全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 7期，2009年 7月 643
收稿 2009-04-27 修定 　2009-05-27
资助 江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室基金
(HZHL0807)和国家自然科学基金(30671248)。
* 通讯作者(E-mail: qya ng19@nja u.edu.cn, Tel: 025-
84395221; E-mail: wbshenh@njau.edu.cn, Tel: 025-
8 4 3 9 6 5 4 2 )。
外源一氧化碳对盐胁迫下水稻悬浮细胞死亡的缓解效应
王智 1, 陈楚琴 2, 袁星星 1, 徐晟 1, 杨清 1,*, 沈文飚 1,*
南京农业大学 1生命科学学院, 2食品科技学院, 南京 210095
提要: 水稻悬浮细胞经NaCl (0~400 mmol·L-1)处理后, 细胞死亡率随着NaCl浓度的增大和处理时间的延长而上升。50%饱
和度的外源一氧化碳(CO)溶液预处理 3 h可以缓解随后由200 mmol·L-1 NaCl引起的细胞死亡率上升, CO清除剂血红蛋白
(Hb)有逆转CO的保护效应。CO在不同程度上还可以促进超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物
酶(APX)活性的上升或相应基因的表达。
关键词: 盐胁迫; 水稻悬浮细胞; 一氧化碳; 细胞死亡
Mitigative Effect of Exogenous Carbon Monoxide on Cell Death in Rice Sus-
pension-Cultured Cells under Salt Stress
WANG Zhi1, CHEN Chu-Qin2, YUAN Xing-Xing1, XU Sheng1, YANG Qing1,*, SHEN Wen-Biao1,*
1College of Life Sciences, 2Department of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: In this study, the role of carbon monoxide (CO) on reducing cell death rate of rice suspension-
cultured cells was investigated under salt stess. The cell death rate increased with the increasing of NaCl
concentration (0–400 mmol·L-1) and time (3, 6, 12 and 24 h). Pretreatment with 50% saturation of exogenous
CO aqueous solution for 3 h was able to significantly alleviate the elevating cell death rate induced by further 200
mmol·L-1 NaCl treatment. Meanwhile, the above cytoprotective effect of CO could be reversed by the addition
of hemoglobin (Hb), a scavenger of CO. Furthermore, the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase
(CAT) and ascorbate peroxidase (APX) or their related transcripts were also induced by CO in different degrees.
Key words: salt stress; rice suspension-cultured cells; carbon monoxide; cell death
血红素加氧酶 -1 (heme oxygenase-1, HO-1)催
化产生的一氧化碳(carbon monoxide, CO)是一种动
物内源气体信号分子, 在细胞功能和通讯调节中起
作用(Verma等 1993; Dulak和 Jozkowicz 2003)。早
在1959年就发现光照条件下, 绿色植物有直接释放
CO的现象(Wilks 1959)。最近的研究又发现, 一些
非生物胁迫也可以诱导植物中 CO的释放。例如,
镉(Cd2+)能诱导苜蓿根部CO的释放, 并通过调节植
物体内的GSH代谢系统, 缓解Cd2+诱导的氧化伤害
(Han等 2008); Xie等(2008)的研究表明, 盐胁迫也
能引起小麦幼苗根组织的 CO释放, 饱和度为 50%
的CO溶液能够通过上调抗氧化防护系统和维持离
子的稳态而提高其耐盐性。据此, CO在植物体内
的信号作用也引起了关注(陈坚等 2009)。
此外, 植物悬浮细胞由于具有繁殖速度快、
易于培养、受环境因子干扰少、细胞分散性好、
颗粒均一、胁迫处理均匀、不受季节限制等多种
优点, 已在众多生物领域得到广泛应用。本文研究
了 CO预处理对盐胁迫下水稻悬浮细胞死亡的影
响, 并初步分析了几种抗氧化酶活性及其基因表达
的变化。
材料与方法
AA培养基的配方及灭菌方法参照徐林林等
(2006)文中方法, CO气体及饱和溶液的制备方法参
照Liu等(2007)文中方法, 饱和溶液在超净工作台中
用 0.45 μm微孔滤膜过滤灭菌, 然后立即用已灭菌
的AA培养基稀释至实验所需浓度(10%和 50%饱
和度 )。
实验材料为粳稻(Oryza sativa L.)品种 ‘中花
11’。参照徐林林等(2006)文中的方法继代培养悬
浮细胞 3~4 d, 从中吸取 1.5 mL的悬浮细胞液, 加
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入到 12孔的细胞培养板Costar 3513 (美国)并进行
以下处理: (1) Con (Con→Con), 单独用AA培养液
培养; (2) S100, Con+100 mmol·L-1 NaCl; (3) S200,
Con+200 mmol·L-1 NaCl; (4) S400, Con+400 mmol·L-1
NaCl; (5) Con→ S200, AA培养液培养 3 h后, 再加
入 200 mmol·L-1 NaCl; (6) CO10→ S200, 10%饱和
度的CO溶液培养3 h后, 再加入200 mmol·L-1 NaCl;
(7) CO50→ S200, 50%饱和度的 CO溶液培养 3 h
后, 再加入200 mmol·L-1 NaCl; (8) CO50+Hb→S200,
50%饱和度的CO溶液和CO清除剂血红蛋白(Hb,
0.1 g·L-1)溶液培养3 h后, 再加入200 mmol·L-1 NaCl;
(9) Hb→S200, 0.1 g·L-1血红蛋白(Hb)溶液培养3 h
后, 再加入 200 mmol·L-1 NaCl。各处理至少 3个
重复, 每次重复每个处理至少 5孔。
细胞死亡率的测定参照Alex等(1994)文中的
伊文斯蓝(Evans blue)染料法。
CAT和 SOD的测定参照 Liu等(2007)文中方
法; 抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)
的测定参照Nakano和Asada (1981)文中方法。
蛋白质含量的检测参照 Bradford (1976)的方
法, 以牛血清白蛋白(BSA)作为标准。
不同处理下水稻悬浮细胞总 R N A 的提取,
cDNA第一条链的合成以及半定量RT-PCR体系参
照武明珠等(2009)文中方法。引物设计如下: Fe-
SOD (GenBank登录号为AB014056)上游引物 5
TACAACAACGGCAACC 3, 下游引物 5 ATT-
CGCCTGTCATCCT 3 (扩增片段长度为356 bp); Cu/
Zn-SOD-1 (GenBank登录号为D01000)上游引物 5
AATGGTGAAGGCTGTTGCTGT 3, 下游引物 5
TCTAACCCTGGAGTCCGATGA 3 (扩增片段长度
为 461 bp); APX1 (GenBank登录号为D45423)上游
引物 5 AGGAAGGGAGGACAAACC 3, 下游引物
5 TATTACAGAGGCGACTCACA 3 (扩增片段长度
为 515 bp); 肌动蛋白基因(Actin) (GenBank登录号
为NM001057621)上游引物5 CTTCGTCTCGACC-
TTGCTGGG 3, 下游引物5 GAGAAACAAGCAG-
GAGGACGG 3 (扩增片段长度为 667 bp)。以肌
动蛋白基因的相对含量作为内参, 在扩增25~35个
循环后, 10 μL的扩增产物用 1.5% (W/V)琼脂糖凝
胶电泳, 经溴化乙锭染色后检测。采用 Quantity
One软件对各基因相对表达进行条带定量分析, 为
便于比较, 设定对照(Con)表达量为 100%。
实验数据用Duncan’s测验作显著性分析, 数据
中不同的小写字母表示差异达到 P<0.05水平。
结果与讨论
1 不同浓度NaCl对水稻悬浮细胞死亡率的影响
如图1所示, NaCl胁迫下水稻悬浮细胞死亡具
图 1 不同浓度NaCl胁迫对水稻悬浮细胞死亡率的影响
Fig.1 Effects of different concentrations of NaCl on cell
death rate in rice suspension-cultured cells
图 2 不同饱和度的CO溶液预处理对NaCl 胁迫下
水稻悬浮细胞死亡率的影响
Fig.2 Effects of different saturations of CO aqueous
solution pretreatment on cell death rate in rice
suspension-cultured cells under NaCl stress
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有浓度梯度效应。随着NaCl浓度的增加, 悬浮细
胞死亡率显著上升(P<0.05)。此外, 在处理的 24 h
过程中, 不作处理(Con)的悬浮细胞死亡率变化相对
较小, 而各个浓度NaCl处理的悬浮细胞死亡率则随
着处理时间的延长而呈上升趋势。
2 CO溶液对盐胁迫下水稻悬浮细胞死亡率的影响
图 2的结果表明, CO溶液预处理 3 h后, 200
mmol·L-1 NaCl胁迫下的悬浮细胞死亡率显著下降,
饱和度为50%的CO溶液缓解效应比饱和度为10%
图 3 CO溶液预处理对盐胁迫下水稻悬浮细胞中抗氧化酶活性及其基因表达的影响
Fig.3 Effects of CO solution pretreatment on antioxidative enzyme activities and their transcripts in rice suspension-cultured
cells under NaCl stress
的好。200 mmol·L-1 NaCl处理(Con→ S200) 3、
6、12和 24 h的悬浮细胞死亡率呈不断上升趋势;
与之相对应的是, 饱和度为 50%的CO溶液预处理
(CO50→ S200)的细胞死亡率显著下降(P<0.05)。
此外, 表 1的结果也表明, CO清除剂Hb能够
逆转CO对NaCl胁迫下悬浮细胞死亡的缓解效应。
单独的Hb预处理(Hb→S200)的细胞死亡率也明显
比单独的NaCl (Con→ S200)处理的高(P<0.05)。
Hb也是一氧化氮(nitric oxide, NO)的清除剂, 它是
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否参与 CO缓解盐胁迫下细胞死亡的效应, 尚待进
一步研究。
3 CO溶液对盐胁迫下悬浮培养细胞的抗氧化酶活
性及其基因表达的影响
(1)与NaCl (Con→ S200)胁迫的相比, 50%饱
和度的 CO溶液预处理(CO50→ S200)可在不同程
度上增加盐胁迫 3 h和 6 h后水稻悬浮细胞 SOD、
APX和CAT的活性, 与CO缓解盐胁迫下细胞死亡
的趋势相一致。其中, 50%饱和度的 CO溶液预处
理(CO50→S200)的APX活性与NaCl胁迫(Con→
S200)处理各个时间点的差异最为明显(P<0.05), 但
对盐胁迫 6 h的 SOD和CAT活性的效应则不明显
(图 3-a~c)。
(2)半定量RT-PCR的结果(图3-d、e)显示, CO
预处理 3 h后(图 3-d中 CO50→ S200的 0 h) Fe-
SOD和APX1基因的转录水平没有明显变化, 而Cu/
Zn-SOD-1基因的转录水平则表现为下调。与NaCl
胁迫的相比, CO预处理对盐胁迫后水稻悬浮细胞
Fe-SOD和APX1的转录本均有不同程度的上升, 其
中Fe-SOD基因的转录水平在盐处理3 h为受NaCl
胁迫的 1.7倍; 而 Cu/Zn-SOD-1的变化差异则较小
(图 3-e)。
综合以上结果, 我们认为, CO可能通过不同
程度的调节悬浮培养细胞的抗氧化酶活性及其基因
表达来缓解盐胁迫所导致的细胞死亡。
参考文献
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表 1 Hb对CO溶液预处理缓解盐胁迫下
细胞死亡的逆转作用
Table 1 Reversable role of hemoglobin (Hb) on the
alleviating cell death by CO solution pretreatment
in rice suspension-cultured cells
under NaCl stress
细胞死亡率 /%
处理
3 h 6 h
Con→ Con 6.99±0.35e 8.01±0.41e
Con→ S200 16.70±0.83b 19.25±0.81b
CO50→ S200 10.11±0.51d 13.95±0.54cd
CO50+Hb→ S200 16.95±0.65b 18.72±0.94b
Hb→ S200 22.35±1.21a 25.35±1.41a