全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月 559
收稿 2010-03-01 修定 2010-04-06
资助 福建省农业科技重点项目(2009N0041)和泉州重点科技
项目(2 0 0 8N 4 0 )。
* 通讯作者(E-mail: zjy0054@yahoo.com.cn; Tel: 0595-
2 2 6 9 3 3 2 9 )。
蝴蝶兰EST-SSRs分析
张君毅 *, 陈瑞凤
华侨大学生物工程与技术系, 福建厦门 361021
提要: 对蝴蝶兰属EST序列进行了SSR分析。蝴蝶兰属EST总长为 4.5 Mb, 含有 609个SSR。SSR出现频率7.65%, 平均距
离 7.39 kb, 平均长度为22.17 bp。单碱基、二碱基和三碱基重复是主要重复类型, 分别占EST-SSR总数的21.67%、40.39%
和 33.50%。A、AG和CCG分别是单碱基、二碱基和三碱基重复中主导重复基元, 分别占 96.21%、58.54%和 32.25%。设
计引物及检测的结果表明, 蝴蝶兰EST-SSR标记对兰科其他属植物具有一定的通用性。
关键词: 蝴蝶兰; SSR; EST; 微卫星
EST-SSRs Analysis of Moth Orchids
ZHANG Jun-Yi*, CHEN Rui-Feng
Department of Bioengineering & Biotechnology, Huaqiao University, Xiamen, Fujian 361021, China
Abstract: Simple sequence repeats (SSRs) were investigated in expressed sequence tags (EST) of moth orchids.
The total length of moth orchids non-redundant ESTs was 4.5 Mb, including 609 SSRs. The frequency of EST-
SSRs was 7.65% and the mean distance was 7.39 kb. The mean length of SSRs was 22.17 bp. Mononucleotide,
dinucleotide and trinucleotide repeats were major types, whicn accounted for 21.67%, 40.39% and 33.50% in
all SSRs, respectively. A, AG and CCG were mainly frequent motifs in mononucleotide, dinucleotide and
trinucleotide, accounting for 96.21%, 58.54% and 32.25%, respectively. Primers were designed and detected.
The result showed that some of them could be transferable to other genera of orchid.
Key words: moth orchids; SSR; EST; microsatellite
蝴蝶兰属植物约 40种, 分布于热带亚洲至澳
大利亚, 具有较高的观赏价值和经济价值, 被誉为
洋兰 “皇后 ”。近 20年来, 中国内地的蝴蝶兰市场
需求旺盛, 促进了育种工作开展(乔永旭等 2008)。
然而兰科植物因在自然界杂交的缘故, 给属内种的
分类和整理带来了较大的困难, 给进一步杂交培育
新品种带来不便。
简单序列重复(simple sequence repeats, SSR)
标记以其共显性、高多态性、分布广泛性等优点
被广泛地应用于植物育种中(徐莉和赵桂仿2002)。
SSR应用的前提是引物开发。用数据库搜索的方
法开发 SSR相对于筛选基因组文库法、微卫星富
集法、省略筛库法等传统方法, 具有省时、省
力、低成本等优点(常玉梅等 2005), 尤其是从表达
序列标签(expressed sequence tags, EST)数据库中
搜索的 S SR 还具有通用性高的特点(H ol ton等
2002), 已经成为一种广为采用的方法(Cardle等
2000; Thiel等 2003)。本文通过分析NCBI数据库
中蝴蝶兰属植物的 EST等DNA序列, 挖掘简单重
复序列, 为蝴蝶兰属植物 SSR引物开发提供依据,
进而为蝴蝶兰属资源的遗传变异、品种鉴别、基
因标记及进化研究提供重要的信息。
材料与方法
1 EST的获得与处理
从NCBI数据库下载蝴蝶兰属植物EST序列,
数据截止到 2009年 8月 1日。采用 EST-trimmer
软件除去 3端 poly T或 poly A以及长度小于 100
bp的序列。对于长度大于 700 bp的 EST则保留
其 5端序列。通过软件 Phrap进行片段重叠群分
析和聚类以去除冗余序列。运用BLSAT_X程序对
处理过的数据进行同源性比较, 采用 Kofler 等
(2007)开发的 SciRoKo 3.1软件对聚类后的EST搜
植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月560
SSR, 搜索单碱基最少重复次数为 15次, 二碱基为
8次, 三碱基为 5次, 四碱基以上为 4次。
2 SSR引物设计
用 Primer 5.0软件对含有 SSR的 EST序列进
行引物设计, 尽量避免引物二级结构的出现。引物
设计主要参数为: 引物长 17~23 bp; 引物退火温度
50~60 ℃, 正向和反向引物退火温度之差在 5 ℃以
内; GC含量 40%~70%; PCR 预期产物长 100~300
bp。
3 引物筛选与通用性分析
用蝴蝶兰属(Phalaenopsis)的 ‘台林红天使 ’
(Phalaenopsis Tai Lin Redangel ‘V31’)等品种验证引
物的有效性。此外, 选择其他属内及属间种或杂交
种以检验引物在兰科植物的通用性, 包括 ‘国王 ’
(Dendrobium Red Emperor ‘Prince’)、‘伊丽莎白 ’
(Bulbophyllum Elizabeth Ann ‘Buckleberry’)、‘天
母 ’ (Cattleya Orglade’s Grand ‘TM’)、‘白仙女 ’
(Degarmoara Winter Wonderland ‘White Fairy’)、
‘小金鱼 ’(Rhyncattleanthe Ahchung Yoyo ‘Little
Goldfish’)、腋唇兰[Maxillariella tenuifolia (Lindl.)
M.A. Blanco & Carnevali]和万代兰(Vanda coerulea
Griff.)等 7种植物。采用王国鼎等(2007)的方法提
取所有材料的DNA。PCR扩增反应体系及参数参
考Huang等(2010)的报道。用 6%非变性聚丙烯酰
胺凝胶进行电泳和分离。
结果与讨论
1 EST-SSR的分布特点
通过检索从NCBI数据库中获得7 963条蝴蝶
兰属植物 EST序列, 分别来源于桃红蝴蝶兰(P.
equestris)花芽 5 604条和紫纹蝴蝶兰(P. violacea)
花芽2 359条。共有609条含有SSR, 出现频率7.65%,
略低于甜瓜的 8.16% (胡建斌等 2009)。SSR平均
距离为 7.39 kb, 与大豆(7.4 kb)基本相当(Cardle等
2000), 高于拟南芥(14.9 kb)、小麦(15.6 kb)、棉
花(20.0 kb)和番茄(11.1 kb)等作物(李永强等2004),
低于水稻3.4 kb (Cardle等2000)和大麦6.3 kb (Thiel
等 2003), 属于 SSR出现频率相对较高的植物, 说
明大规模开发 EST-SSR标记的可能性较大。两种
蝴蝶兰 ESR-SSR的分布情况列于表 1。从 SSR数
量上看, 桃红蝴蝶兰539个远高于紫纹蝴蝶兰的70
个。SSR的平均长度和出现频率, 前者显著大于后
者。
2 EST-SSR的基元类型与频率
基元统计时, 将所有可循环的及互补的序列归
为一种标准基元。从单碱基到六碱基重复共有 30
种基元(表 2)。单碱基基元以A为主, 共有 127个,
占单碱基SSR总数的96.21%; 在二碱基基元中AG
出现频率最高, 占该类SSR的58.54%; 在三碱基类
型中, 以 CCG为主, 占 32.35%。这与在玉米、水
稻和高粱等单子叶植物的结果基本一致(Kantety等
2002)。从四碱基到六碱基基元共有 16种, 占基元
类型总数的一半以上, 但各自出现频率都很低。
桃红蝴蝶兰以二碱基重复为主(224个), 占其
SSR总数的 41.6%, 其次是三碱基重复 168个, 占
31.1%; 紫纹蝴蝶兰则以三碱基重复为主(36个), 占
其SSR总数的51.4%, 其次是二碱基重复(22个), 占
31.4%。从总体上看, 在所有 EST-SSR中, 出现最
多是二碱基基元, 共有246个, 占总数的40.39%; 其
次是三碱基重复和单碱基重复, 分别占总数的
33.50%和 21.67%。由表 2可见, 蝴蝶兰属 EST-
SSR主要类型是AG、A、AT和 CCG四种, 合计
占总量的 71.92%。Dreisigacker等(2004)发现, 高
级基元SSR多态性普遍比低级基元低, 说明本研究
表 1 桃红蝴蝶兰和紫纹蝴蝶兰 EST-SSR分布
Table 1 Distribution of EST-SSRs in P. equestris and P. violacea
物种 数量 /条 EST总长 /bp SSR数量 平均长度 /bp 出现频率 */% 平均距离 **/kb
桃红蝴蝶兰 5 604 3.1×106 539 22.47 9.62 5.75
紫纹蝴蝶兰 2 359 1.4×106 7 0 11.58 2.97 20.00
共计 7 963 4.5×106 609 22.17 7.65 7.39
*出现频率 =检出的 SSR数目 /EST总数; **平均距离 =EST总长度 /SSR总数。
植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月 561
发掘的大部分 SSR具有高多态性潜能。
3 EST-SSR的重复次数与长度
SSR重复次数的变异引起位点长度的变化是
产生 SSR多态性的主要原因。一般认为, SSR位
点的变异频率与基元重复数存在一定的正相关,
即重复次数越多, SS R 产生变异的可能性越大
(Schlotterer 2000)。当 SSR基序长度大于或等于
20 bp时多态性较高(Temnykh等 2001)。蝴蝶兰单
碱基至三碱基类型 SSR重复次数变异较大(图 1),
分别为 SSR 15~69、8~42和 5~16次, 其基序长度
也较大, 平均长度分别为 18.90、26.89和 18.32
bp。总体 EST-SSR平均长度为 22.17 bp。由此
可见, 无论是重复次数还是基序长度都显示出所发
掘的SSR可能具有良好的变异性, 尤其是二碱基和
三碱基重复基元。
另外, 从图 1可以看出, 三碱基类型 SSR重复
4~16次, 随着重复次数增加其数量呈现下降的趋
势; 同样的趋势也出现在二碱基类型8~15次和单碱
基 15~24次中。对于违背这个趋势的 SSR需要特
别注意, 如二碱基类型15~24次重复以至25次及以
上重复序列, 往往产生较大变异, 是获得有效 SSR
的活跃位点。
表 2 兰花 EST-SSR基元类型与频率
Table 2 Motif of EST-SSRs in moth orchid and its frequency
SSR类型 标准基元 SSR数量 基元百分率 /% 频率 * 总百分率 /%
单碱基 A 127 96.21 28.22 21.67
C 5 3.79 1.11
二碱基 AT 101 41.05 22.44 40.39
AG 144 58.54 32.00
AC 1 0.41 0.22
三碱基 AAC 7 3.43 1.56 33.50
AAG 4 2 20.59 9.33
AAT 3 6 17.65 8.00
ACC 1 1 5.39 2.44
ACG 3 1.47 0.67
AGC 9 4.41 2.00
AGG 1 3 6.37 2.89
ATC 1 7 8.33 3.78
CCG 6 6 32.35 14.67
四碱基 AAAC 3 23.08 0.67 2.13
AAAT 7 53.85 1.56
AGCG 1 7.69 0.22
AGGG 1 7.69 0.22
ATAG 1 7.69 0.22
五碱基 AAAAT 1 33.33 0.22 0.49
AAACC 1 33.33 0.22
ACCCC 1 33.33 0.22
六碱基 AGCGGC 2 18.18 0.44 1.81
AGCAGG 1 9.09 0.22
AGAGGG 1 9.09 0.22
ACTCCC 1 9.09 0.22
ACCGCC 1 9.09 0.22
AATATT 1 9.09 0.22
AAGGAG 1 9.09 0.22
AAACCC 3 27.27 0.67
*SSR频率以每 1 Mb碱基出现 SSR的数量表示。
植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月562
图 1 不同基元长度的 SSR数量
Fig.1 The numbers of SSRs in different motif length
4 EST-SSR有效性验证
随机挑选 40条含有 SSR的 EST进行引物设
计。由于微卫星侧翼序列过短、GC含量偏高或
偏低等原因, 获得 28对引物。随机选择 8对引物
对 ‘台林红天使 ’等蝴蝶兰品种验证EST-SSR标记
的有效性。结果发现, 有 5对均有扩增产物, 产物
大小为 100~300 bp, 基本符合预期大小, 说明多态
性主要由 EST-SSR长度变化引起。每对引物能检
测到 2~3个等位基因, 平均每对引物能检测到 2.2
个等位基因。
进而以这5对引物对包括蝴蝶兰在内的8种兰
科不同属的植物进行 PCR扩增, 检测蝴蝶兰 EST-
SSR标记的通用性。图 2为引物Estssr4扩增带谱,
可见该引物并不适用于 ‘石豆兰 ’和腋唇兰。引物
Estssr1能够扩增除石斛属 ‘国王 ’和卷瓣兰属 ‘石
豆兰 ’外的其它 6种不同属的植物基因组DNA, 多
态性位点有 4个。引物 Estssr5能够扩增所有参试
材料, 但多态性位点只有 2个。有扩增产物的引物
序列、预期产物大小、退火温度和所检测到的等
位基因数见表 3。另外, 5对引物在万代兰中均得
到扩增产物, 说明蝴蝶兰EST-SSR标记在万代兰属
中的通用性较高。由于 EST-SSR可以直接标记遗
传性状, 具有开发成本低、物种间通用性高、EST
数目巨大等优点, 在一定程度上弥补了相对基因组
SSR标记多态性较低的不足。进行兰科唯一登录
EST的蝴蝶兰属植物EST-SSR的大规模开发, 必将
大大促进该科植物在资源分类、辅助育种、遗传
作图等方面的研究。
图 2 引物 Estssr4扩增带谱
Fig.2 PCR amplification pattern generated
by primer pair Estssr4
1: ‘白仙女 ’; 2: ‘伊丽莎白 ’; 3: ‘天母 ’; 4: ‘国王 ’; 5: ‘台林
红天使 ’; 6: ‘小金鱼 ’; 7: 腋唇兰; 8: 万代兰; M: DL2000 marker。
植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月 563
表 3 有扩增产物的 EST-SSR引物
Table 3 The primer pairs produced amplified products
引物编号 重复基元 引物序列(5→ 3) Tm/℃ 多态位点 * 预期产物大小 /bp EST来源
Estssr1 (TC)10
CTTGTTATTTCCCTCCTCG
CCTTTAGCCCAAGTTCAGT
5 5 4(6) 151 CB033577.1
Estssr2 (CCG)6
GAGCCAGAAGTAGAACCAGC
TTCGGTCTTAGTCTCCTCAAT
5 0 3(3) 237 CB034804.1
Estssr3 (CTT)6
CCTTTCCCTCATACCATCC
CTCTGCTTCCCACCATCAA
5 6 2(3) 233 CB031932.1
Estssr4 (GGC)7
TTTCCCTCCCAAAGACCCT
TCAAGCCCACATCCCATTC
5 6 2(6) 242 CB034028.1
Estssr5 (AGAAGG)5
ATGGGAAAGGCAAGCAAGT
CAATCTCGGACTCAAACAAC
5 5 2(8) 253 CB032583.1
*括号中数字为参试 8 种植物中有扩增产物的种类数。
参考文献
常玉梅, 李绍戊, 梁利群, 孙效文(2005). 微卫星标记的制备策略.
中国生物工程杂志, S1: 210~214
胡建斌, 刘颖, 王兰菊, 李建吾(2009). 甜瓜 EST序列中微卫星的
分布特征. 植物生理学通讯, 45 (3): 258~262
李永强, 李宏伟, 高丽锋, 何蓓如(2004). 基于表达序列标签的微
卫星标记(EST-SSRs)研究进展. 植物遗传资源学报, 5 (1):
91~95
乔永旭, 张永平, 王桂兰, 陈超, 王燕(2008). 蝴蝶兰原生质体提取
方法的优化. 植物生理学通讯, 44 (6): 1177~1180
王国鼎, 文晓鹏, 季祥彪, 乔光, 胡鹏(2007). 11种兰属植物DNA
的提取及 RAPD-PCR实验体系的建立与优化. 种子, 26 (3):
24~27
徐莉, 赵桂仿(2002). 微卫星 DNA标记技术及其在遗传多样性
研究中的应用. 西北植物学报, 22 (3): 714~722
Cardle L, Ramsay L, Milbourne D, Macaulay M, Marshal D, Waugh
R (2000). Computational and experimental characterization
of physically clustered simple sequence repeats in plants.
Genetics, 156: 847~854
Dreisigacker S, Zhang P, Warburton ML, Van Ginkel M, Hoisington
D, Bohn M, Melchinger AE (2004). SSR and pedigree analyses
of genetic diversity among CIMMYT wheat lines targeted
to different megaenvironments. Crop Sci, 44 (2): 381~388
Holton TA, Christopher J, McClure L, Harker N, Henry RJ (2002).
Identification and mapping of polymorphic SSR markers
from expressed gene sequences of barley and wheat. Mol
Breed, 9: 63~71
Huang Y, Li F, Chen KS (2010). Analysis of diversity and rela-
tionships among Chinese orchid cultivars using EST-SSR
markers. Biochem Syst Ecol, 38 (1): 93~102
Kantety RV, La Rota M, Matthews DE, Sorrells ME (2002). Data
mining for simple sequence repeats in expressed sequence
tags from barley, maize, rice, sorghum and wheat. Plant Mol
Biol, 48: 501~510
Kofler R, Schlottere C, Lelley T (2007). SciRoKo: a new tool for
whole genome microsatelli te search and investigation.
Bioinformatics, 23: 1683~1685
Schlotterer C (2000). Evolutionary dynamics of microsatellite
DNA. Chromosoma, 109: 365~371
Temnykh S, DeClerck G, Lukashova A, Lipovich L, Cartinhour
S, McCouch S (2001). Computational and experimental
analysis of microsatellites in rice (Oryza sativa L.): frequency,
length variation, transposon associations, and genetic marker
potential. Genome Res, 11: 1441~1452
Thiel T, Michalek W, Varshney RK, Graner A (2003). Exploiting
EST database for the development and characterization of
genderived SSR markers in barley (Hordeum vulgare L.).
Theor Appl Genet, 106: 411~422