全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (5): 659–668　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0628 659
收稿 2015-12-23　　修定 2016-04-27
资助 国家自然科学基金项目(31372050)和山东省现代农业产业
技术体系水果产业创新团队-栽培与设施装备(SDAIT-03-
022-05)。
* 共同通讯作者(E-mail: lilingsdau@163.com; dsgao@sdau.edu.cn)。
桃CYP707A家族基因的克隆以及表达分析
王东岭, 杜培勇, 郇蕾, 肖伟, 陈修德, 李玲*, 高东升*
山东农业大学园艺科学与工程学院, 作物生物学国家重点实验室, 山东省果蔬优质高效生产协同创新中心, 山东泰安271018
摘要: 从油桃‘中油四号’中克隆了3个CYP707A家族成员(PpCYP707A1、PpCYP707A2和PpCYP707A3)的全长, 测序发现其
CDS序列与桃基因组公布的序列一致。同源比对发现CYP707A家族在不同物种间具有高度的序列保守性, 并且都含有CY-
P707A家族基因比较保守的血红素铁配位体半胱氨酸残基; 系统进化树分析表明, PpCYP707A1与马铃薯CYP707A1、花生
CYP707A1、菜豆CYP707A1、菜豆CYP707A2的亲缘关系较近, 桃CYP707A2与拟南芥CYP707A2的亲缘关系较近, 桃CY-
P707A3与拟南芥CYP707A4、花生CYP707A2的亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明, PpCYP707A1在茎中的表达量较高,
PpCYP707A2在叶中的表达量较高, PpCYP707A3在花中的表达量较高, 并且桃CYP707A家族一般在成熟组织中的表达水平
要高于幼嫩组织。推测桃CYP707A家族成员交叉调控花芽休眠进程, 并且发现花芽中的PpCYP707A2可以被ABA和GA诱
导。原核诱导并纯化PpCYP707A1和PpCYP707A2蛋白可以为后续蛋白的功能鉴定奠定基础。
关键词: 桃; ABA8’羟化酶; CYP707A; 基因克隆; 表达分析; 花芽休眠; 原核表达
芽休眠是植物应对外界恶劣环境条件保护内
部幼嫩分生组织的一种生物学适应性(Horvath等
2003; Rohde和Bhalerao 2007)。自然条件下, 只有低
温累积满足植物需冷量, 芽才能正常萌发, 否则, 会
造成萌发不整齐、花器官发育畸形等一列不正常
的生命活动(谭钺等2012)。近年来, 随着设施果树
生产的快速发展, 休眠作为其主要限制因子之一越
来越被重视, 因此研究花芽休眠生理与分子机制,
找到调控芽休眠的关键调控网络或者关键限制性
因子对于设施果树的发展具有建设性意义。
脱落酸(ABA)是重要的植物激素, 调控植物多
种重要的生理和发育过程, 在应对环境胁迫做出
适应性的应答机制方面具有重要的作用(Zeevaart
和Creelman 1998)。ABA合成与分解代谢的动态
平衡共同调控植物内源ABA水平(Leng等2014), 在
休眠诱导以及休眠维持阶段, ABA的合成效率要
高于ABA的代谢活动, 但是在休眠解除阶段, ABA
的分解效率要高于ABA的合成效率。近些年, 通
过对多种植物突变体的研究, 大多数参与ABA合
成的基因已经被分离, 但调控ABA分解代谢的基
因以及关键酶研究较少(Nambara和Marion-Poll
2005)。ABA的失活主要有氧化失活和结合失活两
种方式(李茜茜和汪晓峰2009)。由ABA8’羟化酶
催化ABA 8’甲基发生羟化反应生成8’-羟基-ABA
(8’-OH-ABA)是ABA主要氧化失活的途径, 但是
8’-羟基-ABA不稳定, 容易自发异构化形成红花菜
豆酸(phaseic acid), 并最终形成二氢红花菜豆酸
(dihydro-phaseic acid) (Saito等2004)。ABA8’羟化
酶属于CYP450单加氧酶超家族, 并且把其编码的
基因命名为CYP707A (Krochko等1998)。在拟南芥
中, atcyp707a1-1和atcyp707a2-1突变体种子中的
ABA含量是分别是野生型的7和5倍, 并且在没有
层积的情况下严重降低了种子的萌芽率, 加深了
休眠的程度(Okamoto等2006), 但在AtCYP707A2的
过表达拟南芥的种子中, ABA含量较野生型拟南
芥降低了, 并且需要更短的后熟时间来打破种子
休眠(Millar等2006)。在大麦种子吸涨过程中, CY-
P707A基因(HvABA8’OH-1)在非休眠的种子中的
表达量要高于休眠的大麦种子, 尤其在胚根鞘中
的差别更为显著, 这说明HvABA8’OH-1参与休眠
解除的调控; 利用反义表达载体降低大麦中HvA-
BA8’OH-1的表达水平, 也使转基因种子中ABA含
量增加, 并且加深了休眠程度(Millar等2006; Gu-
bler等2008)。对于木本植物来说, 层积是打破种子
休眠的主要方法, Leida等(2012)通过离体培养实验
来研究桃胚在不同的层积时间段的内生变化机制
中发现, ABA在胚中的含量在层积1周以后显著降
低, 并且随着层积时间的延长, Ppa005020m (CY-
P707A类似基因)的相对表达水平逐渐升高。尽管
通过正向和反向转基因技术证明CYP707A是影响
种子休眠的关键调节基因, 但是还没有直接的证
植物生理学报660
据证明CYP707A参与花芽休眠调控。在使用单氰
胺(hydrogen cyanamide, HC)打破葡萄芽休眠的过
程中, HC能够导致ABA含量的降低, ABA代谢产
物(PA和DPA)的含量的增加, 并且诱导VvABA8’OH
的表达; 同时, 在葡萄芽自然休眠解除的过程中,
ABA含量逐渐降低并且伴随着VvA8H-CYP707A4
表达量的增加(Zheng等2015)。Leida等(2010)利用
抑制性差减杂交技术构建的差减文库中成功的发
现了桃中2个CYP707A类似基因参与了花芽休眠解
除的过程。
本研究中以油桃‘中油四号’ (Prunus persica var.
nectariana cv. Zhongyousihao)为研究材料, 通过基
因克隆获得桃中CYP707A家族类似基因Prupe.
5G013100、Prupe.6G072400和Prupe.8G125800,
并将其分别重新命名为PpCYP707A1、PpCYP707A2
和PpCYP707A3, 然后对其进行了生物信息学分析,
利用实时定量PCR技术检测对其在不同组织、花
芽休眠过程和花芽在不同的处理下的表达进行了
研究, 并通过原核诱导获得了重组蛋白, 旨在为进一
步深入研究ABA8’羟化酶蛋白的功能奠定基础。
材料与方法
1 试验材料与处理
试验于2014~2015年在山东农业大学作物生
物学国家重点实验室及山东省果树研究所(山东泰
安)进行, 选取七年生油桃‘中油四号’ (Prunus persica
var. nectariana cv. Zhongyousihao)嫁接苗为试材。
自2014年9月21日至2015年2月5日, 每隔15 d采取
一年生枝上的花芽以及树皮, 立刻用液氮速冻,
−80°C保存备用。用于CYP707A家族基因组织特
异性表达分析的植物组织(幼叶、幼花、成熟叶、
成熟花、根、茎、果实)从树上取样以后用液氮速
冻保存备用。
11月中旬, 随机采集一年生枝条90根, 首先插
入5%蔗糖溶液中预培养1 d (温度25°C, 光照强度
40 μmol·m-2·s -1, 昼/夜: 12 h/12 h, 相对空气湿度
80%), 然后分为三组, 分别用3种不同的试剂配制
的溶液喷施表面: (1)对照(CK), 清水+0.5% Trtion
100; (2)赤霉素处理(GA3), 1 mmol·L
-1 GA3+0.5%
Trtion 100; (3)脱落酸(ABA)处理, 1 mmol·L -1
ABA+0.5% Trtion 100, 分时间段取样, 用液氮冷冻
备用, 同时观测处理后花芽的萌芽情况。
2 桃花芽休眠期的界定
2014年9月21日~2015年2月5日, 每隔15 d从田
间取健壮新梢, 剪去叶片, 放入5%的蔗糖水溶液中
进行正常管理培养 , 温度为昼25°C, 光强为40
μmol·m-2·s -1, 昼/夜: 12 h/12 h, 相对空气湿度80%,
每2 d更换一次水, 并且将枝条基部剪掉1 cm左右,
培养25 d后调查10个枝条的萌芽率, 枝条若有50%
花芽萌发则视为休眠解除。
3 基因克隆与生物信息学分析
根据拟南芥CYP707A家族成员登陆的基因号,
在拟南芥基因组数据库(https://www.arabidopsis.
org/)中查得CYP707A家族成员的蛋白序列, 然后
比对桃基因组数据库(https://www.rosaceae.org/spe-
cies/prunus/prunus_persica)获得桃树中CYP707A类
似基因序列, 最后通过Pfam (http://pfam.xfam.org/)
网站进行保守结构域分析这些基因序列, 删除一
些不含CYP707A家族保守结构域的的基因, 最终在
桃树中确定3个CYP707A家族成员: Prupe.5G013100
(PpCYP707A1)、Prupe.6G072400 (PpCYP707A2)、
Prupe.8G125800 (PpCYP707A3)并根据在桃基因组
上查得的CYP707A家族成员序列设计引物进行基
因扩增(表1), 以从桃花芽反转录的cDNA作为模板
进行PCR扩增, PCR反应程序为94°C预变性7 min;
94°C变性30 s, 60°C退火30 s, 72°C延伸120 s, 30个
循环; 72°C延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖
凝胶进行电泳并回收目的条带, 连接到pMD18-T
载体中进行测序。
利用DNAMAN软件将桃树中的CYP707A家
族与其他高等植物的CYP707A家族成员进行多序
列比对; 利用MEGA 6.0, 采用neighbor-joining (NJ)
法构建系统发育树。在SWISS-MODEL网站(http://
swissmodel.expasy.org/)对桃中CYP707A家族成员
进行3D建模。
4 总RNA的提取和qRT-PCR
采用RN38-EASYspin Plus (艾德莱)提取样品
RNA, 利用反转录试剂盒PrimeScript™ RT Reagent
Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time, TaKaRa)反
转录获得cDNA。根据PpCYP707A1、PpCYP707A2
和PpCYP707A3的基因序列设计荧光定量特异性
引物(表1)。
王东岭等: 桃CYP707A家族基因的克隆以及表达分析 661
表1 实验所用引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称 引物序列(5′→3′)
PpCYP707A1-F ATGGAAATCAGCAGTATTTTATACTCC
PpCYP707A1-R TTATGTTTTAGGAGATAATCTGATGGGC
PpCYP707A2-F ATGCAACTTTTCTGCTCATCATTACTA
PpCYP707A2-R TCAACTCACAATCTTGCTCCTTG
PpCYP707A3-F ATGGAGATTGTTTCTAGTTTGATACACATATTG
PpCYP707A3-R TTATTCTTCCCAAAATCTGACTGGTAAT
PpCYP707A1-sybrF ACAGACCAACAGATTGCTGACAAC
PpCYP707A1-sybrR CCTTCATCATCACCCTCCTCTTCTT
PpCYP707A2-sybrF TCGGCAACAATAGGGACTTTGAAATG
PpCYP707A2-sybrR CCATCACTCTTCCTTCTCTTCGCTAT
PpCYP707A3-sybrF TCACCAAGGAGACTACCACAATAGC
PpCYP707A3-sybrR CAAGGAAGCCAACATCAAAGGAGAAC
β-actin-sybrF GTTATTCTTCATCGGCGTCTTCG
β-actin-sybrR CTTCACCATTCCAGTTCCATTGTC
PGSTCYP707A1-F CCGGGATCCATGGAAATCAGCAGTATTTTATACTCC
PGSTCYP707A1-R GCGGCCGCTTATGTTTTAGGAGATAATCTGATGGGC
PGSTCYP707A2-F CCGGGATCCATGCAACTTTTCTGCTCATCATTACTA
PGSTCYP707A2-R GCGGCCGCTCAACTCACAATCTTGCTCCTTG
作为内参基因, 利用获得的cDNA作为模板,
按照SYBR® Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)试
剂盒(宝生物)说明书上的操作进行荧光定量PCR
反应。反应体系为SYBR® Premix Ex Taq (2×) (Tli
RNaseH Plus) 10 μL, 上游引物(5 μmol·L-1) 0.8 μL,
下游引物(5 μmol·L-1) 0.8 μL, cDNA 1.0 μL, 加去离
子水至20 μL。每次试验设置3次技术重复。荧光
定量PCR反应条件: 95°C预变性30 s; 95°C变性5 s,
60°C退火30 s, 40次循环, 反应结束后分析荧光值
变化曲线和融解曲线。最后采用2-ΔΔCT 法进行定量
数据分析。
5 原核表达
根据桃中CYP707A基因序列以及和原核表达
载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点, 设计特异性引物
(表1), 进行PCR扩增, 之后链接到pMD-19simple克
隆载体中, 利用BamHI和NotI对克隆载体和PGEX-
4T-1原核表达载体进行双酶切, 然后用T4连接酶连
接, 构建重组表达载体pGST-PpCYP707A1和pGST-
PpCYP707A2, 将重组表达载体转化到大肠杆菌
BL21中, 加入0.5 mmol·L-1 IPTG后在0、2、4和6 h
时分别取样, 离心收集菌体, 2×SDS凝胶加样缓冲
液裂解菌体, 100°C煮沸5 min, 室温高速离心2 min,
取20 μL上清液于SDS-PAGE凝胶(4%浓缩胶和
12%分离胶)电泳分析 , PAGE胶用考马斯亮蓝
R-250染色并用脱色液脱色至背景。
实验结果
1 PpCYP707As的基因克隆以及基因组结构分析
根据桃基因组公布的CYP707A家族CDS序列,
分别设计特异性引物扩增获得3条1 500 bp左右的
条带(图1), 测序, 然后将测回的基因序列分别与基
因组公布的CDS序列比对, 发现在油桃‘中油四号’
中, CYP707A家族成员的CDS序列与公布的桃基因
组基因CDS序列一致。根据桃基因组公布的基因
序列分析表明, PpCYP707A1含有长度为1 440 bp的
CDS序列, 编码479个氨基酸, 预测其蛋白分子量为
54.54 kDa, 等电点为9.14, 位于基因组第5条染色体
上, 由7个外显子和6个内含子构成; PpCYP707A2的
CDS长度为1 446 bp, 编码481个氨基酸, 预测其蛋白
分子量为54.59 kDa, 等电点为9.27, 位于第6条染色
体上, 由8个外显子和7个内含子构成; PpCYP707A3
的CDS长度大小为1 416 bp, 编码471个氨基酸, 预测
其蛋白分子量为53.61 kDa, 等电点为9.45, 位于第8
条染色体上, 由9个外显子和8个内含子构成。
2 PpCYP707As的生物信息学分析
利用DNAMAN软件对PpCYP707As的蛋白序
植物生理学报662
列进行多序列比对分析表明, 桃中各个CYP707A
家族成员之间具有68.89%的相似性, 与其他物种
的CYP707A家族成员具有高达62.43%的相似度,
并且PpCYP707As具有CYP707A家族比较保守的血
红素铁配位体半胱氨酸残基(PFGNGTHSCPG) (图
2)。系统进化树分析表明, PpCYP707A1与StCY-
P707A1 (ABA55732)、AhCYP707A1 (CDJ80018)、
PvCYP707A1 (ABC86558)、PvCYP707A2 (ABC-
86559)的亲缘关系较近, PpCYP707A2与AtCY-
P707A2 (NP_180473)的亲缘关系较近, PpCYP707A3
与AtCYP707A4 (NP_566628)、AhCYP707A2
(CDJ80019)的亲缘关系较近(图3)。
3 PpCYP707As的组织特异性分析
定量结果显示桃CYP707A家族不同的成员在
不同的组织中表达不同(图4-A), PpCYP707A1在茎
中的表达水平最大, 在根和叶中次之, 在花和果实
中较低。PpCYP707A2在叶中的表达水平最高, 在
茎、花和果实中的表达水平次之, 在根中没有表
达。PpCYP707A3在花中的表达水平最高, 在叶中
的表达水平次之, 在根、茎、果实中的表达水平
比较低。
在拟南芥中, ABA可以诱导CYP707A家族基
因的表达(Saito等2004), 由于ABA在幼嫩组织和成
熟组织中的含量是不同的, 因此我们检测了桃CY-
P707A家族成员在幼嫩组织和成熟组织表达水平
的变化(图4-B和C), 定量结果显示PpCYP707A1和
PpCYP707A3在成熟叶和成熟花中的表达水平要
高于幼叶和幼花, 然而, PpCYP707A2在成熟花的
表达水平高于幼花, 但在成熟叶中的表达水平低
于幼叶的表达水平。
4 PpCYP707As在花芽休眠过程中的表达分析
如图5所示, 2014年9月21日至2014年11月22
日采集的油桃‘中油四号’枝培养25 d后花芽并未萌
发, 说明该阶段仍处在自然休眠期, 此时环境温度
逐渐降低; 11月22日以后枝条培养25 d后开始有芽
萌发; 12月20日培养的枝条萌芽率为38.4%, 但未
达到50%, 因此这段时间为花芽休眠解除期, 同时
这段时间环境温度达到一年最低值; 1月5日培养
的枝条水培25 d后萌芽率为80%, 超过50%, 说明休
眠已解除, 但是在自然条件下花芽受制于环境条
件还不能萌发, 但是外界环境温度逐渐升高, 因此
这段时间为生态休眠期。
由于低温下可以诱导ABA合成, ABA可以诱
导CYP707A基因表达, 因此为了更好的说明CY-
P707A家族特异性参与花芽休眠的进程, 我们以这
段时间一年生树皮作为参照来研究CYP707A家族
参与花芽休眠进程的调控。
荧光定量显示(图6), PpCYP707A1于9月21日
在花芽中的表达水平达到最高值, 然后呈现逐渐
降低的趋势; 在一年生枝韧皮部中, 其表达水平先
降低、再升高、再降低, 与在花芽中不一致, 说明
PpCYP707A1主要参与自然休眠前期的调控, 但是
图1 桃CYP707A家族基因编码区全长的PCR扩增
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of peach CYP707A gene family members
A: PpCYP707A1全长扩增产物; B: PpCYP707A2全长扩增产物; C: PpCYP707A3全长扩增产物。
王东岭等: 桃CYP707A家族基因的克隆以及表达分析 663
图2 不同物种CYP707A基因家族氨基酸序列同源比对
Fig.2 Comparison of the amino acid sequences of CYP707A gene family in different plants
植物生理学报664
图3 桃CYP707A基因家族蛋白与其他物种CYP707A基因家族蛋白的系统进化树分析
Fig.3 Phylogenetic tree of peach CYP707A gene family and CYP707A gene family proteins of other
图5 油桃‘中油四号’花芽的休眠进程以及温度变化
Fig.5 Dormancy status of ‘Zhongyousihao’ floral buds and the changes of temperature
图4 桃CYP707A基因家族成员在不同组织的表达分析
Fig.4 Expression analysis of CYP707A gene family members in different tissues
王东岭等: 桃CYP707A家族基因的克隆以及表达分析 665
不受环境温度的调控。PpCYP707A2在花芽和一
年生枝韧皮部的表达水平均呈现先增高后降低的
趋势, 并且在休眠解除期(12月5日)达到最大值, 此
时是一年中温度最低的时期, 说明也可能是低温
诱导PpCYP707A2的表达。PpCYP707A3在花芽中
的相对表达水平呈现先逐渐升高的趋势, 于12月5
日表达量增加, 并且以后维持一个相对比较平稳
的表达水平, 但在一年生枝韧皮部中其表达水平
相对平稳, 这说明PpCYP707A3主要参与休眠的解
除以及生态休眠的过程, 并且特异性调控休眠进
程, 不受环境温度调控。
5 不同处理对油桃花芽中CYP707A基因家族成员
的表达调控
‘中油四号’花芽分别经过1 mmol·L-1 GA3和1
mmol·L-1 ABA处理后, 分时段取样, 提取cDNA为
模板, 用PpCYP707A家族成员的特异引物进行了
qRT-PCR分析。PpCYP707A1和PpCYP707A3经过
诱导后在花芽中的表达量没有显著变化。PpCY-
P707A2在花芽中可以被1 mmol·L-1 GA3和1 mmol·L
-1
ABA诱导, 其表达量在处理3 d以后达到最大值(图
7)。本实验中1 mmol·L-1 GA3并不能打破花芽休眠。
6 PpCYP707A1和PpCYP707A2蛋白原核表达
重组质粒PGST-PpCYP707A1和PGST-PpCY-
P707A2经IPTG诱导后, 在大肠杆菌BL21中进行表
达。SDS-PAGE电泳(图 8)显示, 分别在分子量位
于70 kDa的位置出现融合蛋白诱导表达的条带。
除去GST-Tag标签蛋白25 kDa左右, 目的蛋白的分
子量与预测的PpCYP707A1和PpCYP707A2编码区
蛋白的分子量理论值相符, 而诱导的转化空载体
均未出现目的蛋白带。表明重组质粒pGST-PpCY-
P707A1和PpCYP707A2在大肠杆菌BL21中诱导表
达了PpCYP707A1和PpCYP707A2蛋白。
图6 CYP707A基因家族在自然休眠过程中的表达变化
Fig.6 Relative gene expression of peach CYP707A gene family members during dormancy process
植物生理学报666
讨　　论
在拟南芥、大麦、花生、马铃薯、菜豆等植
物中, 均已成功克隆了编码ABA8’羟化酶的基因并
将其命名为CYP707A, 通过真核表达的方式进行体
外ABA分解实验, 成功的验证了这些基因确实可以
在体外将ABA分解成PA (Saito等2004; Millar等2006;
Liu等2014; Suttle等2012; Yang和Zeevaar 2006)。研
究表明, CYP707A参与植物的水合作用和脱水作用,
并且调控着种子的休眠以及发育(Kushiro等2004;
Umezawa等2006; Kondo等2012; Lechat等2012)。
本试验将拟南芥中的CYP707A蛋白序列比对桃树
基因组, 找到了3条CYP707A类似序列, 分别命名为
PpCYP707A1、PpCYP707A2和PpCYP707A3。经过多
序列比对发现桃中的CYP707A类似基因都含有
CYP707A基因家族保守的血红素铁配位体半胱氨
酸残基。系统发育进化树分析表明桃中的CYP707A
类似基因在不同物种间具有高度的序列保守性,
并且PpCYP707A1与马铃薯CYP707A1、花生CY-
P707A1、菜豆CYP707A1、菜豆CYP707A2的亲
缘关系较近, 桃CYP707A2与拟南芥CYP707A2的亲
缘关系较近, 桃CYP707A3与拟南芥CYP707A4、花
生CYP707A2的亲缘关系较近。
植物组织的成熟过程往往伴随着ABA含量的
积累。在大麦中, 成熟叶片中的ABA的含量以及
HvCYP707A1表达水平高于幼嫩的叶片(Chono等
2006), 这与本研究中桃组织特异性的分析结果一
致。CYP707A家族基因是控制种子休眠的关键基
因, 控制着种子的休眠解除和萌发, 但其对花芽休
眠的调控鲜有报道。Fu等(2014)通过通过定量分
析桃种子休眠和花芽休眠过程内质网应激基因的
变化发现, 这些基因的变化具有惊奇的一致性。
Leida等(2010)通过SSH筛选出的桃花芽休眠解除
过程中的相关基因, 运用定量分析方法分析了这
些基因在桃胚休眠解除期间的表达模式, 也发现
了桃花芽休眠和种子休眠具有一定的相似性。因
此, CYP707A基因也可能参与花芽休眠的调控。本
研究发现, PpCYP707A1在花芽自然休眠前期的表
图7 PpCYP707A2经过脱落酸和赤霉素处理下的表达变化
Fig.7 Relative gene expression of PpCYP707A2 under 1 mmol·L-1 ABA and 1 mmol·L-1 GA3 treatment
图中不同的小写字母表示处理间在P<0.05水平有显著差异。
图8 PpCYP707A1 (A)和PpCYP707A2 (B)原核表达SDS-PAGE电泳结果
Fig.8 SDS-PAGE of PpCYP707A1 protein (A) and PpCYP707A2 protein (B)
A: PpCYP707A1原核表达SDS-PAGE电泳结果, 1、3、5、7为未加IPTG后0、2、4、6 h电泳结果, 2、4、6、8为加IPTG 0、2、4、6
h诱导后电泳结果; B: PpCYP707A2原核表达SDS-PAGE电泳结果, 1、3、5为未加IPTG后0、2、4 h电泳结果, 2、4、6为加IPTG 0、2、4 h
诱导后电泳结果。
王东岭等: 桃CYP707A家族基因的克隆以及表达分析 667
达水平最高, 可能与休眠的诱导存在一定的关系;
PpCYP707A2在花芽休眠解除期的表达迅速升高,
可能参与花芽休眠解除的过程; PpCYP70A3在花芽
休眠期和生态休眠期的相对表达量一直维持在较
高水平, 可能参与了花芽休眠解除以及生态休眠过
程。综上推知PpCYP707As交叉控制桃花芽休眠的
进程, 这与对菜豆种子休眠解除中的CYP707A家族
基因的研究结果一致的。为验证CYP707A对花芽休
眠调控的特异性, 本研究对一年生枝韧皮部CYP707
基因表达进行了研究, 结果显示, PpCYP70A1和
PpCYP707A3特异性调控休眠进程, 而PpCYP707A2
在花芽和韧皮部的表达变化一致, 说明该基因在休
眠解除期的表达上升可能由外界环境诱导。
在拟南芥和樱桃中, CYP707A基因家族可以
被ABA诱导表达(Ren等2010; Saito等2004), 利用
PlantCARE软件分析桃中CYP707A基因家族都具
有ABA的顺式作用元件ABRE, 因此理论上PpCY-
P707As也可以被ABA诱导, 但用ABA处理桃花芽,
仅仅PpCYP707A2响应了ABA信号。赤霉素是一
种打破种子休眠和促进种子萌发的激素, 一般认
为ABA和GA的比例调控休眠的进程, 但在本实验
中, GA3能够诱导PpCYP707A2的表达但不能打破
花芽的休眠。通过原核诱导, 本研究还成功获得
并纯化了PpCYP707A1和PpCYP707A2融合蛋白,
为进一步进行体外ABA分解实验更精确的确定
PpCYP707As的蛋白功能奠定了基础。
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植物生理学报668
Molecular cloning and expression analysis of CYP707A gene family in peach
WANG Dong-Ling, DU Pei-Yong, HUAN Lei, XIAO Wei, CHEN Xiu-De, LI Ling*, GAO Dong-Sheng*
Shandong Collaborative Innovation Center for Fruit and Vegetable Production with High Quality and Efficiency, State Key Lab-
oratory of Crop Biology, College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong
271018, China
Abstract: Three members of CYP707A gene family were cloned from ‘Zhongyousihao’ peach. The obtained
CDS was consistent with the ones released with peach genome. Multiple sequences alignment showed that the
sequence of CYP707A gene family was highly conservative among different species. They contained the highly
conserved cysteine residue, which was the putative heme iron ligand. Phylogenetic tree analysis showed that
PpCYP707A1 protein was closer to StCYP707A1, AhCYP707A1, PvCYP707A1 and PvCYP707A2; PpCY-
P707A2 protein was closer to AtCYP707A2; PpCYP707A3 protein was closer to AtCYP707A4 and AhCY-
P707A2. Quantitative real-time PCR analysis demonstrated that PpCYP707A1, PpCYP707A2 and PpCYP707A3
was highly expressed in stem, leaf and flower, respectively, and PpCYP707As was higher expressed in mature
tissues than in young tissues in general. PpCYP707As gene family members seemed playing overlapping role in
controlling flower bud dormancy, and PpCYP707A2 could be induced by ABA and GA in peach, Finally, we
obtained and purified the fused PpCYP707A1 and PpCYP707A2 protein by recombinant prokaryotic expres-
sion to further study on the functions of them.
Key words: peach; ABA 8’-hydroxylase; CYP707A; molecular cloning; expression analysis; bud dormancy;
prokaryotic expression
Received 2015-12-23 Accepted 2016-04-27
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31372050) and the Modern Agricultural Industry Tech-
nology System of Fruit Industry in Shandong Province-Equipment of Cultivation and Facilities (Grant No. SDAIT-03-022-05).
*Co-crresponding author (E-mail: lilingsdau@163.com, dsgao@sdau.edu.cn).
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