全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (6): 584~588584
收稿 2012-03-08 修定 2012-04-01
资助 湖南农业大学大学生创新性实验计划项目(20062886)。
* 通讯作者(E-mail: liuqingbo1740@yahoo.com.cn; Tel: 0731-
84673603)。
火龙果愈伤组织诱导与植株再生
黄红梅, 任希望, 刘清波*
湖南农业大学生物科学技术学院, 长沙410128
摘要: 为了建立火龙果愈伤组织诱导与植株再生体系, 以火龙果茎段、幼苗和子叶为外植体进行离体培养试验。结果表
明: 茎段诱导愈伤组织的最优培养基为1/2MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1, 诱导子叶愈伤组织的最适培养基是
1/2MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1, 诱导愈伤组织分化的最优培养基为1/2MS+6-BA 4.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1, 最佳
生根培养基为1/2MS+6-BA 1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1。
关键词: 火龙果; 组织培养; 愈伤组织; 愈伤组织分化
Callus Induction and Plantlet Regeneration from Pitaya
HUANG Hong-Mei, REN Xi-Wang, LIU Qing-Bo*
College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: To establish the system of callus induction and plantlet regeneration from pitaya, pitaya was in vitro
cultured using stem segments, seedlings and cotyledons as explants. The results showed the optimum medium
for the callus induction of stem segments was 1/2MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1. The most suitable
medium to induce the callus from cotyledons was 1/2MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1. The optimal me-
dium for inducing the callus differentiation was 1/2MS+6-BA 4.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1. The greatest medi-
um of root regeneration was 1/2MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1.
Key words: pitaya; tissue culture; callus; callus differentiation
火龙果原产中美洲的哥斯达黎加、尼加拉
瓜、墨西哥、古巴、越南等地, 是当地非常普遍
而又主要的水果(李升锋等2003)。火龙果又名红
龙果、仙密果、情人果等, 其学名为量天尺[Hylo-
cereus undatus (Haw.) Britt. & Rose], 属仙人掌科
(Cactaceae)量天尺属植物(Anderson等2001), 量天
尺的花可作蔬菜, 浆果可以食用, 商品名为“火龙果”
(曾建飞1999)。火龙果集水果、花卉、蔬菜、保
健为一体, 具有很高的经济价值(王彬等2006)。同
时, 火龙果具有耐贫脊、抗旱、嗜钙等生长特性, 是
适生广泛的植物, 其生产和消费符合生态农业与
高效农业的需求, 是发展前景较好的水果品种。
目前火龙果在生产上大多采用扦插或嫁接繁
殖, 繁殖速度相对较慢, 种源数量有限, 且易受环
境条件限制, 不利于大规模生产和品种改良。采
用离体培养技术快速繁殖火龙果种苗已有少许报
道。陈广超等(2003)研究表明采用腋芽增殖途径
进行火龙果的快速繁殖效率高。黄青峰和余成章
(2002)、黄青峰(2002)的研究认为火龙果的繁殖途
径以腋芽增殖途径为主。林家耕和张树河(2002)
通过火龙果茎段繁殖获得了大量试管苗, 并且试
管苗移栽成活率很高, 移栽成活的试管苗经生长
一段时间后, 将茎段嫁接到强壮的三角柱砧木上,
能够保持品种的遗传物质稳定, 不易发生变异。
因此, 腋芽增殖途径是保证火龙果品种质量、大
量快繁的一个主要手段。
火龙果的快速繁殖是提供生产用种苗的重要
途径, 而火龙果遗传转化是提高种苗质量和改良
火龙果品种的必需方式。但遗传转化的成功需要
高效再生体系的建立, 愈伤组织的诱导是建立再
生体系的基础和前提。然而, 有关火龙果的愈伤
组织诱导和分化研究鲜见报道。本研究试图通过
组织培养手段, 建立火龙果的愈伤组织诱导与分
化再生体系, 以期为火龙果的定向培育及遗传转
化等方面的研究提供基础手段和理论依据。
黄红梅等: 火龙果愈伤组织诱导与植株再生 585
材料与方法
1 材料及外植体处理
本试验所用材料为火龙果, 学名为量天尺[Hy-
locereus undatus (Haw.) Britt. & Rose], 引自越南,
果皮红色果肉白色, 购自水果店。
2 试验方法
2.1 火龙果幼苗和无菌幼苗的获取
把火龙果种子从果肉中分离出来, 因为种子
很小而且与果肉相连, 所以要用清水冲洗干净。
待种子风干后进行2种处理: (1)播种在花盆里面,
保持泥土的湿润, 然后用保鲜膜包住花盆口, 放在
温暖的地方, 待长出幼苗。(2)将种子用0.1%升汞
溶液灭菌10 min, 然后放在MS (无激素)培养基中
培养20 d左右, 待长出无菌幼苗。
2.2 材料的灭菌
将花盆里的20 cm左右茎段, 用70%酒精浸泡
30 s, 再用0.1%升汞溶液灭菌10 min, 并用无菌水
冲洗3次, 备用。
2.3 外植体的切取
将上述已灭菌的火龙果幼茎切成1~2 cm的茎
段。在培养基上生长的无菌幼苗长到1.5 cm左右
长(带有子叶)时: (1)切取子叶分别放入添加了不同
激素的1/2MS培养基中; (2)把去掉根的幼苗直接扦
插于1/2MS培养基中。
2.4 不同配方培养基的选择
各种培养基配方见表1~5, 所有培养基均以1/2
MS培养基为基本培养基, 蔗糖为3%, 琼脂为0.7%。
2.5 接种与培养
将外植体接种在相应的培养基上, 放置在温
度为25~28 ℃, 湿度75%~80%, 光照强度20~40
µmol·m-2·s-1, 光照时间14 h·d-1的条件下培养。试验
过程中每3 d观察一次结果, 记录实验现象并进行
数码拍照。
2.6 培养途径
采用茎段、子叶、幼苗为外植体, 分别进行
愈伤组织诱导和分化, 然后进行生根培养, 获得再
生植株。
实验结果
1 种子发芽及培养
本试验发现, 火龙果种子无菌发芽时间比在
土壤中的发芽时间长, 无菌发芽需要3周左右, 土
壤中发芽只需要10 d左右(25 ℃以上)。由于培养
基中缺乏营养和水分偏低, 所以无菌发芽时间长,
为了让种子更好的吸收水分, 缩短种子发芽时间,
采取了两种办法: 将种子用清水浸泡3 d后接种至
培养基上 , 打破种子的休眠期 , 培养2周即可萌
发。或者配制半固体培养基(pH值5.4以下), 观察
发现火龙果种子的发芽率很高, 可以达到98%。生
长在土壤里的火龙果种子虽然短时间内发芽, 但
大部分幼苗很容易受到污染, 使整株幼苗死亡。
所以火龙果种子无菌发芽有利于其组织培养, 而
且可以提高幼苗存活率。
2 茎段愈伤组织的诱导
从表1可以看出3号培养基中愈伤组织诱导率
为100%, 最适合茎段愈伤组织诱导。在不含2,4-D
和6-BA的9号培养基中愈伤组织诱导率也达到了
66.7%, 但是在愈伤组织上同时形成了许多根。在
含高浓度6-BA的17号培养基中也能形成愈伤组
织, 同时形成了不定芽, 后期观察发现, 愈伤组织
生长减缓甚至停止生长(图1-A), 可能由于不定芽
的存在分散了营养。
3 子叶和幼苗愈伤组织诱导
从表2可以看出虽然17号培养基中幼苗的愈
伤组织诱导率最高, 为76%, 但是同时在胚轴上形
成了丛生芽, 分散了营养, 导致后期愈伤组织生长
缓慢, 愈伤组织块体积小。而且把去根的幼苗直
接插入培养基中时, 不容易启动形成愈伤组织, 幼
苗由于创伤面积小, 接触培养基面积少, 使愈伤组
织产生较慢且体积很小(图1-B)。因此幼苗不宜作
为诱导愈伤组织的外植体。而将子叶平放在培养
基上, 子叶形成了大量愈伤组织, 愈伤组织块体积
大, 集中在子叶的基部(图1-C), 且在4号培养基中
子叶的愈伤组织诱导率最高, 为60%, 尽管低于幼
苗外植体的愈伤组织诱导率, 但是其愈伤组织量
更大, 所以火龙果诱导愈伤组织的最佳外植体材
料是子叶, 最适合子叶诱导愈伤组织的培养基成
分是1/2MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1。
另外, 被切除了子叶的胚轴在所有供试培养
基上均没有形成愈伤组织, 且胚轴很快先变白而
后变褐死亡(数据未列出)。
4 诱导愈伤组织分化培养
从表3可以看出愈伤组织诱导分化不定芽的
植物生理学报586
分化率最高的是5号培养基, 可以达到80%。在本
试验过程中, 发现来源于子叶的愈伤组织可以成
功诱导分化产生不定芽, 但是来源于茎段的愈伤
组织在分化培养过程中只有愈伤组织的增殖, 而
未见分化出不定芽。且子叶的愈伤组织质地致密
表1 茎段愈伤组织诱导
Table 1 The callus induction of the stem sections
培养基编号 2,4-D/mg·L-1 6-BA/mg·L-1 NAA/mg·L-1 接种数/块
愈伤组 愈伤组织
织数/块 诱导率/%
1 2.0 0 0 12 4 33.30
2 2.0 0.2 0 12 10 83.30
3 2.0 0.5 0 15 15 100.00
4 2.0 1.0 0 16 8 50.00
5 0 1.0 0 17 6 35.29
6 0 1.0 0.3 8 4 50.00
7 0 1.0 0.5 25 14 56.00
8 0 1.0 1.0 24 20 83.33
9 0 0 3.0 18 12 66.70
10 0 0 4.0 20 6 30.00
11 0 0 5.0 20 5 25.00
12 0 2.0 0.1 20 6 30.00
13 0 2.0 0.2 19 11 57.89
14 0 2.0 0.3 20 9 45.00
15 0 4.0 0.1 15 2 13.33
16 0 4.0 0.3 22 12 54.55
17 0 4.0 0.5 13 11 84.62
(图1-D), 而茎段的愈伤组织质地较为松散, 且有部
分褐化。可能不同质地的愈伤组织分化能力不
同。
5 不定芽生根培养
从表4中可以看出2号培养基的平均根数可以
表2 子叶和幼苗愈伤组织诱导
Table 2 The callus induction of the cotyledons and seedlings
培养基编号 2,4-D/mg·L-1 6-BA/mg·L-1 NAA/mg·L-1 外植体类型 接种数/块
愈伤组 愈伤组织
织数/块 诱导率/%
1 2.0 0 0 子叶 20 5 25
2 2.0 0.2 0 子叶 20 8 40
3 2.0 0.5 0 子叶 20 8 40
4 2.0 1.0 0 子叶 20 12 60
5 0 1.0 0 幼苗 6 0 0
6 0 1.0 0.3 幼苗 14 0 0
7 0 1.0 0.5 幼苗 9 0 0
8 0 1.0 1.0 幼苗 16 0 0
9 0 0 3.0 幼苗 17 0 0
10 0 0 4.0 幼苗 7 0 0
11 0 0 5.0 幼苗 6 0 0
12 0 2.0 0.1 幼苗 20 0 0
13 0 2.0 0.2 幼苗 20 0 0
14 0 2.0 0.3 幼苗 19 0 0
15 0 4.0 0.1 幼苗 15 7 46
16 0 4.0 0.3 幼苗 22 6 27
17 0 4.0 0.5 幼苗 17 13 76
黄红梅等: 火龙果愈伤组织诱导与植株再生 587
表3 诱导愈伤组织分化
Table 3 Inducing the callus differentiation
培养基编号 6-BA/mg·L-1 NAA/mg·L-1 愈伤组织数/块 分化数/块 分化率/%
1 2.0 0 15 4 26.00
2 2.0 0.5 15 5 33.30
3 2.0 1.0 15 2 13.30
4 4.0 0 15 7 46.67
5 4.0 0.5 15 12 80.00
6 4.0 1.0 15 6 40.00
图1 火龙果愈伤组织诱导与植株再生
Fig.1 Callus induction and plantlet regeneration from pitaya
A: 茎段愈伤组织诱导; B: 幼苗愈伤组织诱导; C: 子叶愈伤组织诱导; D: 愈伤组织分化不定芽; E和F: 不定芽的生根。
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表4 诱导不定芽生根
Table 4 The root regeneration of the adventitious buds
培养基编号 6-BA/mg·L-1 NAA/mg·L-1 接种数/块 生根数/块 根数/条 平均根数/条 根长度/cm
1 1.0 0 6 6 18 3.00 5.0
2 1.0 0.3 14 14 72 5.14 4.0
3 1.0 0.5 9 9 32 3.50 3.0
4 0 0.5 30 14 16 0.53 1.8
5 0 1.0 30 30 82 2.73 3.0
6 0 1.5 30 30 46 1.53 3.6
7 0 2.0 30 21 28 0.93 2.5
达到5.14条根, 根的长度可以达到4.0 cm左右, 所
以最适合诱导不定芽的生根, 并且根系较为粗壮
(图1-E、F)。
讨 论
本试验建立了火龙果愈伤组织诱导和植株再
生的体系, 有关火龙果的愈伤组织诱导和分化研
究鲜见报道, 本试验中确定了子叶的愈伤组织诱
导效果最好, 子叶愈伤组织可以较容易诱导分化
产生不定芽, 印证了Infante (1992)的观点, 即火龙
果子叶是诱导愈伤组织的主要外植体来源, 并且
形成的愈伤组织只出现在子叶的基部(即子叶与胚
轴连接处), 与Pelah等(2002)的研究结果一致。同
时, Pelah研究发现上胚轴、下胚轴在诱导愈伤组
织的培养中既没有形成愈伤组织, 也没有发生任
何形态变化, 与本试验中的现象一致, 可能是由于
子叶中存在某种极性的因素(Silva和Jones 1996)。
因此, 我们推测本试验中去除胚根的幼苗形成愈
伤组织很少且小, 可能与胚轴不能形成愈伤组织
的原因一致, 其机制有待进一步研究。
在愈伤组织分化培养中, 来自于茎段的愈伤
组织未能分化出不定芽, 而子叶愈伤组织能够分
化出不定芽。原因是子叶愈伤组织是胚性愈伤组
织, 胚性愈伤组织不仅容易分化, 亦是获得胚状体
的较佳材料来源(Infante 1992)。茎段愈伤组织是
非胚性愈伤组织, 不易分化, 且在茎段的切口面和
来自于茎段的一部分愈伤组织中出现了褐化现象,
褐化会明显抑制材料的生长以及分化。褐变出现
的原因是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活,
而使细胞的代谢发生变化所致(韦立三2000)。高
浓度的激素、切口处分泌物附着和培养时间过长
也可能导致这一现象发生。试验中诱导茎段形成
愈伤组织时, 腋芽可被诱导成丛生芽, 可以达到快
速繁殖火龙果的目的, 但是在丛生芽继代增殖过
程中, 新梢生长速度相当缓慢, 培养50~60 d, 仅长
高1~2 cm, 且试管苗移栽后新梢生长仍然很缓慢。
综上所述, 在后续的火龙果组织培养研究中, 可采
取适当措施进一步提高愈伤组织诱导率、分化率
和新梢生长速度, 为火龙果的遗传转化和改良提
供理论依据和技术支撑。
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