全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (12): 2201~2206 doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0527 2201
收稿 2015-09-22 修定 2015-11-12
资助 上海市基础研究项目(14JC1405300)、上海市种业发展
项目[沪农科种字(2015)第3号]和大麦青稞产业技术体系
(CARS-05)。
* 并列第一作者。
** 共同通讯作者(E-mail: cs7@saas.sh.cn, Tel: 021-62202965;
E-mail: sw1@saas.sh.cn, Tel: 021-62201032)。
大麦单株小孢子植株再生及胁迫培养研究
郭桂梅1,2,*, 何婷1,2,*, 刘成洪1,2, 高润红1,2, 陈志伟1,2, 徐红卫1,2, 李颖波1,2, 王亦菲1,2, 陆瑞菊1,2,**,
黄剑华1,2,**
1上海市农业科学院生物技术研究所, 上海201106; 2上海市农业遗传育种重点实验室, 上海201106
摘要: 为了建立单株起源的小孢子高频再生体系用于突变体库创制和筛选研究, 以人工气候室种植的大麦为供体材料, 研
究了不同培养批次和不同单株起源对小孢子愈伤诱导和植株再生频率的影响, 以及盐胁迫(500 mg·L-1 NaCl)对单株起源小
孢子培养阶段的筛选效果。结果表明, 大麦单株来源的小孢子的愈伤诱导产量在不同培养批次中出现较大的波动性, 抽穗
进入第15周取材其愈伤产量获得最高, 通过连续培养单株小孢子平均成苗2 035株; 盐胁迫对单株小孢子的愈伤诱导和植株
再生存在显著的抑制作用, 单株平均愈伤产量和绿苗再生率与对照相比分别下降了46%和67%, 不同单株之间的小孢子再
生植株频率存在较大差异。结论: 利用人工可控条件种植的大麦单株, 通过连续小孢子培养可以获得高频率纯合再生植
株; 盐胁迫可以在小孢子培养阶段实现有效筛选。
关键词: 大麦; 单株; 小孢子培养; 盐胁迫; 愈伤诱导; 植株再生
Regeneration from Single Plant via Microspore Culture and Culture Response
to Salt Stress
GUO Gui-Mei1,2,*, HE Ting1,2,*, LIU Cheng-Hong1,2, GAO Run-Hong1,2, CHEN Zhi-Wei1,2, XU Hong-Wei1,2, LI Ying-Bo1,2, WANG
Yi-Fei1,2, LU Rui-Ju1,2,**, HUANG Jian-Hua1,2,**
1Biotech Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China; 2Shanghai Key Laboratory of
Agricultural Genetics and Breeding, Shanghai 201106, China
Abstract: In order to establish an efficiency regeneration system via isolated microspore culture from single
donor plant for future application in creation and screening of mutant population, each barley plant grown in
climate chamber was used as single donor for isolated microspore culture, and the effects of different culture
batches and different donor origins on the callus induction and plant regeneration, as well as the role of salt
stress (500 mg·L-1 NaCl) in the microspore culture were studied. The results showed that the callus production
fluctuated between the culture batches in continuous microspore culture from single donor plant, which reached
the summit at the fifteenth week, and in average 2 035 plants was regenerated from single donor plant. In addi-
tion, salt stress severely repressed the callus induction and plant regeneration, at 46% and 67% decline compar-
ing to control respectively, and the plant regeneration frequency varied between donor plants. Conclusion: It is
applicable to produce homogenous plants with high efficiency from a single donor plant grown in climate
chamber via continuous microspore culture, and salt stress is effective for screening during microspore culture.
Key words: barley; single plant; microspore culture; salt stress; callus induction; plant regeneration
小孢子离体培养技术是目前发展起来的一种
重要单倍体育种技术, 在多种植物中都已开展游
离小孢子培养, 但高频再生体系的建立还仅限于
大麦(Hordeum vulgare L.)、油菜(Brassica campes-
tris L.)、烟草(Nicotiana tabacum L.)、小麦(Triti-
cum aestivum L.)等作物(王建红等2009; Germanà
2011)。陆瑞菊等以大田种植大麦材料为供体植
株, 建立了高效的小孢子再生体系(陆瑞菊等2002;
Lu等2008), 但由于大田环境复杂、受天气等影响
较大, 供体植株生长条件难以控制, 并且只能在当
季获得小孢子培养供体材料 , 取材受季节性限
植物生理学报2202
制。获得健康、无病虫害的供体植株是建立持续
稳定的小孢子培养体系的一个前提条件(Ferrie和
Caswell 2011)。人工气候室种植可在很大程度上克
服大田种植的局限, 提供稳定一致的生长环境, 并
且可以人为调节光、温、水、肥等生长条件, 使供
体植株处于最佳生长状态(Dahleen 1999; Sharma等
2005; Dodig等2010)。利用禾谷类作物具有无限分
蘖的特性, 理论上可以通过单株持续取分蘖实现
游离小孢子连续培养, 这样不仅可以节省温室种
植空间, 而且可以高频率获得单株(或单粒种子)起
源遗传背景完全一致的性状纯合的再生植株。这
一体系建立将为更好利用定向诱导基因组局部突
变(targeting induced local lesions in genomes, TILL-
ING)技术进行反向遗传学研究奠定基础。目前还
未见利用大麦等禾谷类作物单株持续分蘖作为供
体材料开展单株小孢子培养的研究。本文以人工
气候室种植的大麦为供体材料, 利用其单株连续
分蘖取材开展了游离小孢子培养, 并获得了平均
单株成苗2 035株的高再生频率。
小孢子培养阶段结合高盐、低氮等胁迫培
养, 可以在小孢子培养的早期阶段进行基因重组
体的筛选与纯合, 从而减少育种选择的强度和工
作量, 大大提高育种效率(黄剑华等2003; 黄剑华
2007; 万光龙2007)。陆瑞菊等在前期大麦小孢子
培养中, 结合小孢子培养建立了诱变-胁迫培养筛
选方法(陆瑞菊2012; 陆瑞菊等2012), 揭示了单倍
体细胞培养阶段的耐盐性和植株水平的耐盐性存
在一致性(孙月芳等2007; 陆瑞菊等2011), 大田鉴
定结果表明在小孢子培养阶段采用诱变-胁迫措
施可以获得耐逆性提高的育种材料 (顾宏辉等
2003; 程芳芳2014; 陆瑞菊等2014; 王亦菲等
2014)。在小孢子连续培养过程中, 可以同时结合
营养因子、环境因子等逆境胁迫, 在小孢子在脱
分化与再分化、实现细胞全能性过程中对基因重
组体或突变体进行离体筛选, 可获得抗逆性强的
突变体材料, 从而可以利用突变体开展抗逆育种
和机理研究(Rahman等1995; Castillo等2001; Sza-
rejko和Forster 2006)。本文在开展单株来源小孢
子培养基础上, 考察了盐胁迫对单株小孢子愈伤
诱导和植株再生的影响, 确立了合适的小孢子培
养盐胁迫筛选浓度。
材料与方法
1 材料
供试材料为大麦(Hordeum vulgare L.)品种‘花
30’经小孢子培养获得的加倍单倍体(double hap-
loid)株系(编号6-3)的3个小孢子再生植株(编号6-3-
4, 6-3-7, 6-3-23)。大麦‘花30’是由上海市农业科学
院生物技术研究所和浙江省嘉兴农科所利用单倍
体育种技术合作选育的, 目前在长三角地区推广
种植的优质、高产啤酒大麦品种(黄剑华和孔令传
2004)。
2 方法
2.1 人工气候室种植供体植株
大麦3个单株材料用盆钵种植于人工气候室,
光照25 μmol·m-2·s-1, 12 h·d-1, 湿度70%, 温度设置
为光照22 ℃/黑暗18 ℃。
2.2 持续分蘖取材与幼穗预处理
对于人工气候室盆钵种植的3个单株, 通过水
肥调节促进其不断分蘖孕穗, 延长植株的分蘖期,
持续6个多月从单株取材, 选取中部小花小孢子发
育处于单核早–中期的穗子, 剪去叶片(保留上部两
片叶子基部约1.5 cm), 湿纱布包裹放入保鲜袋中,
标号, 放入4 ℃冰箱中进行低温预处理2~4周后, 进
行一个批次的游离小孢子培养, 培养批次依据取
材数量和时间向后依次类推。
2.3 单株起源的游离小孢子培养
小孢子游离方法参照陆瑞菊等(2001)和Lu等
(2008)方法。接种时, 穗子消毒灭菌方法参照郭桂
梅等(2014)。每个试管接4个穗子的花苞, 加入12
mL提取液, 用高速分散器超速旋切。把旋切好的
悬浮液, 用300目筛网过滤, 滤液以700 r·min-1, 5
min低速离心, 重复3次, 收集小孢子。收集到的小
孢子用提取液于25 ℃、黑暗中预处理2 d后再纯化
培养小孢子。培养前小孢子用诱导培养基洗涤1
次, 密度调节至1.0×105个·mL-1, 取1.5 mL小孢子悬
浮液接种于培养皿(30 mm×15 mm)中, Parafilm封
口, 25 ℃, 暗培养。
2.4 提取液、培养基与盐胁迫处理
提取液含有甘露醇60 g·L-1, 添加1.1 g·L-1
CaCl2、0.976 g·L
-1 MES和20 mg·L-1秋水仙碱, pH 5.8。
诱导培养基以N6培养基为基本培养基, 铁盐
加倍, 添加90 g·L-1麦芽糖、0.5 mg·L-1 KT、1.0
郭桂梅等: 大麦单株小孢子植株再生及胁迫培养研究 2203
mg·L-1 2,4-D、0.976 g·L-1 MES、400 mg·L-1水解干
酪素及1 600 mg·L-1谷氨酰胺, pH 5.8, 作为正常诱
导培养基, 盐胁迫诱导培养基是在正常诱导培养
基的基础上添加500 mg·L-1 NaCl。
分化培养基以2/3MS为基本培养基, 添加30
g·L-1麦芽糖、0.5 mg·L-1 6-BA、1.5 mg·L-1 KT及0.05
mg·L-1 NAA, 用5.5 g·L-1琼脂粉固化培养基, pH 5.8。
壮苗培养基以1/2MS为基本培养基, 添加30
g·L-1蔗糖、0.05 mg·L-1 NAA、4.0 mg·L-1多效唑,
用5.5 g·L-1琼脂粉固化培养基, pH 5.8。
提取液和诱导培养基为过滤灭菌, 分化培养
基和壮苗培养基为0.11 Mpa、121 ℃高温高压灭
菌15 min。
2.5 生长统计指标和数据处理
愈伤产量: 小孢子培养18 d时转移至分化培养
基的愈伤组织质量, 培养皿吸尽液体培养基后采
用电子天平称量, 用mg·皿-1表示;
绿苗产量: 每100 mg愈伤组织分化出的绿苗
数, 用株表示;
所有试验结果采用Microsoft Excel 2010、DPS
数据处理系统进行分析。
实验结果
1 不同培养批次对单株来源小孢子愈伤诱导的影响
从14个正常小孢子培养批次(总共18个, 第3
批次因污染无数据, 第8、9、10批次为盐胁迫培
养, 均未包括在内)来看, 大麦单株来源的小孢子的
愈伤产量在连续培养中出现较大的波动性, 小孢
子愈伤产量随人工气候室供体植株的抽穗取材时
间呈先增加后降低、不断反复的规律(图1)。比较
14个连续培养批次, 其中第13批次(抽穗进入第15
周)愈伤产量最高, 与第12批次外其他批次间均存
在显著差异(Duncan’s多重比较, P<0.05); 第7批次
愈伤产量最低, 与第13批次愈伤产量相差近5倍。
2 盐胁迫对单株来源小孢子愈伤诱导和植株再生
的影响
盐胁迫对单株小孢子的愈伤诱导和植株再生
具有明显抑制作用, 平均愈伤产量和绿苗产量分
别下降了46%和67%。对于本研究的3个单株材料,
单株6-3-4来源的小孢子诱导愈伤产量无论在正常
诱导培养还是盐胁迫诱导培养条件下, 都要显著
低于另外2个单株(图2); 但绿苗产量在两种培养条
件下都与另外2个单株差异不显著(图3)。
3 不同单株来源小孢子再生植株频率比较
通过人工气候室种植大麦单株连续6个多月
不断取材进行小孢子培养, 经过18次连续培养(包
括盐胁迫培养), 3个单株都累计获得了高频再生植
株(图4), 平均单株成苗数为2 035株, 其中单株6-3-7
成苗数最高 , 达3 139株 ; 单株6-3-4成苗数达
1 845株; 单株6-3-23成苗数最少, 为1 122株。其单
株小孢子培养的愈伤组织形成及植株再生过程如
图5所示。
图1 连续小孢子培养批次间愈伤产量变化
Fig.1 Fluctuation of callus production between batches in successive microspore culture
植物生理学报2204
讨 论
利用人工气候室种植小孢子培养供体材料,
一方面可以克服取材的季节性限制长期开展小孢
子培养研究, 另一方面也避免了大田环境条件大
幅度变化对小孢子培养带来的影响, 从而可以在
相对一致条件下比较取材时间、外界胁迫对小孢
子培养的作用。本研究中, 大麦单株来源的小孢
子愈伤产量在连续培养中出现较大的波动性, 有
两个峰值出现, 第一个峰值出现在第4批次(抽穗进
入第4周时), 其愈伤产量相对较高; 第二个峰值出
图5 单株小孢子培养的愈伤组织形成及植株再生
Fig.5 Callus formation and plantlet regeneration in microspore culture
图2 正常培养和盐胁迫培养条件下3个不同单株来源小孢子诱导愈伤产量
Fig.2 Callus yields induced via microspore culture from 3 different donor plants under normal and salt stressed conditions
图3 正常培养和盐胁迫培养条件下3个不同单株来源小孢子再生绿苗产量
Fig.3 Green plant yields regenerated via microspore culture from 3 different donor plants under normal and salt stressed conditions
图4 3个不同单株连续小孢子培养累计绿苗产量
Fig.4 Accumulative green plant yields of successive
microspore culture from 3 different donor plants
郭桂梅等: 大麦单株小孢子植株再生及胁迫培养研究 2205
现在第13批次(抽穗进入第15周时), 其愈伤产量最
高。这可能与大麦的一次分蘖、二次分蘖成穗特
性有关, 将有待于进一步的研究。此外, 本研究所
使用的3个单株虽然来自于同一个纯合株系6-3, 但
仍可观察到6-3-4单株来源的小孢子诱导愈伤产量,
无论在正常诱导培养还是盐胁迫诱导培养条件下
都要显著低于另外2个单株, 而绿苗产量并无显著
差异, 这提示单株之间小孢子培养反应仍然存在
一定差异, 这种差异在小孢子的愈伤诱导阶段可
能表现更为明显。小孢子的愈伤诱导阶段就是小
孢子启动胚状体发育途径的过程, 该过程受复杂
的分子机制调控(Touraev 1997; Seguì-Simarro和
Nuez 2008; Chang等2011), 单株个体间是否存在这
种调控差异仍有待于深入研究。
盐胁迫是目前世界范围内作物生长所面临的
一类主要的非生物胁迫, 对农业生产往往造成严
重威胁, 使作物减产, 带来巨大经济损失(张飞等
2009; Joseph和Jini 2010; Ladeiro 2012)。大麦在禾
谷类作物中具有较好的耐盐性, 并且适应性广、
营养价值高 , 在世界范围内有广阔的种植面积
(Saisho和Takeda 2011)。开展大麦的盐胁迫培养研
究将会对其他禾谷类作物的耐盐性改良提供借
鉴。本文通过单株小孢子培养中添加500 mg·L-1
NaCl可对小孢子的愈伤诱导和植株再生产生近半
数的抑制率, 表明该浓度作为小孢子培养中的盐
胁迫选择压是非常有效的, 可用于小孢子连续培
养中进行耐盐、耐逆突变体的早期筛选。
本研究通过大麦小孢子连续培养平均单株成
苗千株以上, 并通过云南自交繁殖, 95%以上可以
结实收获种子形成永久DH株系保存。在此高效单
株小孢子再生成苗基础上, 可进一步结合诱变-胁
迫培养, 开展单株起源的小孢子再生突变体创制
和耐逆筛选研究。
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