break induced by 10mmo l/ L AAPH
1.UA 和 OA 对 DNA 损伤的保护作用.
A:pBR322 DNA.B:10 mmo l/ L AAPH.
C-F:12.5 、 25、 50 、 100 μmol/ L UA;
G-I:500 、1 000、 2 000 μmo l/ L OA.
2.HU 1和 HU 2 对 DNA 损伤的保护作用.
A:pBR322 DNA;B:10 mmo l/ L AAPH;
C-G:100 、200、 400、 800、1 600 μmo l/ L H U1 ;
H-L:100 、200 、400、800、1 600 μmol/ L H U2 .
从图 4(1)中可以清楚地看出 , 4 种化合物对
DNA氧化损伤都有一定的保护作用 ,并具浓度依
赖性.UA 作用较强 ,从 25 μmol/L 起就表现出保
护能力(1 , D), 100 μmo l/L 时可完全保护 DNA
损伤(1 , F),表现为超螺旋型 pBR322 质粒 DNA
的条带和未处理样(1 , A)相同.而 OA 的作用很
弱 , 在 2 000 μmol/L 时仍只有微弱的保护效果
(1 , I).在图 4(2)中 ,二种二羟基熊果酸也显示较
强的作用 , 且 HU 2 的作用强于 HU 1 .HU1 在
200μmol mol/L(2 ,D)时有明显的作用 ,1 600μmol/L
时完全保护(2 ,G);而 HU 2 在 400 μmol/ L 时就有
了完全的保护作用(2 , J),但 HU 1 与 HU 2 保护能
力比 UA弱.因此 ,对 DNA氧化损伤的保护能力 ,
由强到弱为 UA>HU 2 >HU 1 >OA.
3 讨论
人体的氧化胁迫状态与炎症 、癌症 、自身免疫
疾病 、糖尿病 、各种心脑血管疾病 、老年性痴呆等有
关.炎症过程涉及激活吞噬细胞合成和释放大量的
活性氧 ,从而导致组织和细胞损伤[ 9] .提高具有抗
氧化能力物质的摄入可能预防和降低炎症的发生.
因此 ,很多实验都在探讨抗氧化剂作为治疗相关疾
病药物的可能性[ 10] .癌变过程是多步骤的复杂过
程 ,但与氧化胁迫和炎症造成的损伤密切相关[ 11] .
因此具有抗氧化和抗炎作用的化合物就有可能作
为抗肿瘤药物.
植物中广泛存在三萜化合物.常见三萜化合物
UA 和 OA 最重要的生物活性是保肝[ 12] ,近些年
有些研究报告了三萜类化合物的各种生物活
性[ 13-14] ,但有关来自香茶菜的三萜化合物抗氧化
作用方面的研究未见报道.彗星电泳可用来检测检
H 2O 2 诱导的细胞 DNA 损伤及化合物的保护作
用[ 7] .在脂质过氧化体系中 ,自由基攻击多不饱和
脂肪酸 ,形成各种细胞毒醛类物质.多种病理 、生理
过程涉及到脂质过氧化.AAPH 在 37℃能产生自
由基造成 DNA链断裂等生物大分子损伤.
通过对 4 种三萜化合物在以上 3 个体系中抗
氧化作用的检测可以看出:UA在 3个体系中均具
有最强的保护作用;而其异构体 OA仅能减轻单核
细胞中 H 2O 2 诱导的 DNA 氧化损伤 ,在脂质过氧
化和 pBR322质粒 DNA 氧化损伤中保护作用都非
常弱;比 UA 多了一个羟基的 HU 1 和 HU 2 在 3
个体系中作用差异较大 ,对细胞的 DNA 氧化损伤
二者只有微弱作用 ,在脂质过氧化中 , HU 1 的作用
远比 HU 2 强 ,约高 2倍 ,而在对无细胞 DNA 氧化
体系中 ,作用正好相反.
UA 是在这三种测试体系中最有效的抗氧化
剂.特别是在抑制脂质过氧化中 ,比其它化合物强
5倍多.UA 包含一个羟自由基而 HU 有两个 ,这
意味着三萜化合物中仅是羟基的数目不能决定在
这些条件下的抗氧化强度.这与其他抗氧化剂不
同 ,如黄酮类化合物.但是 ,羟自由基确实是官能
团.如果-OH 被乙酰基(AcO 型)替换 ,抗氧化作
用明显减弱(数据未显示).H U1和 HU 2有相同的
结构骨架 ,只是第三位-OH 的构型不同(见图 1).
在脂质过氧化体系中 , HU 1显示很强的抑制活性
(IC50 =33.1), HU 2 却很弱 (IC50 =103.9);而在
DNA 氧化损伤的保护中正好相反 ,这意味着 OH-
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华中师范大学学报(自然科学版) 第 44 卷
的位置是很重要的 ,其变化的构型在不同的体系中
发挥着不同的作用.UA 和 OA 唯一不同的是 29-
CH3 .UA 中位于 19-C ,而在 OA 中位于 20-C.在
脂质过氧化和 DNA 链断裂体系 UA 是最有效的
化合物 , 然而 OA 是最弱的.所以-CH3 ,这个从未
报道过有抗氧化作用的集团 ,其三维位置对其活性
也有非常重要的影响.
本文结果显示 ,三萜化合物的抗氧化作用机制
复杂 ,羟基及-CH3 的位置和数目都可能会影响其
对 DNA 损伤的保护和抑制脂质过氧化的作用 ,因
此三萜化合物的抗氧化机制仍需更深入的研究.
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Inhibitions of lipid peroxidation and protection of DNA damage
by triterpenoids from labiatae Isodon
LIU Guoan , M IN Jianping , ZHANG Jiajia , XIE Yaoqiang , DING Lan , YANG Hong
(Colleg e of L ife Science , Nor thw est No rmal Univer sity , Lanzhou , 730070)
Abstract:T he antio xidative effects of seven tri terpenoids separated from labiatae Isodon
w ere examined by testing thei r pro tection against DNA damage in human peripheral
blood mononuclear cells induced by H 2O 2 , inhibition of lipid peroxidation and DNA
strand breakage.These triterpenoids exerted variably protect ive ef fects in these sys-
tems.Urso lic acid has the st rongest pro tective effects in all three sy stems.2α, 3β , di-
hydroxy-ur s-12-en-28-oid acid are ef fective in inhibiting lipid pero xidat ian but weak in
pro tection DNA strand breakage.Its isomer 2α, 3α,23-t rihydroxy-urs-12-en-28-oic-acid
showed opposi te actions.Oleanolic acid is only effect ive in DNA damage induced by
H2O 2 in sing le cell.The relationship between ant ioxidations and st ructures are also dis-
cussed.
Key words:Triterpenoid;labiatae isodon;ant ioxdation;comet assay;lipid peroxida-
t ion;DNA strand breakage
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