全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (11): 1043~1049 1043
收稿 2012-07-18　　修定 2012-10-18
资助 山东省泰安市科技局项目(2011-2013)和山东省泰安市大
学生科技引领创新计划项目(2008D2010和2009D1009)。
* 通讯作者(xingsy@sdau.edu.cn; Tel: 0538-8243903)。
欧石楠体细胞胚发生和植株再生
李际红, 邢世岩*, 姚培娟, 谭起航, 王海林
山东农业大学林学院, 农业生态与环境重点实验室, 山东泰安271018
摘要: 以欧石楠茎段为外植体, 研究其体细胞胚胎发生和植株再生。对影响茎段不定芽分化及胚性愈伤组织诱导的主导因
子进行比较分析, 并研究其体胚萌发、生根及移栽; 同时, 采用树脂切片法对茎段脱分化产生胚性愈伤组织及体胚发育过
程进行组织细胞学观察。结果表明, 接种在1/2WPM基本培养基上的茎段, 胚性愈伤组织诱导率为88.7%, 显著高于其他处
理, 不定芽诱导率可达90.6%, 平均分化倍数为3.6个, 平均分化苗高3.82 cm; 体细胞经过成熟培养后, 在添加1.0 mg·L-1 ZT和
0.3 mg·L-1 IBA的1/2WPM培养基上萌发, 萌发的体胚在1/2WPM附加0.2 mg·L-1 NAA和0.3 mg·L-1 IBA的培养基上形成完整
的体胚苗植株, 体胚苗生根率达到87.4%, 经炼苗后移栽到蛭石:珍珠岩=3:1 (V/V)的栽培基质中, 成活率可达63.7%。在显微
镜下可观察到球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚; 体细胞胚以间接方式发生, 表现为愈伤组织外层细胞直接发生和愈
伤组织组织内部细胞发生。
关键词: 欧石楠; 体细胞胚; 体胚发生; 植株再生; 组织细胞学观察
Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration of Erica carnea L.
LI Ji-Hong, XING Shi-Yan*, YAO Pei-Juan, TAN Qi-Hang, WANG Hai-Lin
Key Laboratory of Agricultural Ecology and Environment, College of Forestry, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shan-
dong 271018, China
Abstract: In this study, we investigated somatic embryogenesis and plant regeneration in Erica carnea with
stem section as explant. The effects on adventitious bud differentiation from stem and embryogenic callus in-
duction were carried on comparative analysis. Subsequently, we explored its somatic embryo germination, root-
ing and transplantation. Meanwhile, embryogenic callus from stem differentiation and somatic embryogenesis
were also observed by semi-section with resin embedded. The results showed that the induction rate (88.7%) of
embryogenic callus on the basal medium 1/2WPM was higher than those on other media. The induction rate of
adventitious bud, the average differentiation coefficient and the average height of differentiation seedlings
reached 90.6%, 3.6 and 3.82 cm, respectively. Somatic cells germinated on the 1/2WPM medium with 1.0
mg·L-1 ZT and 0.3 mg·L-1 IBA after maturation. Thereafter, germinated somatic embryos formed complete
plantlets, and rooting rate reached 87.4% on 1/2WPM medium containing 0.2 mg·L-1 NAA and 0.3 mg·L-1 IBA.
The plantlets from somatic embryos were transplanted onto the substrate with vermiculite and perlite (3:1, V/V),
and survival rate reached 63.7%. Furthermore, globular embryos, heart-shaped embryos, torpedo embryos and
cotyledon embryos were observed under a microscope. The somatic embryogenesis was occurred in two ways:
direct somatic embryogenesis from outer cells of callus and indirect somatic embryogenesis from intercells of
callus.
Key words: Erica carnea; somatic embryo; somatic embryogenesis; plant regeneration; cytohistological obser-
vation
我国北方地区地处温带, 受季风影响, 四季分
明。特定的地理和气候条件决定了我国北方的植
物景观以落叶阔叶树和常绿针叶树为主(张莉俊等
2006)。目前, 我国北方地区能够用于冬季开花的
地被植物非常有限, 因此, 从国外引种适应我国气
候和环境条件的冬季地被开花植物, 对满足我国
绿化建设的需要具有重要的意义。
欧石楠是我们于2006年从华野园艺引进的适
合我国北方地区的欧洲最新地被开花植物, 为常
绿小灌木, 分枝多而密, 可随意修剪成型, 花色丰
植物生理学报1044
富, 花期为每年10月到第2年4~5月, 为公园、花
坛、庭院绿化首选的地被植物(孟凡志等2004)。
经过几年的引种驯化, 在山东东营和泰安已分别
有八年生和六年生的欧石楠, 其营养生长与繁殖
生长均正常 , 表现出比较强的适应性 (沙文勇
2002)。然而, 欧石楠自然生长较慢, 种子成熟率较
低, 繁殖和推广比较困难。采用嫁接扦插等营养
繁殖的方法需要花费大量的时间, 消耗大量的劳
力, 又会受到季节及数量的限制, 还容易传播病虫
害。本文采用植物体细胞胚胎发生途径获得再生
植株, 旨在较短时间内获得大量的欧石楠苗木。
植物体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis,
SE)是指在离体培养条件下, 体细胞通过与合子胚
发生类似途径形成的类似合子胚结构的过程。植
物体胚的产生在高等植物中相当普遍, 现已从140
多个树种的组织培养中观察到体胚的发生或诱导
出再生植株(王菲等2011)。经植物体细胞胚胎发
生途径获得再生植株 , 具有数量多、繁殖速度
快、结构完整、植株再生率高、不受季节影响等
特点(Park等2006); SE发育初期获得的胚性愈伤组
织(embryogenic callus, EC)是一种全能性干细胞,
具有多向分化潜能, 是植物快速繁殖、基因工程
遗传转化的良好受体细胞(Trontin等2007)。体胚
发生技术的研究对无菌苗的大规模生产和人工种
子的制备具有重要的作用, 可以广泛应用于繁殖
较慢或比较困难的园林植物的快速繁殖, 对园林
植物的遗传转化、遗传改良的研究均具有重要作
用(孔东梅等2006; Pescador等2008; 杨玲和沈海龙
2011; 江荣翠等2010; 张建瑛等2010)。目前, 有关欧
石楠体细胞胚发生和植株再生的研究尚未见报道。
本试验选取欧石楠当年生嫩梢为外植体, 从
基本培养基、植物生长调节物质、体胚发生的组
织细胞学及体细胞胚的发生方式等方面研究欧石
楠茎段胚性愈伤组织的发生、体胚诱导以及植株
再生, 以期获得稳定、高效的欧石楠体胚再生体
系, 为欧石楠快速繁殖及遗传转化体系的建立提
供理论依据和实验(技术)平台, 为欧石楠工厂化育
苗提供一条新途径。
材料与方法
1 试验材料
2010年春季和秋季分别从移栽在山东农业大
学林学实验站的六年生欧石楠(Erica carnea L.)母
株采集当年生嫩梢。流水下冲洗2 h, 在超净工作
台上用75% (V/V)酒精浸泡30 s, 0.1% (V/V)升汞消
毒8~10 min, 无菌水冲洗4~6次; 用灭菌滤纸吸取茎
段表面的水分, 用无菌剪刀剪取1.0 cm左右长的茎
段作为诱导体细胞胚胎的外植体备用。
2 试验方法
2.1 基本培养基的筛选
采用单因子试验, 从MS (Murashige和Skoog
1962)、1/2MS (MS大量元素减半)、WPM (Lloyd
和McCown 1980)、1/2WPM (WPM大量元素减
半)、B5 (Gamborg等1968) 5种培养基中筛选基本
培养基, 培养基中均附加1.0 mg·L-1 ZT和0.3 mg·L-1
IBA。每个处理接种20个茎段, 重复3次。6周后统
计愈伤组织诱导率、不定芽的平均分化倍数及平
均分化苗高。
2.2 用于胚性愈伤组织及体胚诱导的植物生长调
节剂
以1/2WPM为基本培养基 , 分别设置ZT为
0.5、1.0、1.5 mg·L-1三个浓度梯度, IBA为0、
0.3、1.0 mg·L-1三个浓度梯度, 按L9(3
4)正交设计,
共9个组合处理, 每处理接种20个茎段, 重复3次。
6周后统计愈伤组织诱导率、不定芽的平均分化
倍数及平均分化苗高。
2.3 体胚发生过程中的组织细胞学观察
不同处理下培养45~50 d的外植体, 经FAA
(50%酒精配制)固定, 经梯度酒精脱水、二甲苯过
渡到树脂并包埋。Lecia自动切片机切片, 厚8 μm,
Haupt粘贴剂粘片, 经烤片、烘干后, 脱蜡并经梯度
酒精复水至苏木精(0.5%)中染色24 h, 2%硫酸铁铵
分色, 再梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封
片, Olympus BX60显微镜下观察, Olympus DP70全
自动照相系统拍照。
2.4 体细胞胚的成熟、萌发与炼苗及移栽
将胚性愈伤组织在1/2WPM添加1.0 mg·L-1 ZT
和0.3 mg·L-1 IBA的培养基中培养15 d左右, 诱导体
细胞胚成熟; 继续培养30 d左右, 使成熟的体细
胞胚萌发; 将萌发到3 cm左右的体胚苗移栽到
1/2WPM添加0.2 mg·L-1 NAA和0.3 mg·L-1 IBA的基
质培养基(李际红等2012)中培养45 d左右, 体胚苗
生根, 形成完整体胚苗小植株; 将生根的体胚苗在
大棚驯化10 d, 移栽到3:1 (V/V)的蛭石与珍珠岩栽
李际红等: 欧石楠体细胞胚发生和植株再生 1045
培基质中, 30 d后统计体胚苗的成活率, 并将健壮
体胚苗移栽到温室花盆中。温室温度22~28 ℃, 相
对湿度50%~70%。
2.5 培养条件与数据处理及分析
培养温度(25±2) ℃, 光暗周期为12 h/12 h, 光
照强度为40~50 μmol·m-2·s-1, 培养基中添加琼脂
(agar type A) 8.0 g·L-1, pH 4.8~5.2。单因素和两因
素方差分析及Duncan多重比较均利用DPS数据处
理系统, 进行统计及显著性分析。不定芽的诱导
率(%)=(诱导出不定芽的外植体数/接种的外植体
数)×100; 平均分化倍数=再生不定芽总数/接种外
植体数; 平均分化苗高=再生不定芽的苗高/接种
外植体数; 胚性愈伤组织诱导率(%)=(诱导出愈伤
组织的外植体数/接种的外植体数)×100; 体胚苗
生根率(%)=生根体胚苗数/接种体胚苗数×100; 体
胚苗的移栽成活率(%)=移栽成活株数/移栽总株
数×100。
实验结果
1 基本培养基对欧石楠茎段不定芽及基部胚性愈
伤组织诱导的影响
由表1可知, 以1/2WPM为基本培养基, 6周后
在其茎段基部形成浅绿色的胚性愈伤组织, 胚性
愈伤组织诱导率可达88.7%, 高于其他4种培养基;
方差分析和多重比较显示, 1/2WPM与其他处理相
比达到极显著差异。培养45~50 d时, 新梢(茎段)
不定芽诱导率、平均分化倍数、平均分化苗高均
是以1/2WPM为基本培养基上的最高, 分别达到
90.6%、3.6个和3.82 cm; 方差分析和多重比较显
示, 1/2WPM与其他处理相比达到极显著差异。因
此, 1/2WPM为欧石楠胚性愈伤组织诱导及新梢不
定芽诱导的最佳培养基。
表1 基本培养基对欧石楠胚性愈伤组织及不定芽诱导的影响
Table 1 Effects of basal media on the induction of embryogenic callus and adventitious buds of E. carnea
培养基类型 不定芽诱导率/% 平均分化倍数 平均分化苗高/cm 胚性愈伤组织诱导率/%
MS 55.8±1.732d 1.5±0.441Cc 1.80±0.173Bc 76.8±1.039Bc
1/2MS 65.8±2.886c 2.0±0.116bBCc 2.07±0.040Bc 80.0±1.155Bb
WPM 77.3±1.154b 2.8±0.115BCbc 3.23±0.156Ab 77.3±0.173Bc
1/2WPM 90.6±0.577a 3.6±0.346ABab 3.82±0.104Aa 88.7±0.173Aa
B5 63.2±2.887
c 1.3±0.116Cc 1.70±0.116Bc 53.3±0.404Cd
　　各列中标有不同大、小写字母表示在1%及5%水平差异显著; 培养基中均附加1.0 mg·L-1 ZT和0.3 mg·L-1 IBA。
2 植物生长调节剂对欧石楠新梢不定芽及基部胚
性愈伤组织诱导的影响
由表2可知, 第5个组合即1/2WPM+ZT 1.0 mg·L-1+
IBA 0.3 mg·L-1的诱导效果最好, 其平均分化倍数最
高达到3.5个, 平均分化苗高为3.62 cm, 胚性愈伤组织
的诱导率达到87.5%。方差分析和多重比较显示,
第5个组合极显著高于其他处理, 为欧石楠胚性愈伤
组织诱导及新梢不定芽诱导的最佳激素组合。
表2 植物生长调节剂对欧石楠胚性愈伤组织及不定芽诱导的影响
Table 2 Effects of plant growth regulators on the induction of embryogenic callus and adventitious buds of E. carnea
组合 ZT浓度/mg·L-1 IBA浓度/mg·L-1 平均分化倍数 平均分化苗高/cm 胚性愈伤组织诱导率/%
1 0.5 0 1.20±0.173Cc 2.15±0.029Bb 53.3±1.905Dd
2 0.5 0.3 1.15±0.029Cc 3.11±0.052Aa 82.3±1.559ABab
3 0.5 1.0 2.50±0.116Bb 1.30±0.116CDcd 85.5±3.1754Aa
4 1.0 0 1.28±0.046Cc 1.12±0.069DEd 76.3±2.714ABbc
5 1.0 0.3 3.50±0.116Aa 3.62±0.173Aa 87.5±3.175Aa
6 1.0 1.0 1.23±0.075Cc 0.88±0.069EFe 85.6±3.233Aa
7 1.5 0 1.07±0.040Cc 1.47±0.017Cc 41.7±3.655De
8 1.5 0.3 1.39±0.006Cc 0.78±0.127Fe 56.8±3.347Cd
9 1.5 1.0 1.22±0.012Cc 0.84±0.092EFe 71.3±1.559Bc
　　各列中标有不同大、小写字母表示在1%及5%水平差异显著; 基本培养基为1/2WPM。
植物生理学报1046
3 欧石楠体胚的形态学特征
将欧石楠外植体接种到体胚诱导最适培养基
1/2WPM+ZT 1.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1上, 培养30 d
时, 外植体切口处产生少量半透明或淡黄色的愈伤
组织; 培养50 d时, 外植体基部部分或全部被胚性愈
伤组织包裹, 为白色半透明或淡绿色, 表面颗粒状,
呈现不同的形态特征(图1)。从形态变化过程可发
现欧石楠体细胞胚发生的各个时期, 如胚性愈伤组
织表面有数个近球形、半透明、表面光滑的球形
胚和棒状胚(图1-A), 心形胚(图1- B~D), 双子叶及多
子叶形胚(图1-E), 体胚萌发形成的再生植株(图
1-F)。观察表明, 欧石楠体细胞胚的发育过程像合
子胚一样, 经历了球形胚、心形胚、鱼雷形胚到分
化出子叶胚及再生植株的全过程。
图1 欧石楠体胚发生的形态学观察
Fig.1 Morphological observation on somatic embryogenesis of E. carnea
A: 球形肧(红箭头)和棒状肧(黑箭头); B: 心形胚(黑箭头)和次生球形胚(红箭头); C: 心形胚的侧面(黑箭头); D: 膨大的心形胚(黑箭头);
E: 双子叶(黑箭头)和三子叶(红箭头); F: 体胚萌发形成的再生植株。
4 欧石楠体细胞胚发生的组织学观察
观察欧石楠胚性愈伤组织不同发生阶段的树
脂切片可知, 欧石楠体胚突起初期, 突起部位的细
胞小、壁厚、胞质浓厚、核大, 为胚性愈伤组织
(图2-A、C、D), 而图2-J显示的为非胚性愈伤组
织。体胚突起初期的胚性愈伤组织, 随着细胞分
裂的进行, 细胞数量不断增加, 体胚发育进入球形
胚期(图2-B黑色箭头所示和图2-C)或者进入梨形
胚期(图2-A黑色箭头所示); 球形胚期, 细胞纵向伸
长, 两侧细胞分裂较快进而向外突出, 形成两个突
起, 体胚进一步发育, 进入体积增大的心形胚期(图
2-C和D); 心形胚发育形成两片子叶, 胚状体伸长
形成鱼雷形胚, 再迅速发育进入形态清晰的子叶
形胚(图2-E和F); 体细胞胚进入子叶期之后逐渐从
其胚性愈伤组织上分离出来, 形成独立的个体(图
2-F), 这是体胚萌发进一步发育成完整植株的关键
时期。树脂切片的细胞学观察结果表明, 欧石楠
通过体胚发育可以形成大量的再生植株, 体胚再
生是欧石楠快速繁殖的主要再生方式。
由图2可知, 欧石楠体胚发生方式为间接发生,
茎段培养30 d左右, 在其基部形成愈伤组织, 继续
培养15 d, 由愈伤组织诱导形成体胚。愈伤组织的
外层及组织内均存在胚性细胞(图2-G、K、L箭头
所示), 它们均有发育为体细胞胚的潜能(图2-G、
H、I)。分布在愈伤组织内部的胚性细胞逐渐由内
向外发育, 而非胚性愈伤组织不断地褐化、死亡,
李际红等: 欧石楠体细胞胚发生和植株再生 1047
形成隔离, 产生髓腔(图2-H、I、K), 髓腔两侧密集
分布着大量的胚性细胞(图2-H、I、K黑色箭头所
示)。同时, 观察发现愈伤组织内多处分布有胚性
细胞团(图2-L箭头所示), 它们在适宜的条件下可
能发育形成体胚。愈伤组织内部的胚性细胞团也
明显存在体细胞胚发生的整个过程, 如体细胞胚
初期的球形突起(图2-H), 逐渐发育进而使体细胞
胚伸长, 形成鱼雷形胚(图2-I)。根据体细胞胚发生
图2 欧石楠体胚发生的组织细胞学观察
Fig.2 Cytohistological observation on somatic embryogenesis of E. carnea
A: 梨形胚(黑色箭头)和球形胚发生前期(红色箭头); B: 球形胚(黑色箭头); C: 心形胚前期(黑色箭头); D: 心形胚(红色和黑色箭头); E:
子叶期(红色箭头)和次生球形胚(黑色箭头); F: 子叶形胚; G: 从表皮细胞发生的球形胚(黑色箭头); H: 组织内部产生的球形胚(黑色箭头); I:
内部球形胚的伸长(黑色箭头); J: 非胚性愈伤组织; K: 组织内的胚性愈伤组织(黑色箭头); L: 组织内的胚性细胞团(黑色箭头)。
过程的树脂切片观察以及细胞变化的典型特征可
推知, 欧石楠体细胞胚胎发生方式为间接发生, 愈
伤组织的表皮细胞及组织内细胞均能发育成体细
胞胚。
5 体胚的成熟与萌发
愈伤组织在添加1.0 mg·L-1 ZT和0.3 mg·L-1
IBA的1/2WPM培养基中培养15 d, 体细胞胚成熟
(图3-A); 继续培养30 d, 成熟的体细胞胚萌发(图
植物生理学报1048
图3 欧石楠体胚萌发成植株
Fig.3 Somatic embryo germination and plant establishment of E. carnea
A: 体细胞胚; B和C: 体细胞胚萌发; D和E: 体胚苗生根; F: 移栽苗。
3-B和C); 将生长到3 cm左右的体胚苗移栽到
1/2WPM+0.2 mg·L-1 NAA+0.3 mg·L-1 IBA的基质培
养基(李际红等2012)中培养45 d, 体胚苗生根(生根
率87.4%), 形成完整小植株(图3-D和E); 体胚苗在
大棚驯化10 d后, 移栽到蛭石与珍珠岩3:1 (V/V)的
栽培基质中培养30 d, 体胚苗的成活率可达63.7%
(图3-F), 将健壮的体胚苗移栽到温室(温度22~28 ℃,
相对湿度50%~70%)花盆中。
讨　　论
植物体胚发生方式可分为直接发生和间接发
生两种(Quiroz-Figueroa等2006): 前者是不经过愈
伤组织阶段, 从幼胚子叶或胚轴等部分直接长出
体胚, 如地被菊等(蒋细旺等2008); 后者是先生成
胚性愈伤组织, 再从胚性愈伤组织表面或内部形
成体胚, 如中国沙棘(李俊等2009)。研究发现, 欧
石楠新稍的体胚发生是通过间接发生途径, 经历
了球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚几个典
型发育期, 最后发育成熟, 这与大多数植物体细胞
胚胎发生过程相同(陈金慧2003; 孔东梅等2006; 沈
海龙等2011; 张启香等2011)。
大量的研究表明, 植物器官发生与体胚发生
对基本培养基的要求不同, 如WPM适合多种木本
植物(Woo和Wetzstein 2008)。培养基中氮是体胚
发生所必需的元素, 不同培养基中氮素含量不同,
而不同植物对氮素的要求也不一样。如松柏类植
物的体胚诱导一般要求培养基中NO3
–及NH4
+的总
量较低, 而另一些树种则要求较高含量的还原氮
(Burns和Wetzstein 1997)。本研究对基本培养基筛
选后发现, 1/2WPM为欧石楠胚性愈伤组织及体胚
诱导的最佳基本培养基(其中附加1.0 mg·L-1 ZT和
0.3 mg·L-1 IBA), 其诱导率较高, 可达87.5%~88.7%。
在MS、WPM、B5三种基本培养基中, 氮素的提供
形式和含量均不同: WPM中为NO3
–, 含量为956
mg·L-1, 1/2WPM中仅478 mg·L-1; MS中为NO3
–和
NH4
+, 两者合计3 550 mg·L-1; B5中为NO3
–, 含量为
2 500 mg·L-1。可见, WPM的无机盐和离子浓度较
低, 适合多种木本植物, 这与Burns和Wetzstein (1997)
的结论基本一致。
对于大多数木本植物来说, 2,4-D是诱导植物
体胚发生的必要生长调节物质, 但也有研究指出,
2,4-D在部分植物体细胞胚诱导过程中无效, 甚至
阻碍体细胞胚的发生(Maalej等2006)。在胡桃科
中, 2,4-D诱导核桃(Juglans regia)、美国山核桃
(Carya illinoinensis)等体细胞胚的效果不显著, 而
采用IBA、NAA等较2,4-D诱导的体胚发育正常
李际红等: 欧石楠体细胞胚发生和植株再生 1049
(Rodriguez和Wetzstein 1998); 本试验的研究结果
与此相符, 即在欧石楠体胚发生过程中, 生长素使
用IBA获得了较为理想的诱导效果。
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