全 文 ：松节藻醇提物对正常小鼠抗氧化活性的影响
史大永1 ,贺 　娟2 ,许 　凤2 ,袁兆慧1 ,韩丽君1
①
范 　晓1
(11 中国科学院海洋研究所 ,山东 青岛 　266071 ; 21 青岛大学医学院附属医院 ,山东 青岛 　266003)
摘　要 :目的 　研究松节藻醇提物对正常小鼠抗氧化活性的影响。方法 　通过单细胞微凝胶电泳法检测松节藻醇
提物对 H2 O2诱导的正常小鼠淋巴细胞 DNA 损伤的防护作用 ,分别采用黄嘌呤氧化酶法、D TNB 直接法、TBA 硫
代巴比妥酸法检测小鼠血清中的超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 ( GSH2Px) 活性和丙二醛 (MDA)
的量。结果 　松节藻醇提物对 H2 O2诱导的正常小鼠淋巴细胞 DNA 损伤具有一定的防护作用 ,并且能升高小鼠
血清中 SOD 和 GSH2Px 活性 ,降低 MDA 的量。结论 　松节藻醇提物具有一定的抗氧化活性。
关键词 :松节藻 ; 抗氧化 ; 彗星电泳
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0120097203
　　松节藻 R hodomel a con f ervoi des ( Huds. )
Silva 广泛分布于中国、日本、朝鲜半岛及大西洋北
岸 ,化学成分研究发现其中富含溴酚类化合物[1 ,2 ] ,
但是对该种海藻的药理活性研究很少有报道[3 ] 。笔
者在一些药理模型上对松节藻醇提物的抗氧化活性
进行了研究 ,结果显示其不但具有保护 H2 O2 诱导
的正常小鼠淋巴细胞 DNA 损伤的活性 ,而且可增
强血清中超氧化物歧化酶 ( SOD) 和谷胱甘肽过氧
化物酶 ( GSH2Px) 的活性 ,同时能够抑制血清中脂
质过氧化产物丙二醛 ( MDA) 的生成 ,表明松节藻
醇提物具有一定的抗氧化作用。
1 　材料
111 　试剂与仪器 : RPMI21640 培养液 ( Gibico 公
司) ;小牛血清 ( Gibico 公司) ;正常熔点琼脂糖和低
熔点琼脂糖 (10 g/ L 分别溶于 PBS) ;淋巴细胞分
离液 (爱普生物技术公司) ,磷酸缓冲液 ( PBS ,p H
7. 4) ; 溶 解 液 ( 0103 mol/ L NaO H , 1 mol/ L
NaCl) ;解旋液 [ 2. 5 mol/ L NaCl , 100 mmol/ L
Na2 ED TA , 10 mmol/ L Tris (Amresco 公司) ,临用
前加 10 % DMSO , 1 % Triton2100 ] ; 电泳液 [ 40
mmol/ L Tris (Amresco 公司) ,5 mmol/ L ED TA ,
20 mmol/ L 醋酸 , p H 8. 3 ] ;中和液 (014 mol/ L
Tris2HCl ,p H = 7. 5) ; 250μg/ L EB 溶液 ;300 g/ L
H2 O2溶液 ;荧光剂 DA PI (Boehringer Mannheim
公司) ;超氧化物歧化酶 ( SOD) 试剂盒、谷胱甘肽
过氧化物酶 ( GSH2Px) 试剂盒、丙二醛 (MDA) 试
剂盒 (南京建成生物工程所) 。除标明外 ,其余试剂
均为国产 AR 级 (上海化学试剂厂) 。Sigma 3 K30
型低温离心机 ; 721 分光光度计 (上海分析仪器
厂) ;D YY—Ⅲ型电泳仪 (北京六一厂) ; IM20 K 型
制冰机 ;Olympas B H —2 型荧光显微镜 (10 ×40) 。
112 　药 物 : 松 节 藻 R hodomel a con f ervoi des
( Huds) Silva ,2003 年 4 月采于山东青岛市太平角
海湾 ,由中国科学院海洋研究所邵魁双博士鉴定 ,标
本现存于中国科学院海洋研究所海藻化学研究室 ,
标本号为 2003048。
113 　动物 :青岛市实验动物中心提供纯种昆明小鼠
40 只 ,雌雄各半 ,体质量 18～23 g。
2 　方法
211 　松节藻醇提物的制备 :风干松节藻样品约
5 kg ,粉碎 ; 95 % 乙醇室温提取 3 次 ,合并得浸膏
325 g ;用约 10 倍量的水混悬浸膏 ,醋酸乙酯萃取 ;
减压蒸干得棕黑色稠膏 105 g ,经 H PL C 法测定松
节藻醇提物中含总酚 2154 %。
212 　动物分组及给药 :昆明小鼠 40 只随机分为 4
组 ,每组 10 只 ,雌雄各半。药物组 : ig 松节藻醇提
物色拉油稀释液 ,剂量分别为 25、50、100 mg/ kg ,每
日 ig 1 次 ,连续 20 d ;对照组 :ig 等量大豆色拉油 ,
每日 1 次 ;隔日称体质量 ,观察小鼠生长情况。
213 　血样采集 :末次给药 24 h 后 ,将小鼠称质量 ,
眼眶取血于含 1 mL 肝素的玻璃试管 ,混匀 ,3 000
r/ min 离心 10 min ;收集上层无溶血血浆于 EP 管
中 , - 20 ℃冰箱贮藏备用。
214 　H2 O2 诱导的淋巴细胞 DNA 损伤防护作用
·79·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
①收稿日期 :2008204205
基金项目 :国家 863 基金项目 (2007AA09Z410 ; 2007AA091604)
作者简介 :史大永 (1977 —) ,男 ,博士 ,研究方向为海洋天然产物。Tel : (0532) 82898719
Fax : (0532) 82898641 　E2mail : shidayong @ms. qdio . ac. cn3 通讯作者　韩丽君　Tel : (0532) 82898702 　Fax : (0532) 82898641 　E2mail : ljhan @ms. qdio . ac. cn
检测[ 4 ,5 ]
21411 　淋巴细胞制备 :取各组抗凝血样 35μL 加
入到盛有 1 mL RPMI21640 和 10 % 小牛血清混合
液的离心管中 ,0 ℃冰浴培养 30 min ;加入淋巴细
胞分离液 100μL ,4 ℃、3 000 r/ min 离心 3 min ,取
粉红色淋巴细胞层移入磷酸缓冲液中 ,得到淋巴细
胞悬液 210 ×106～410 ×106 个/ mL ;台盼蓝染色计
数 ,成活率应大于 90 %。
21412 　单细胞微凝胶彗星电泳 :采用“彗星”电泳法
(SCGE) ,该方法是较敏感的 DNA 断裂损伤分析技
术[6 ] ,采用改良的 SCGE[7 ] ,将淋巴细胞悬液中加入
不同浓度 (5、10、20μmol/ L) 的 H2 O2处理 5 min ,
离心弃上清 ,用 PBS 洗 2 次 ,终止反应。取 85μL
1 % 正常熔点琼脂糖凝胶铺第一层凝胶 ,取 85μL
含约 1 ×104 ～1 ×105 个细胞的 015 % 低熔点琼脂
糖凝胶铺第二层凝胶。将凝固好的微凝胶玻片浸入
溶解液中约 1 h 取出 ,蒸馏水冲净。再浸入 p H 为
10 的解旋液中约 60 min 后取出 ,蒸馏水冲净 ;呈水
平状浸入电泳槽中 ,电泳液平面高于玻片 3～ 5
mm ;18 V 条件下电泳 30 min 后取出 ,蒸馏水冲净 ;
水平放置 ,将 EB 液滴在玻片上染色 10 min ,电泳完
毕后 ,将载有琼脂薄板的玻片放入中和液中中和 3
次 ,每次 5 min ,然后用 1μg/ mL 的 DA PI 20μL 染
色 20 min ,避光 ,以上操作均在 4 ℃下进行 ,在荧光
显微镜下观察。
215 　血清 SOD 活性测定 : 黄嘌呤氧化酶法测
定[8 ] ,测定波长 550 nm。
216 　血清 GSH2Px 活性测定 : D TNB 直接法测
定[9 ] ,测定波长 412 nm。
217 　血清 MDA 测定 :硫代巴比妥酸 ( TBA) 法测
定[10 ] ,测定波长 532 nm。
218 　统计学处理 :采用 SPSS 1115 软件对数据进
行统计分析 ,组间进行单因素方差分析。
3 　结果
311 　对 H2 O2诱导的淋巴细胞 DNA 损伤的防护作
用 :根据彗星的尾部与头部的比率大小将 DNA 损
伤分为 0～4 级损伤 ,共 5 个等级 ,见图 1。本实验
采用的专用单位 (AU) 是一种衡量 DNA 链断裂损
伤程度的特有单位 ,每种处理观察 100 个细胞 ,计
算其损伤单位。DNA 损伤作用 (AU) =ΣnI ,其中 I
为淋巴细胞 DNA 损伤级别 ,n 为 DNA 损伤级别为
I 的淋巴细胞个数。结果表明 ,松节藻醇提物低剂
量组在 H2 O2 浓度分别为 0、5、10μmol/ L 时 ,中剂
量组在 H2 O2浓度分别为 0、5、20μmol/ L 时对淋巴
细胞 DNA 损伤有一定的防护作用 ,其中当 H2 O2浓
度为 5μmol/ L 时中剂量组与对照组比较差异显著
( P < 0105) ,结果见表 1。
31 2 　对血清中 SOD 、GSH2Px活性及MDA的影
图 1 　彗星电泳不同级别淋巴细胞 DNA 损伤
Fig. 1 　Comet electrophoregram2different grades DNA damage in lymphocyte
表 1 　松节藻醇提物对 H2 O2诱导的正常小鼠淋巴细胞
DNA 损伤的防护作用 ( x ±s , n = 10 , AU值)
Table 1 　Protection of ethanol extract from R. conf ervoides
against DNA damage induced by H2 O2 in lympho2
cyte of normal mice ( x ±s , n = 10 , AU value)
组别
剂量/
(mg ·kg - 1 )
H2 O2 / (μmol ·L - 1 )
0 5 10 20
对照 　- 13614 ±3518 30015 ±4819 30617 ±3618 36215 ±2518
松节藻醇提物 　25 10816 ±2812 28015 ±3716 27617 ±1816 37415 ±1511
50 12910 ±3412 17218 ±3512 3 29812 ±4314 32816 ±2115
100 15814 ±3113 30712 ±3511 34315 ±1215 34515 ± 718
　　与对照组比较 : 3 P < 0105
　　3 P < 01 05 vs cont rol group
响 :见表 2 ,结果表明 ,同对照组比较 ,低、中、高 3 个剂
量组均能显著升高血清中 SOD 及 GSH2Px 活性 ,降
低 MDA 水平 ,其中低、中剂量组作用较为显著。
4 　讨论
　　机体受到电离辐射、体内酶促或非酶促反应时
会产生自由基 ,自由基性质活泼 ,很容易与其他物质
反应生成新的自由基 ,因此反应往往以连锁方式进
行。活性氧自由基与多种疾病有关 ,可以与蛋白质、
脂肪、核酸发生反应 ,其中 DNA 是其攻击的重要靶
标[10 ] ,当作用于不饱和脂肪酶 ,则生成过氧化脂质 ,
影响细胞膜通透性。正常情况下 ,自由基会被体内
酶系 统 迅 速 清 除 , 这 类 酶 包 括 SOD、CA T、
GSH2Px。
　　本研究结果表明 ,松节藻醇提物可有效防护
·89· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
表 2 　松节藻醇提物对正常小鼠血清中 SOD、GSH2Px 活性
与 MDA 水平的影响 ( x ±s , n = 10)
Table 2 　Effect of ethanol extract from R. conf ervoides 　
on activities of SOD and GSH2Px , and level
of MDA in serum of normal mice ( x ±s , n = 10)
组别
剂量/
(mg ·kg - 1 )
SOD/
(U ·mL - 1 )
GSH2Px/
(U ·mL - 1 )
MDA/
(nmol ·mL - 1 )
对照 　- 178188 ± 5117 190119 ±17138 121520 ±11203
松节藻醇提物 　25 240118 ±22116 241105 ±16104 51027 ±11331 3
50 250150 ±16189 3 252108 ±17119 91583 ±11134
100 234175 ±18177 215162 ±24151 111686 ± 01895
　　与对照组比较 : 3 P < 0105
　　3 P < 01 05 vs cont rol group
H2 O2诱导的小鼠淋巴细胞 DNA 损伤 ,同时提高小
鼠体内的 SOD 和 GSH2Px 活性 ,降低血清中脂质
过氧化终产物 MDA 的量 ,减轻活性氧自由基对机
体的攻击 ,具有一定的抗氧化应用前景。
参考文献 :
[ 1 ] 　Fan X , Xu N J , Shi J G1 Bromophenols f rom t he red alga
Rhodomela confervoides [J ]1 J N at Prod , 2003 , 66 :
45524581
[ 2 ] 　Pederson Marianne1 Bromochlorophenols and a brominated
diphenylmet hane in red algae [J ]1 Phytochemist ry , 1978 , 17
(2) : 29122931
[ 3 ] 　史大永 , 韩丽君 , 贺　娟 , 等1 松节藻抗肿瘤活性 [J ]1 中草
药 , 2005 , 36 (2) : 22922331
[ 4 ] 　王小红 , 江　洪1 单细胞凝胶电泳技术的研究进展及其应用
[J ]1 国外医学 :临床生物化学与检验学分册 , 2001 , 22 (1) :
5271
[ 5 ] 　陈玮琳 , 何继亮1 快速敏感检测 DNA 断裂的方法2彗星实验
[J ]1 国外医学 : 卫生学分册 , 1998 , 5 (2) : 10121041
[ 6 ] 　马爱国 , 韩秀霞 , 刘四朝 , 等1 两种 DNA 断裂损伤检测方
法敏感性的比较 [J ]1 遗传 , 1997 , 19 (1) : 322341
[ 7 ] 　袁守军 , 韩　锐1 单细胞 DNA 损伤的微凝胶彗星电泳检测
法 [J ]1 中国药理学通报 , 1998 , 14 (1) : 862871
[ 8 ] 　李益新 , 方允中 1 超氧化物歧化酶活力测定的新方法2化学
发光法 [J ]1 生物化学与生物物理进展 , 1983 , 2 : 952971
[ 9 ] 　夏奕明 , 朱莲珍 , 江泉观1 用硫代巴妥酸法测定脂质过氧化
物条件的探讨 [J ]1 铁道劳动卫生通讯 , 1987 , 40 : 471
[ 10 ] 　Bagchi D , Garg A , Krohn R , et al . Protective effect s of
grape seed proant hocyanidins and selected antioxidant s a2
gainst TPA induced hepatic and brain lipid peroxidation and
DNA fragmentation , and peritoneal macrophage activation in
mice [J ]1 Gen Pharmacol , 1998 , 30 : 77127761
佛手挥发油对支气管哮喘小鼠外周血、肺泡灌洗液及肺组织中
嗜酸性粒细胞的影响
施长春1 ,王建英1 ,朱婉萍2 ,黄伟华2 ,施金俏1 ,薛洪燕1
①
(11 浙江省金华市人民医院 ,浙江 金华 　321000 ; 21 浙江省中医药研究院 ,浙江 杭州 　310009)
摘 　要 :目的 　观察支气管哮喘模型小鼠外周血、支气管肺泡灌洗液 (BAL F) 及肺组织中嗜酸性粒细胞 ( EOS) 的
改变以及佛手挥发油对以上指标的影响。方法 　C57小鼠以卵白蛋白 (OVA) 致敏造成哮喘模型 ,分为模型组 ,对
照药物组 ,佛手挥发油高、中、低 3 个剂量组 ,另外 10 只为健康对照组。分别检测各组小鼠外周血、BAL F 中 EOS
的水平并观察肺组织病理切片中 EOS 的浸润情况。结果 　模型组外周血、BAL F 与对照组比较 ,EOS 均明显增加
( P < 0101) ;肺组织病理切片显示支气管及血管周围大量 EOS 浸润。各佛手挥发油组与模型组相比外周血 BAL F
中 EOS 均有不同程度下降 ,高剂量组差异尤为显著 ( P < 0101) 。各组肺组织病理切片中 EOS 浸润较模型组减
少 ,剂量越大此作用越明显。结论 　佛手挥发油可抑制哮喘小鼠外周血、BAL F 中 EOS 水平 ,减少肺组织 EOS 浸
润 ,拮抗气道炎症而发挥平喘作用 ,作用强度与剂量有关。
关键词 :佛手挥发油 ; 哮喘 ; 外周血 ; 支气管肺泡灌洗液 (BAL F) ; 嗜酸性粒细胞 ( EOS)
中图分类号 :R286143 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0120099203
　　近年来 ,对支气管哮喘的研究取得了重大进展 ,
哮喘的本质是气道反应性增高为特点的慢性炎症疾
病 ,其治疗以抗炎平喘为主[1 ] 。佛手具有舒肝理气、
宽胸化痰等功效 ,在临床上普遍用于支气管炎和支
气管哮喘的治疗 ,具有较好的疗效。挥发油是佛手
所含的主要成分 ,佛手挥发油及醇提液具有抗炎、平
喘、祛痰等作用[2 ] 。本研究旨在利用 C57 小鼠哮喘
模型 ,观察佛手挥发油对致敏 C57小鼠外周血、肺泡
灌洗液 (BAL F) 及肺组织中嗜酸性粒细胞 ( EOS)
的影响 ,探讨佛手挥发油平喘的作用机制。
·99·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
①收稿日期 :2008206218
基金项目 :浙江省自然科学基金资助项目 (302759)