全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (8): 1126~1134　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.02921126
收稿 2014-06-19　　修定 2014-07-14
资助 国家“863”项目(2013AA102703和2011AA100201)和国
家自然科学基金(31170631和J1103516)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: xinminan@163.com; Tel: 010-62336248)。
影响农杆菌介导的杨树遗传转化技术的因素
陈仲1,*, 廖维华1,*, 王静澄2, 高凯1, 孙吉1, 安新民1,**
1北京林业大学林木育种国家工程实验室, 林木花卉遗传育种教育部重点实验室, 北京100083; 2环境保护部环境规划院, 北
京100012
摘要: 杨属树种是农杆菌的天然寄主之一, 但木本植物一般再生能力较差, 如何提高杨树的遗传转化频率就成为目前研究
者最为关心的问题。本文结合农杆菌介导杨树遗传转化研究的最新进展和我们的实际工作对农杆菌的遗传转化原理、转
移方法、以及影响农杆菌转化的因素进行了全新而深入的论述, 并针对如何提高木本植物的转化频率, 提出了一些改良的
措施和方法。
关键词: 农杆菌; 遗传转化; 杨树; 选择标记; 受体
Factors Influencing Frequency of Agrobacterium-Mediated Populus Transfor-
mation
CHEN Zhong1,*, LIAO Wei-Hua1,*, WANG Jing-Cheng2, GAO Kai1, SUN Ji1, AN Xin-Min1,**
1National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental
Plants of the Ministry of Education, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2Chinese Academy for Environmental
Planning, Ministry of Environmental Protection, Beijing 100012, China
Abstract: Populus is one of natural host of Agrobacterium. Due to the poor regenerative capacity of woody
plants, how to enhance transgenic frequency in poplar is becoming a crucial problem. This review introduced
the principles and methods of Agrobacterium-mediated transformation and discussed the key factors affecting
genetic transformation in Populus, based on the latest progress and our practical work. Finally, this review pro-
vided some improved methods and measures for the improvement of the transformation frequency of woody
plants.
Key words: Agrobacterium tumefaciens; genetic transformation; Populus; selectable marker; acceptor
杨树(Populus spp.)是杨柳科(Salicaceae)杨属
树种的统称, 在世界上栽培面积较大(陈仲等2011),
是我国重要的造林绿化树种, 也是主要的生态防
护林树种, 在国民经济建设中发挥着巨大作用。
由于它速生, 易无性繁殖, 易于基因工程操作, 所
以又是林木基因工程领域的模式树种(Brunner等
2004)。自农杆菌介导的遗传转化技术获得成功以
来, 其在高等植物中得到了广泛的应用。但直到
20世纪80年代中期, 农杆菌转化技术才在杨树中
获得成功。随着科学技术的发展, 杨属中许多树
种都已建立了农杆菌介导的遗传转化体系(Fillatti
等1987; Parsons等1986; Pythoud等1987; Wang等
2011; 李科友等2007a, b)。农杆菌介导的外源基因
转化是菌株本身与植物细胞相互作用的结果, 凡
是能够影响农杆菌侵染能力、植物细胞转化应答
能力以及转化子再生能力的各种因素都会对转化
效果产生影响。本文结合实际工作, 对影响农杆
菌介导的杨树遗传转化的各种因素进行较深入的
分析和探讨。
1 农杆菌介导的遗传转化原理
目前在杨树遗传转化中应用最广泛的是根癌
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens), 它含有Ti质粒,
能诱导植物细胞产生冠瘿瘤。Ti质粒上的毒性区
(Vir区)和T-DNA区与冠瘿瘤的形成有密切关系, 有
至少6种Vir操纵子(VirA、B、C、D、E和G)调节
基因的转移(Zambryski 1992)。VirA和VirG是Vir基
因表达的主控基因, 其中农杆菌侵染木本植物的
能力最主要是由VirA位点决定, VirA是植物细胞释
放的酚类化合物的感受器(Huang等1990), VirA被
陈仲等: 影响农杆菌介导的杨树遗传转化技术的因素 1127
受伤部位释放的酚类物质激活, 自动磷酸化并使
VirG磷酸化, 从而激活其他Vir基因的转录(Stachel
等1985), Vir区基因的活化可以启动T-DNA向植物
细胞的转移, 插入植物基因组中, 使目的基因表
达(图1)。限制杨树转化效率的因素不仅与影响
T-DNA进入靶细胞或靶细胞核内的因素有关, 而
且还与影响T-DNA整合的因素有关, 所以进入细
胞核后的整合是限制植物转化的关键因素之一
(Zupan和Zambryski 1995)。采用农杆菌介导的基
因转移通常只能插入核基因组中, 因此目前报道
成功的转基因植物近80%是由农杆菌介导(施季森
2000)。
2 农杆菌介导的基因转移方法
2.1 共培养法
共培养法是农杆菌介导遗传转化中最常用的,
也是农杆菌转化杨树最基本的方法。用处于对数
期的活跃农杆菌菌液与杨树的外植体进行共培养,
使农杆菌侵染杨树并将外源基因整合到杨树基因
组中(Fillatti等1987)。
2.1.1 共培养时间 我们的实验表明, 2~3 d作为受
体材料与农杆菌共培养的时间较为适宜。时间过
短, T-DNA转移过程不能完成; 时间过长, 农杆菌
在培养基及受体材料表面会过分生长, 不利于植
物外植体的存活和随后抗性愈伤筛选时对农杆菌
的抑制。一般共培养时间应以外植体与培养基接
触处出现淡白色菌落为宜(未发表资料)。
2.1.2 共培养温度 在较低的共培养温度19~22 ℃
条件下, 农杆菌对愈伤组织的转化率最为适宜(Dil-
len等1997)。农杆菌具有最强侵染力的温度并不
是其最适生长温度, 而是其生长较缓慢条件下的
温度, 所以共培养温度多控制在19~25 ℃。然而,
农杆菌介导转化过程中最适共培养温度可能因植
物的种类(或基因型)而异。‘南林杨895’的抗虫转
化实验中, 最佳共培养温度为28 ℃ (房丹2005)。
2.2 农杆菌介导法与其他技术结合
农杆菌介导法与其他技术如基因枪、超声
波、低能粒子束、负压等结合使用, 能够增强农
杆菌侵染效果(毕影东和杨传平2007)。基因枪与
图1 农杆菌介导的遗传转化
Fig.1 Agrobacterium-mediated genetic transformation
参考Pitzschke和Hirt (2010)文献并作修改。植物创伤部位释放信号诱导农杆菌VirA/G区激活, 一方面促进T-DNA合成, 一方面促进其
他Vir基因的表达。通过细菌的T4SS型释放系统将Vir蛋白转化进入植物细胞, 形成T-DNA/Vir蛋白复合物。T-DNA复合物被运输进植物细
胞核, 通过非常规重组整合到植物基因组。
植物生理学报1128
农杆菌介导结合法是先用基因枪轰击植物细胞,
造成创伤, 然后再用农杆菌侵染, 这样有利于提高
转化效率。SAAT法(sonieation-assisted Agrobacte-
rium-mediated transformation)集合了超声波法和农
杆菌介导法的优点, 近年来常被用于提高植物的
转化效率, 并在一些植物(玉米、黄瓜、苦豆子、
花生、苹果和油棕榈等)上取得了成功(陈英等
2005; 刘莉莉2007)。
3 影响农杆菌转化杨树效率的因素
杨树遗传转化的大量实验结果表明, 影响杨
树农杆菌遗传转化效率的主要因素有: 农杆菌菌
株、杨树基因型。此外, 培养基pH值、侵染时菌
液浓度、预培养时间和光照强度等因素也影响了
杨树遗传转化效率(Coleman和Ernst 1990; Mathis和
Hinchee 1994; Sangwan等1992; 贾小明等2011)。
随着组织共培养法获得高效转基因植株的报
道不断出现, 对转化材料、幼胚基因型、组培条
件、菌株、菌液浓度、表达载体等因素的优化,
使杨树的转化效率得到了提高, 这有力地支持了
农杆菌对杨树的遗传转化机理与其他植物相同这
一假说。深入地研究农杆菌转化杨树的分子机理
及影响因素将有利于农杆菌转化杨树技术的进一
步提高。
3.1 农杆菌菌株和载体
菌株和载体的组合与选择在杨树转化中至关
重要。不同的根癌农杆菌菌株具有不同的宿主范
围, 因而不同菌株对同一受体的转化效率存在差
别。在高等植物中, 应用超毒力农杆菌菌株和超
双元载体能增强农杆菌的侵染能力和T-DNA的整
合能力, 较好地克服杨树对农杆菌转化敏感性差
的问题。目前已分离出大量的根癌农杆菌菌株,
但是能有效转化杨树的并不多。常被用于杨树遗
传转化的菌株有普通农杆菌菌株LBA4404和超毒
力菌株EHA101、EHA105等(表1)。常用的载体是
pSB131和pTOK233, 均为超双元载体(super binary
vector), 这些载体都带有高等植物侵染力很强的菌
株A281中的VirB、VirC和VirG基因, 这些超双元载
体对转化杨树是非常有效的。
表1 不同农杆菌菌株转化不同杨树树种
Table 1 Different strains of Agrobacterium spp. used to transform different Populus
农杆菌 菌株 类型 特征 参考文献
A. tumefaciens Ach5 章鱼碱型 野生型, 携带pTiAch5 Fillatti等1987
LBA4404 Ach5 Ti-cured, Rif, Strep Confalonieri等1994; Kajita等1994; Leple等1992
A348 野生型, C58染色体+pTiA6 Parsons等1986
GV2260 C58 Ti-cured Howe等1994
C58 胭脂碱型 野生型, 携带pTiC58 Brasileiro等1992; Charest等1992; Confalonieri
等1994; Donahue等1994; Riemenschneider 1990;
Tsai等1994
C58/pMP90 C58 Ti-cured, Rif, Gm Brasileiro等1992; De Block 1990; Leple等1992
C58SZ707 C58 Ti-cured, Strep Howe等1994
GV3850 C58 Ti-cured携带 Confalonieri等1994; Howe等1994
pGV3850::pKU3
GV3101:TpMP90 C58染色体骨架; Han等2013b; Lee和Gelvin 2008
pTiC58, rif, gent
A281 农杆碱型 超毒力的野生型, C58 Confalonieri等1994, 1997; Klopfenstein等1997;
染色体+pTiBo542, Rif Parsons等1986
A136 C58染色体骨架; pTiC58 cured Anand等2012; Hwang等2013
EHA101 A281 Ti-cured, Rif, Strep, Km Heuchelin等1997; Howe等1994; Tzfira等1997
EHA105 A281 Ti-cured, Rif, Gm Han等1996
Bo542 超毒力的野生型, 携带pTiBo542 Brasileiro等1991
A4 野生型,携带pRiA4b Brasileiro等1991; Charest等1992
A. rhizogenes R1000 C58染色体+pRiA4b Han等1996
R1601 R1000+pTVK291, Km, Cb Han等1996; Pythoud等1987
11325 野生型, 携带pRi11325 Huang等1991

陈仲等: 影响农杆菌介导的杨树遗传转化技术的因素 1129
在Ti质粒、Ri质粒等转化载体系统的基础上,
科学家们又发展了一些新的载体系统, 例如叶绿
体遗传转化系统, 该系统不遵循孟德尔遗传规律,
具有母性遗传、超量表达、后代遗传稳定、定点
整合、不会产生基因沉默和基因漂流等优点(陈英
等2005)。Okumura等(2006)利用叶绿体遗传转化
系统进行携带有gfp基因和壮观霉素(spectinomy-
cin)抗性载体的转化, 获得了具有外源基因高表达
的转基因银白杨(P. alba)。
有研究报道使用胭脂碱型(nopaline) C58和章
鱼碱型(octopine) LBA4404、GV2260根癌农杆菌
转化黑杨无性系, 发现胭脂碱型根癌农杆菌转化
频率明显高于章鱼碱型(Confalonieri等1995)。在
杂种黑杨的遗传转化实验中, 胭脂碱型农杆菌C58
比章鱼碱型农杆菌Ach5和农杆碱型(agropine)农杆
菌A281更易感染美洲黑杨(P. deltoides) (Confaloni-
eri等1994)。因此, 许多研究者在杨树遗传转化过
程中选择使用C58菌株(De Block 1990; Ma等
2004)。但有的杨树对章鱼碱型农杆菌LBA4404的
敏感度也较高, 例如缘毛杨(P. ciliata) (Thakur等
2005)、‘84K杨’ (樊军锋等2002)、银腺杨(张冰玉
等2006)。Han等(2000)对毛果杨(P. trichocarpa)与
美洲黑杨(P. deltoides)杂交种以及美洲黑杨(P. del-
toides)与欧洲黑杨(P. nigra)杂交种的研究表明,
EHA105 (农杆菌型)菌株要优于C58 (胭脂碱型)和
LBA4404 (章鱼碱型)。
3.2 选择性标记基因
选择标记基因可赋予转化细胞除草剂或抗生
素抗性, 它常与目的基因共同转化, 以区分转化和
非转化细胞。常用的选择性标记基因有新霉素磷
酸转移酶基因nptII、潮霉素磷酸转移酶基因hpt、
双丙氨酰磷抗性基因bar等(表2)。其中使用较为
普遍的是nptII (Brasileiro等1992; Confalonieri等
2000; De Block 1990; Fillatti等1987), nptII基因编
码新霉素磷酸转移酶, 能赋予细胞抗卡那霉素(ka-
namycin)的能力。有研究发现使用卡那霉素作为
转基因杨树的抗性选择时, 会经常出现逃逸和嵌
合体植株(Mohri等1999)。Hpt基因只在已经转化
的愈伤组织中表达, 因而通过适当的选择压力, 可
明显地区分已转化和未转化的组织, 是一种非常
有效的选择标记基因(Ow和Medberry 1995)。杨树
品种间潮霉素(Hyg)的内源抗性存在差异, 在用潮
霉素抗性标记进行筛选之前, 需对特定的品种进
行梯度试验, 以确定合适的选择压力。一般将筛
选后阳性愈伤比例为70%~80%的选择剂浓度或在
受体敏感性试验中受体材料在培养4 d左右开始变
褐的选择剂使用浓度定为筛选浓度 ( H o w e等
1994)。
表2 农杆菌转化杨树的不同选择标记基因
Table 2 Different marker genes used to select Populus transformants
标记基因 筛选标记 参考文献
neomycin phosphotransferase (nptII) 卡那霉素 Fillatti等1987; Han等2013a; Howe等1994; Klopfenstein等1991; Weigel和
Nilsson 1995; Zheng等2012; 陈仲等2013; 孙伟博等2013; 王沛雅等2012
hygromycin phosphotransferase (hpt) 潮霉素 Confalonieri等1994; Foster等2014; Howe等1994; Huang等2012; Tuominen
等1995
phosphinotricin acetyl transferase (bar) 磷丝菌素 De Block 1990; Zhang等2012
acetolactate synthetase (crsl-1) 氯磺隆 Borisjuk等2000; Brasileiro等1992; Yao等2013

Igasaki等(2002)首次成功使用除草剂基因
(bar)在杨树遗传转化中作为选择标记, 没有得到
逃逸或者嵌合体植株, 而且转基因植株在外部形
态上没有出现明显的异常。Confalonieri等(2000)
联合使用卡那霉素和除草剂进行选择, 从7株卡那
霉素抗性植株中得到4株抗除草剂植株。由于标
记基因存在许多问题, 如对植物细胞的分化和繁
殖的副作用, 产物的安全性及对环境的影响, 难以
向含有标记基因的转基因植物转入另一个目的基
因等, 建立一套除掉标记基因的可重复多次转基
因的系统, 是人们所渴望的(Matsunaga等2002)。
Zelasco等(2007)用ipt-type MAT vector系统获得了
无选择标记基因的转基因杂种白杨(P. alba cv.
‘Villafranca’), 并且诱导无选择标记植株的频率高
植物生理学报1130
达36.4%, 与其他标记基因相比, ipt-type MAT vec-
tor系统获得的ipt转化植株从表型上就可加以辨
别。
3.3 受体
3.3.1 受体基因型 尽管菌株和载体的组合与选择
在杨树的转化中至关重要, 但也有研究者认为, 主
要影响转化效率的不是菌株 , 而是品种基因型
(Coleman和Ernst 1989; Han等1994)。基因型影响
农杆菌对细胞的附着, 许多试验证明大多数杨树
基因型细胞表面缺乏可供农杆菌识别并与之附着
的位点。由于不同品种及同一品种的不同外植体
组培体系有差异, 且它们对农杆菌的敏感程度不
同, 所以在杨属中仍有一些品种转化效率较低或
不能被转化。毛白杨无性系1285雌株转化率为
1.22%, 毛新杨[(P. tomentosa×P. bolleana)×P. tomen-
tosa]×毛白杨(P. tomentosa)杂种遗传转化率为
2.59%, 毛白杨119雄株转化率仅为0.34%, 另外三
倍体毛白杨的遗传转化率高于普通毛白杨的转化
率(郝贵霞等1999; 赵华燕等2004)。Confalonieri等
(1995)发现, 黑杨无性系Jean Pourtet比另一黑杨无
性系San Giorgio无性系转化率高。De Block (1990)
用C58菌株转化银白杨(P. alba)×欧洲山杨(P. trem-
ula)无性系(clone 357)和毛果杨(P. trichocarpa)×美
洲黑杨(P. deltoides)无性系(clone 064), 转化率分别
为30%~40%和10%。Schlappi和Hohn (1992)通过
农杆菌对幼胚亲和性的研究, 证明感受态的细胞
是农杆菌转化所必需的, 只有那些再生和整合能
力强的感受态细胞才能得到转化植株, 但大多数
杨树的基因型缺乏感受态的细胞。杨树遗传转化
成功的实例较多来自于白杨派的无性系。Fillatti
等(1987)转化白杨派、黑杨派、青杨派的6个无性
系, 只有欧洲山杨和杂种杨NC5339两个白杨派的
无性系成功获得转基因植株。
3.3.2 受体的来源和发育状态 转化外植体的选择
是影响杨树遗传转化的因素之一。转化受体通常
采用来源于幼嫩的组织和器官或分裂旺盛的胚性
愈伤组织。不同来源、部位和发育状态的受体都
会对农杆菌的侵染产生很大影响。杨树的遗传转
化大多选用叶片和茎段, 叶片切口、幼茎段等分
生组织被证明是转化效率较高的受体。大量的杨
树转基因研究表明, 杨树叶片是最好最常用的受
体材料(Confalonieri等1994; De Block 1990; Fillatti
等1987), 一般30 d左右的叶片最适宜转化。但是
也有一些研究表明茎段的诱导率高于叶片, 茎段
较叶片对农杆菌敏感, Tzfira等(1997)就发现茎段
产生的转化愈伤组织较多。愈伤组织是获得转基
因植株的最好来源, 但未见有转化成功杨树的报
道。
3.4 培养基中的添加成分
培养基的添加成分, 主要是一些植物生长调
节剂类物质和信号分子, 如乙酰丁香酮(AS)对杨树
的遗传转化影响很大(Mathis和Hinchee 1994;
Stachel等1985)。酚类物质被认为是诱导Vir基因
表达所必需的, 目前已发现9种能诱导致病基因表
达的酚类物质, 其中AS和羟基乙酰丁香酮(OH-
AS)的作用较强, 在较低浓度时仍可吸引农杆菌。
当杨树不能产生足量的诱导Vir基因表达的酚类物
质, 添加外源信号物质如AS等可大大提高转化效
率。Han等(1997)在用农杆菌介导转化杨树时添加
了100 μmol·L-1的AS, 获得较高的转化频率; 在共
培养过程中添加300~400 μmol·L-1这一较高浓度的
AS, 也明显提高了转化频率。
在AS浓度很低或无AS的情况下, 小分子量的
糖类(如葡萄糖和半乳糖)也可促进Vir区基因的表
达; 葡萄糖与AS或没食子酸的混用在一定程度上
提高了农杆菌的转化效率(Cangelosi等1990)。5%
蔗糖附加一定量的表面活性剂稀释菌液, 能够起
到类似于AS相同的作用使转化频率明显提高(韩
琳娜等2004; 刘斌等2002; 孟亮等2004; 赵强等
2005)。在培养基中添加其他一些物质如2,4-D、
IAA、酪蛋白、精氨酸等也有利于提高农杆菌对
杨树的转化效率。
多胺(腐胺、亚精胺等)是一种生物体中广泛
存在的代谢产物, 广泛参与各种细胞过程; 多胺也
参与植物宿主和病原之间的相互作用(Igarashi和
Kashiwagi 2000)。欧美杨107遗传转化研究表明,
多胺处理的农杆菌使转化材料的GUS瞬时表达增
强, 说明多胺具有提高其稳定转化率的潜力, 并且
经过腐胺处理的叶片所获得的GUS瞬时表达效果
优于亚精胺(祖勇等2008)。
3.5 其他因素的影响
3.5.1 农杆菌浸染浓度和侵染时间 共培养过程中
陈仲等: 影响农杆菌介导的杨树遗传转化技术的因素 1131
细菌的状态和浓度对转化效率的影响很大, 合适
的菌液浓度和侵染时间是遗传转化工作成功的关
键。郝贵霞等(1999)以毛新杨[(P. tomentosa×P.
bolleana)×P. tomentosa]×毛白杨(P. tomentosa)杂种
为材料, 发现当菌液OD600为0.2或者0.4, 侵染时间
10~20 min时, 产生的卡那霉素抗性芽较多, 菌液浓
度和侵染时间过高或者过低时, 产生的抗性芽明
显减少。赵华燕等(2004)研究表明, 三倍体毛白杨
的遗传转化菌液浓度OD600为0.3~0.5, 侵染时间为
15~20 min为宜。农杆菌液浓度过高, 共培养后农
杆菌不能被有效抑制, 而造成共培养的愈伤组织
大量损失; 并且筛选培养基中加入的抑制农杆菌
的抗生素的量要大大增加, 这不仅提高了实验成
本, 而且控菌效果也不理想, 因为农杆菌在平板上
有时会形成生长速度很快的菌落。本课题组研究
结果表明 , 共培养所用农杆菌菌液的OD 600以
0.3~0.6之间为宜, 在这种浓度下, 使用250 mg·L-1的
头孢霉素(cefotaxime)即可有效地控制农杆菌。有
研究表明外植体在转化之前进行预培养, 可增强
植物组织的活性; 预培养时间对叶片转化效率的
影响差异显著, 欧美杨108叶片在侵染前预培养48
或72 h具有较高转化效率(邹莉等2012)。
3.5.2 抑菌抗生素 农杆菌浸染植物后, 一个重要
的环节就是要抑制农杆菌的过度生长, 即需要脱
菌培养。必须有一个适合的抑菌抗生素来杀死农
杆菌, 阻止农杆菌对遗传转化的破坏。抑菌剂(如
头孢霉素、氨苄青霉素以及羧苄青霉素等)的浓度
必须保证有效地抑制农杆菌菌株生长, 同时最大
限度地降低对植物外植体生长的影响 ( L i n等
1995)。头孢霉素对农杆菌有很好的抑制作用, 但
如果过量, 则容易引起伤口细胞褐化, 同时抑制芽
的分化。‘南林895杨’在农杆菌侵染过程中, 使用
浓度为200 mg·L-1的头孢霉素时, 既不会影响‘南林
895杨’叶盘的分化效率, 又能够有效抑制农杆菌的
生长(柴文娴2011)。氨苄青霉素能促进芽分化, 但
是抑制生根。在农杆菌介导的多种杨树的遗传转
化实验中, 氨苄青霉素的浓度最适范围为400~600
mg·L-1, 优选为500 mg·L-1。青海青杨叶片被侵染
农杆菌4 d内向培养基中加入400 mg·L-1羧苄青霉
素, 可以有效地抑制农杆菌的过度繁殖, 对外植体
正常生长影响较小(杜晓艳2010)。
4 展望
近几十年来, 杨树遗传转化技术虽然取得了
很大的进展, 但也存在一些问题, 主要有: (1)基因
转化效率低, 有待于进一步优化基因转化方法和
体系; (2)在过去的转化中, 所转标记基因多, 而目
的基因少, 因而有待于进一步开发出新的抗病、
抗虫及其他具有重要应用价值的目的基因; (3)提
高基因转化效率的研究多, 而有关所转基因的整
合及表达规律的研究少; (4)在农杆菌介导的基因
转化中, 有关细菌与植物细胞相互作用的分子机
制的研究主要在细菌的附着, Ti质粒上致瘤基因的
表达、加工、转移与整合等方面进行了大量的研
究。但是, 有关植物细胞本身在整个基因转化过
程中的行为与作用却很少涉及。
随着对农杆菌转化机理研究的深入以及转化
技术方法的不断提高和改进, 农杆菌介导的杨树
基因转化的优越性将得到更充分的体现。结合我
们的实际工作, 在农杆菌介导的基因转化过程中
应注意选择合适的农杆菌类型、组培性能好的杨
树基因型以及合适的外植体; 改良共培养条件, 调
整菌液的浓度、共培养的时间和温度; 采用合适
的选择标记基因和合适的抗生素及其浓度进行转
化体的筛选。
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