全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (7): 685~690 685
收稿 2011-01-20　　修定 2011-05-27
资助 高校博士点项目(200803640002)、安徽省“十一五”科技攻
关项目(07010302133)、安徽省棉花产业体系(2010度)、
安徽省教育厅重点项目(KJ2008A044)。
* 通讯作者(E-mail: yjsc01@ahau.edu.cn; Tel: 0551-5786406)。
棕色棉与白色棉缩合单宁单体儿茶素动态变化的比较
胡超, 杨园园, 郭宁, 蔡永萍, 林毅*, 高俊山, 姜家生
安徽农业大学生命科学学院, 合肥230036
摘要: 以棕色棉‘ANL-1’和白色棉‘泗棉3号’为材料, 利用HPLC检测棉纤维发育过程中儿茶素的动态变化, 结果表明: 棉种
皮中的儿茶素含量高于棉纤维中的, 各种儿茶素单体(EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG)的含量在花后30 d迅速下
降, 其中在白色棉纤维中的下降幅度最大; 棕色棉和白色棉发育期棉纤维中儿茶素存在很大差异, 如棕色棉纤维中有EC、
CG, 但在白色棉纤维中却没有发现。初步推断棕色棉与白色棉纤维中缩合单宁结构有较大不同, 可能导致棉纤维颜色发
生差异。
关键词: 棉花; 儿茶素; 缩合单宁; 高效液相色谱
Comparison of Dynamic Changes in Condensed Tannin Monomer Catechins
between Brown Cotton and White Cotton
HU Chao, YANG Yuan-Yuan, GUO Ning, CAI Yong-Ping, LIN Yi*, GAO Jun-Shan, JIANG Jia-Sheng
School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Abstract: The dynamic changes of catechins were detected by HPLC using brown cotton ‘ANL-1’ and white
cotton ‘Simian 3’ (Gossypium spp.) as the materials. The results showed that the contents of total catechins in
seed coat were higher than those in cotton fiber, and that the content of all individual catechins (EGC, EC, EC,
EGCG, GCG, ECG, CG) was declined swiftly on the 30th day after anthesis (DAA). The reduction of the cate-
chin contents was greatest in white cotton fiber. The constituents of catechins in brown cotton fiber were differ-
ent from those in white cotton fiber during development. EC and CG could be found in the brown cotton fiber,
but they were not found in white cotton fiber. It is concluded that there is great difference of condensed tannin
structure between brown cotton fiber and white cotton fiber, and the colour disparity of fiber may be produced
finally due to the difference.
Key words: cotton; catechins; condensed tannin; HPLC
棕色棉在纤维发育中, 由于色素形成和沉积
等过程, 可能会干扰和影响纤维的伸长、纤维素
的合成以及纤维素大分子的排列, 并最终影响棕
色棉纤维的品质(董合忠等2004)。研究棕色棉纤
维中色素的化学性质及其在纤维发育过程中的动
态变化, 对改良棕色棉纤维品质具有重要意义。
但关于棕色棉纤维中色素物质的化学性质, 目前
尚无明确的结论。于伯龄(2002)认为棕色棉纤维
中的色素是翠雀素等花青素类色素, 但提供的依
据较少; 王学德和李悦有(2002)、赵向前和王学德
(2005)证明棕色棉纤维中色素为黄酮类化合物, 或
3-位虽有羟基但被糖甙化的黄酮醇类化合物, 但在
色素鉴定分析时并没有对其进行纯化。从棕色棉
纤维发育过程来看, 棕色棉纤维颜色形成于纤维
发育的中后期阶段, 即30 DAA (days after anthesis)
左右才出现肉眼可见的颜色。而30~40 DAA正值
棉铃开始裂铃, 这期间棉纤维逐渐暴露并与空气
接触, 所以棕色棉的色素形成与棉纤维接触空气
后氧化有关(詹少华等2007a, 2007b, 2006)。根据
本实验室詹少华等(2007a)推断, 棕色棉色素是一
种含有酚羟基的化合物, 属于植物多酚类色素, 是
由原翠雀定和原花青定聚合成的缩合单宁经氧化
而形成的醌类物质。但白色棉在生长发育过程中
研究报告 Original Papers
植物生理学报686
也同样存在缩合单宁, 并且在棉铃裂铃后含量迅
速降低(詹少华等2007b)。
缩合单宁类物质属于植物多酚类的一种, 分
子结构中含有较多的酚羟基, 其中部分酚羟基易
被氧化。此外, 缩合单宁的结构受许多因素的影
响而变化不定(宛晓春2003)。 缩合单宁的生物合
成是由公共苯丙烷途径、核心类黄酮-花青素途
径、缩合单宁特异途径这3个连续的代谢途径构
成的一个复合途径完成的(王晨等2009)。
棉花中缩合单宁的合成在黄烷-3,4-二醇/无色
花青素(flavan-3,4-diol)形成的前期, 其代谢步骤与
其他植物中的相同, 而从黄烷-3,4-二醇/无色花青
素处分成两个分支。一条途径通过无色花青素还
原酶(LAR)直接将黄烷-3,4-二醇/无色花青素转化
成儿茶素/2,3-反式黄烷-3-醇(2,3-trans-2R,3S-fla-
van-3-ols), 但拟南芥缺乏该酶(Dixon等2005); 另一
条途径是通过花青素合成酶(ANS)将黄烷-3,4-二
醇/无色花青素转化成花青素(3-OH-anthocyani-
dins), 再由花青素还原酶(ANR)将花青素转化成表
儿茶素/2,3-顺式黄烷-3-醇(2,3-cis-2R,3R-flavan-3-
ols) (赵文军等2009)。因此, LAR和ANR为缩合单
宁聚合物的合成提供两种独立的途径。在棉铃发
育生长过程中 , 缩合单宁的合成是通过LAR或
ANR两种独立途径, 还是由两种途径共同作用, 其
两种途径合成能力的大小能否改变缩合单宁聚合
体的组成成分及含量, 即缩合单宁聚合体单体成
分——儿茶素的种类及含量是否对棉纤维色素的
合成产生影响, 目前还不太清楚。
因此, 本实验通过高效液相色谱法定性和定
量测定缩合单宁的结构单元(儿茶素), 比较鉴定棕
色棉和白色棉缩合单宁成分的差异, 以期为深入探
讨棕色棉色素的合成机制提供一定的理论依据。
材料与方法
1 实验材料
以本实验室选育的品系深棕色棉‘ANL-1’和
白色棉‘泗棉3号’ (Gossypium spp.)为实验材料, 于
2009年5月种植于安徽农业大学农业园区内, 常规
管理, 开花期选择发育正常、无病虫害植株的中
上部果枝, 上午9:00~11:00对当日花进行挂牌, 每
隔5 d取棉铃, -70 ℃保存。
2 实验方法
2.1 儿茶素的提取
采用乙醇提取法(Shibasaki-Kitakawa等2003)
提取儿茶素时, 取1.0 g种皮/纤维, 加少许石英砂和
3 mL无水乙醇研磨至匀浆状, 2 500×g离心10 min,
吸取上清液, 沉淀加3 mL无水乙醇, 再次离心。重
复3次, 最后以无水乙醇定容至10 mL。加2倍体积
水后, 用等体积的氯仿萃取3次, 水层再用乙酸乙
酯萃取2次, 收集乙酸乙酯层并在70 ℃左右减压干
燥浓缩, 浓缩液用氮气吹干, 得到儿茶素粗品。用
色谱级甲醇溶解并定容至1 mL, -20 ℃保存。
2.2 儿茶素的HPLC分析及含量计算
儿茶素标样来自Sigma公司, HPLC溶剂通过
0.45 μm滤膜过滤, 并通过超声波脱气后使用。采
用Waters高效液相色谱仪; 色谱柱为菲罗门“月神”
系列(250 mm×4.6 mm) C18柱; 紫外/可见光检测器
(型号2489); 流动相为A相0.2%乙酸, B相乙腈; 流
速为1 mL·min-1; 柱温为25 ℃。取上述甲醇溶解样
品5 µL, 进样。每个样品分别测定3次, 以标样色谱
为参照进行。分别取一定量的7种儿茶素标样, 混
合后加甲醇配置成儿茶素混合标样的溶液(浓度分
别为0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025 mg·mL-1),
每个浓度测定3次以上; 利用峰面积与混合标样溶
液系列浓度绘制标准曲线。通过各样品的峰面积
并利用混合标样的标准曲线可得出样品中各儿茶
素的含量, 以1 g样品中含儿茶素的量(mg)来表示。
实验结果
1 儿茶素的HPLC检测分析
用HPLC检测发现在棕色棉和白色棉发育期
中存在着以下不同组分的儿茶素(图1): (+)-表儿茶素
[(+)-epicatechin, EC]、(-)-表没食子儿茶素[(-)-epi-
gallocatechin, EGC]、(-)-表没食子儿茶素3-没食子
酸[(-)-epigallocatechin 3-gallate, EGCG]、(-)-没食
子儿茶素3-没食子酸[(-)-gallocatechin 3-gallate,
GCG]、(-)-儿茶素3-没食子酸[(-)-catechin 3-gal-
late, CG]、(-)-儿茶素[(-)-catechin, C]、(-)-表儿茶
素3-没食子酸[(-)-epicatechin 3-gallate, ECG]。
2 棕色棉与白色棉种皮和纤维中总儿茶素的含量
变化
由图2-A可见, 不论白色棉还是棕色棉, 其种
胡超等: 棕色棉与白色棉缩合单宁单体儿茶素动态变化的比较 687
皮总儿茶素含量平均值均高于纤维中的, 不同发
育时期白色棉和棕色棉种皮总儿茶素含量平均值
分别是其纤维中的1.92和1.67倍。棕色棉与白色
棉总儿茶素含量在棉铃发育期表现出由高变低的
趋势。在5~15 DAA, 种皮与纤维中儿茶素含量均
显著上升, 20~40 DAA又呈下降趋势。15 DAA之
前, 棕色棉种皮儿茶素含量远大于白色棉种皮的,
如在10 DAA时, 棕色棉种皮儿茶素含量为白色棉
种皮的2.53倍。白色棉纤维中儿茶素含量动态变
化与棕色棉纤维相似, 但在25 DAA白色棉纤维中
儿茶素含量急剧下降, 在30 DAA已经检测不出其
存在, 而棕色棉在40 DAA还能检测出来。
3 棕色棉与白色棉种皮和纤维中各种儿茶素单体
的含量变化
不同发育期棕色棉与白色棉种皮和纤维中各
种儿茶素单体的含量变化如图2所示。从图2-B可
见, 棕色棉种皮中的EC动态变化与白色棉相似, 均
表现出由高变低的趋势, EC的高峰出现在10 DAA,
之后随着棉铃的发育, EC含量迅速降低; 白色棉种
皮EC含量在20 DAA达到高峰, 之后迅速下降。棕
色棉纤维中EC含量变化为双峰曲线, 分别在10
DAA和25 DAA出现高峰, 且25 DAA的含量明显
高于10 DAA的; 而白色棉纤维中EC未被检测到。
棕色棉与白色棉中EGC的变化趋势相同, 都
是在20 DAA之前完成积累。在种皮中, 棕色棉
EGC含量的高峰出现在10 DAA, 而白色棉分别在
10 DAA和20 DAA出现高峰; 在棉纤维中, 棕色棉
的EGC含量高峰出现在20 DAA, 白色棉则出现在
15 DAA, 并在之后急剧下降(图2-C)。
如图2-D所示, 棕色棉和白色棉种皮中EGCG
含量的变化趋势相同, 都在15 DAA达到高峰, 随后
迅速下降; 棕色棉和白色棉纤维中EGCG含量高峰
期也出现在15 DAA, 前者在25 DAA略有上升。
棕色棉种皮中GCG含量在10 DAA达到最高
峰, 随后迅速下降; 而在白色棉种皮中, GCG含量
在10 DAA有所下降, 之后迅速上升, 并在15 DAA
达到最高峰。棕色棉与白色棉纤维中GCG含量变
化趋势相同, 在5 DAA开始缓慢上升, 20 DAA达到
最大值, 之后开始迅速下降, 到30 DAA之后, 变化
稳定并保持较低水平(图2-E)。
图1 儿茶素的HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of catechins
A: 白色棉纤维(20 DAA); B: 棕色棉纤维(20 DAA)。EGC: (-)-表没食子儿茶素[(-)-epigallocatechin]; C: (-)-儿茶素[(-)-catechin]; EC: (+)-
表儿茶素[(+)-epicatechin]; EGCG: (-)-表没食子儿茶素3-没食子酸[(-)-epigallocatechin 3-gallate]; GCG: (-)-没食子儿茶素3-没食子酸[(-)-gal-
locatechin 3-gallate]; ECG: (-)-表儿茶素3-没食子酸[(-)-epicatechin 3-gallate]; CG: (-)-儿茶素3-没食子酸[(-)-catechin 3-gallate]。
植物生理学报688
棕色棉种皮与纤维中的CG含量变化趋势具
有较高的相似性, 即在5 DAA之后含量迅速增, 15
DAA达到高峰, 随后迅速下降; 白色棉种皮中的CG
含量明显低于棕色棉中的, 其含量高峰出现在25
图2 不同发育期棕色棉与白色棉种皮和纤维中儿茶素含量的变化
Fig.2 Changes in catechin contents in seed coat and fiber of brown cotton and white cotton during the development
胡超等: 棕色棉与白色棉缩合单宁单体儿茶素动态变化的比较 689
DAA, 并且在白色棉纤维中未检测到CG (图2-F)。
随着棉铃的发育, 棕色棉种皮中C含量缓慢增
加并在15 DAA达到最高峰, 随后呈现下降趋势; 白
色棉种皮中C含量在10~15 DAA有下降趋势, 之后
迅速上升, 20 DAA达到最高峰。棕色棉纤维中C
含量高峰出现在15 DAA; 而白色棉在10 DAA达到
峰值, 随后迅速下降(图2-G)。
种皮中, 棕色棉的ECG含量在10 DAA达到最
高峰, 随后呈现下降趋势; 白色棉中ECG含量在
10~15 DAA有短暂下降, 之后迅速上升并在20
DAA达到最高峰。棕色棉和白色棉纤维中ECG含
量分别在25 DAA和10 DAA达到最高峰(图2-H)。
讨　　论
本实验用HPLC检测, 发现在棕色棉和白色棉
发育期中存在着不同组分的儿茶素, 通过对其含
量的动态变化和部分儿茶素氧化性大小的分析来
探讨白色棉纤维颜色不发生变化的原因。
从我们实验室的前期研究看, 白色棉种皮色
素与棕色棉种皮及纤维中的色素是同一种物质,
其化学物质是通过缩合单宁氧化成醌类物质, 从
而引起颜色的变化(詹少华等2006, 2007a, 2007b)。
可见构成缩合单宁的结构单元——各单体儿茶素
的抗氧化性的大小可能影响或抑制颜色的变化。
虽然白色棉种皮中总儿茶素的变化趋势与棕
色棉相似, 但白色棉与棕色棉纤维中各单体儿茶
素含量的动态变化表现出明显的差异。各发育时
期白色棉种皮各单体儿茶素的含量平均值都要比
棕色棉低, 其中C、EGCG、ECG的值差异极明显,
且在白色棉纤维中并没有发现EC和CG的存在。
在用EC和EGC作为缩合类单宁的模型分子时, 含
EGC结构的缩合类单宁具有最强的抗氧化活性,
而含EC结构的缩合类单宁具有相对较低的抗氧化
活性(张文华和候旭2009)。因此, 在白色棉纤维中
由儿茶素构成的多聚体缩合单宁由于缺乏EC单
体, 使得白色棉纤维中缩合单宁的抗氧化活性大
大提高, 在棉铃裂解时纤维中缩合单宁与空气接
触, 其被氧化的可能性减低。
EGCG是儿茶素中抗氧化作用最强的成分, 而
GCG是EGCG的对映异构体, 因此EGCG和GCG含
量的高低与缩合单宁抗氧化性的大小有显著关系
(Valcic等2000)。研究发现, 棕色棉纤维中EGCG和
GCG总体上都比白色棉纤维中的要高, 因而棕色
棉中聚合生成的缩合单宁的抗氧化性就比较高,
其纤维中缩合单宁就不容易发生氧化, 但这与实
际现象不符。在詹少华等(2007b)的研究中发现,
棕色棉纤维中的色素物质(缩合单宁)是由种皮中
运输到纤维中的, 并且可能与胞间连丝的调节运
输有关(Pourcel等2005)。因此在儿茶素聚合成缩
合单宁之前, 其儿茶素也可能由种皮中运输到纤
维中 , 但之前的转运和聚合的具体机制尚不明
了。综合近年来的研究进展, 儿茶素单体可能先
与谷胱甘肽-S-转移酶结合并运向液泡膜, 再由位
于液泡膜上的多药和有毒化合物排出家族(MATE)
蛋白和H+-ATPase将其跨膜转运到液泡中, 最后由
漆酶等氧化酶类将其缩合成不同聚合度的缩合单
宁(CT)聚合物(Sharma和Dixon 2005; Ruana等
2001)。由于目前对于CG、C、ECG氧化性的大小
并没有确切结论, 因此在影响多聚体缩合单宁结
构可能存在的因素中, 除了合成各单体儿茶素能
力大小以外, 儿茶素的转运、聚合及运输能力的
大小可能都会对多聚体缩合单宁结构产生一定的
影响。
在拟南芥的种皮中缩合单宁的组成完全由
2,3-顺-表儿茶素组成。其野生型种皮的颜色为蓝
色, 如果合成儿茶素的关键酶基因ANS或ANR发生
突变, 其突变体tt18 (ANS mutant)或ban (ANR mu-
tant)的种皮颜色为白色或淡紫色(Abrahams等
2003; Xie等2003; Devic等1999)。由此可以看出,
构成聚合体缩合单宁的单体不同, 会导致缩合单
宁氧化后形成不同的颜色。
本研究表明, 白色棉和棕色棉的种皮中的单
体儿茶素成分都相同, 这与棕色棉与白色棉种皮
颜色相同相一致; 棕色棉纤维中的单体儿茶素与
种皮中的也相同, 只在白色棉纤维中的单体儿茶
素发现有差异; 种皮中的儿茶素含量高于棉纤维
中儿茶素的含量; 各单体儿茶素含量在30 DDA之
后迅速下降, 白色棉纤维中的下降幅度最大。据
此推测: 棕色棉与白色棉中可能由于各单体儿茶
素含量的不同使得缩合单宁聚合体的大小及单体
成分发生差异, 最终导致棕色棉纤维与白色棉纤
维颜色发生差异。
植物生理学报690
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