全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (1): 91~96 9 1
收稿 2010-10-25 修定 　2010-11-23
资助 国家自然科学基金项目(30 9 00 0 9 9)、湖南省自然科学
基金项目(09JJ3052)和湖南湖南省教育厅青年基金项目
(0 3 B0 1 1 )。
* 共同通讯作者(E-mail: langtaoxiao@163.com, zqm8051@
hunau.net; Tel: 0731-84635260)。
商陆高亲和性K+转运体基因 PaHAK1的克隆与表达分析
蔺万煌 1, 马立英 1, 苏益 1, 黄志刚 1, 萧浪涛 1,*, 周清明 2,*
湖南农业大学 1植物激素与生长发育湖南省重点实验室, 2农学院, 长沙 410128
摘要: 为了研究高钾植物商陆高亲和性K+吸收机制, 本试验选用野生商陆为材料, 以拟南芥、冰叶日中花、小麦、大麦和
水稻等多种植物的 HAK家族基因的保守序列, 设计简并引物, 获得了 981 bp的 PaHAK1的基因片段。然后应用RACE技
术克隆到PaHAK1基因序列, 其 cDNA全长为2 337 bp, 编码771个氨基酸。该编码蛋白质分子量为86.66 kDa, 等电点为7.54。
蛋白质疏水性和拓扑结构分析显示该氨基酸序列共有12~13个跨膜区。该cDNA序列与冰叶日中花HAK1基因序列相似性
高达 88%。Real-Time PCR分析表明PaHAK1主要在商陆根中表达, 低钾状态可以诱导PaHAK1的高表达。
关键词: 商陆; 高亲和性K+转运体; 基因克隆; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of High-Affinity Potassium Transporter Gene
PaHAK1 from Phytolacca acinosa Roxb.
LIN Wan-Huang1, MA Li-Ying1, SU Yi1, HUANG Zhi-Gang1, XIAO Lang-Tao1,*, ZHOU Qing-Ming2,*
1Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development, 2College of Agronomy, Hunan Agricultural
University, Changsha 410128, China
Abstract: To study the mechanism of high affinity potassium absorption in some high-K plants, the PaHAK1
cDNA fragment of 981 bp sequences was cloned from wild Phytolacca acinosa Roxb. by polymerase chain
reaction with degenerate primers designed according to conserved HAKs cDNA sequences of Arabidopsis
thaliana, Mesembryanthemum crystallinum, Triticum aestivum, Hordeum vulgare and Oryza sativa. The full-
length cDNA sequences of PaHAK1 was 2 337 bp which was isolated with rapid amplification of cDNA ends
method. The deduced protein was 771 amino acids with molecular weight 86.66 kDa and isoelectric point 7.54.
Hydrophobicity plot and topology prediction results indicated the protein had 12–13 putative transmembrane
regions. Blastn results showed it was 88% homology to HAK1 of Mesembryanthemum crystallinum. The Real-
Time PCR results showed the PaHAK1 was mostly expressed in root of the plant and it could be induced in the
low potassium condition.
Key words: Phytolacca acinosa Roxb.; high-affinity potassium transporter; gene cloning; expression analysis
钾是植物生长发育必需的大量元素, 它在维持
植物体内酶的活性、渗透平衡、气孔运动、细
胞伸长和抗逆性等方面具有重要作用。植物主要
通过钾离子通道(Lebaudy等2007)和钾离子转运体
(Gierth和Maser 2007)从外界吸收钾, 但当植物处
于低钾环境时, 高亲和性K+转运体(high-affinity po-
tassium transporter, HAK)在植物吸钾过程中发挥了
主要作用(Banuelos等2002)。植物高亲和性K+转运
体是一个大家族, 包括KUP/HAK/KT, 大麦(Hordeum
vulgare L.)中的HvHAK1是第一个从绿色植物中克
隆的高亲和性K+ 转运体基因(Santa-Maria等1997),
目前已从拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、水稻
(Oryza sativa L.)、小麦(Triticum aestivum L.)、蚕
豆(Vicia faba L.)、冰叶日中花(Mesembryanthemum
crystallinum L.)和芦苇(Phragmites australis L.)等植
物中克隆到了多个HAK (Fu和 Luan 1998; Kim等
1998; Rubio等 2000; Maser等 2001; Takahashi等
2007a), 仅拟南芥中就发现了 13个(Chen等 2008),
水稻中则有多达 28个 HAK相关基因(Gupta 等
2008)。Banuelos等(2002)等研究发现HAK家族的
成员可能与根部高亲和性K+ 的吸收有关, 拟南芥中
的AtKUP1和AtHAK5及水稻中的OsHAK1 等已被
植物生理学报9 2
证实介导了高亲和性K+ 吸收及其动态平衡(Banuelos
等 2002; Chen等 2008; Gupta等 2008)。HvHAK1
基因在根部特异表达, 低钾可以诱导其高表达
(Rubio等 2000)。
相对同一生长环境的其他植物, 商陆具有体内
含钾量高、耐低钾生长的特性(胡笃敬等 1993), 可
用作绿色钾肥, 这暗示着商陆体内可能含有更加高
效的K+吸收机制。本试验以野生商陆为材料, 利
用 3和 5 RACE技术从商陆根中克隆高亲和性K+
转运体PaHAK1基因全长cDNA序列, 并应用Real-
Time PCR技术分析 PaHAK1的表达差异, 为进一
步研究PaHAK1基因功能和植物高效K+吸收机制
奠定基础。
材料与方法
1 试验材料
商陆(Phytolacca acinosa Roxb.)为商陆科野生
植物, 又名山萝卜, 多生长在我国南方山坡荒地。
本试验中所用商陆种子采自湖南农业大学实验农场
周边荒地。
2 试验方法
2.1 商陆的培养
商陆种皮硬实, 极难直接发芽, 需先用98％的
浓硫酸浸泡 10~15 min (孙雨珍等 1995), 浸种 48 h
后在(25±1) ℃、黑暗条件下催芽 3 d; 种子萌发后
撒播于营养土中, 生长 14 d后, 选取生长一致的幼
苗在持续通气条件下进行水培。特异性表达分析
的诱导条件如下, 首先在完全的Hoagland营养液中
预培养 14 d, 然后改变Hoagland营养液中KNO3浓
度再培养 10 d, KNO3浓度梯度设置为: 0、10、
50和400 μmol·L-1, 每种浓度设3组重复, 每组6株苗。
2.2 商陆组织RNA的提取
采用 Trizol (Invitrogen)法提取纯化商陆根、
茎、叶组织中的总 RNA, 具体步骤参照试剂盒说
明书。
2.3 PaHAK1 cDNA片段克隆
从GenBank中检索到拟南芥(AF029876)、冰
叶日中花(AF367864)、水稻(AJ427972)等多种植
物的高亲和性K+ 转运体HAKs的氨基酸序列, 并利
用 ClustalW/X (1.83)软件进行多重序列比对分析
(Thompson等 1994), 找出不同植物HAK的保守序
列, 然后在 Primer Premier 5上设计一对 PCR简并
引物(Rozen和 Skaletsky 2000) (表 1中 P1和 P2)。
引物由北京奥科生物有限公司合成。
cDNA第一链的合成按照试剂盒(Promega)说
明进行, 模板用低钾(10 μmol·L-1 K+)处理的商陆幼
苗根组织总RNA, RT-PCR体系和条件为: 1 μL RNA
(1 μg·μL-1), 1 μL Oligo(dT)15 (0.5 μg), 8.5 μL H2ODEPC,
稍加离心后在 70 ℃保温 10 min, 再放入冰中 5
min。依次加入 4 μL MgCl2 (25 mmol·L-1), 2 μL
10×RT Buffer, 2 μL dNTP Mix (10 mmol·L-1), 0.5 μL
RNase Inhibitor (40 U·μL-1), 0.5 μL AMV RT (30
U·μL-1), 1 μL H2ODEPC, 并将反应混合液置于42 ℃保
温 1 h。
第二链合成体系为: 20 μL cDNA第一链反应
物(含 dNTP Mix), 4 μL MgCl2 (25 mmol·L-1), 8 μL
10×RT Buffer, 5 μL P1 (10 mmol·L-1), 5 μL P2 (10
mmol·L-1), 2.5 μL Taq 酶(2.5 U·μL-1)及补充 ddH2O
至终体积 100 μL。条件为: 94 ℃ 预变性4 min, 94 ℃
变性30 s, 54 ℃ 退火30 s, 72 ℃ 延伸1.5 min, 35个
循环; 72 ℃ 延伸 10 min。
采用上海生物工程技术服务有限公司的
UNIQ-10柱式DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物,
将目的片段连接到 pMD18-T载体中, 并送上海生
物工程技术服务有限公司进行测序。
2.4 PaHAK1 cDNA 5端和 3端序列的克隆
根据已获得的PaHAK1 cDNA片段设计RACE
特异引物(表 1中 5R和 3F), 反应体系和具体操作
步骤参照RACE试剂盒(Takara)使用说明。凝胶回
收试剂盒回收5 RACE和3 RACE的PCR产物, 并
连接到 pGEM-T vector (Promega)上, 菌落 PCR鉴
定后送上海生物工程技术服务有限公司进行测序。
5、3 RACE获得 PaHAK1基因 5 和 3 端片段后,
用 BioEdit拼接出全长 cDNA序列。
2.5 PaHAK1的生物信息学分析
应用BioEdit (7.0.5.3)软件进行片段拼接, 应用
ClustalW/X (1.83)软件进行序列比对, NCBI中
BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)在线工具进行
核酸和氨基酸序列相似性分析, 并通过膜蛋白在线
分析工具 TopPred (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/
portal.py?form=toppred)进行疏水性和拓扑结构分析。
蔺万煌等: 商陆高亲和性K+转运体基因 PaHAK1的克隆与表达分析 9 3
2.6 Real-Time PCR
根据多种植物的肌动蛋白保守区域设计一对
简并引物 P5和 P6 (表 1), 获得内参基因(PaActin)
片段并设计内参引物 P7和 P8 (表 1)。采用大连宝
生物工程(Takara)公司的一步法 Real-Time PCR试
剂盒, 进行Actin与目的基因(引物为表1中的P3和
P4)同机分管扩增, 反应体系如下: 10 μL 2×One Step
SYBR RT-PCR Buffer Ⅲ, 0.4 μL TaKaRa Ex Taq HS
(5 U·μL-1), 0.4 μL PrimeScriptTM RT Enzyme Mix II,
0.4 μL PCR Forward Primer (10 mmol·L-1)(P3/P7),
0.4 μL PCR Reverse Primer (10 mmol·L-1) (P4/P8),
0.4 μL ROX Reference Dye, 2 μL Total RNA, 9 μL
RNase Free ddH2O, 总体系为 20 μL。42 ℃ 5 min,
95 ℃ 5 s进行反转录, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 40个循
环进行 PCR。其中, 模板为不同K+浓度水培的商
陆幼苗根、茎和叶组织的总 RNA。
表 1 PCR引物序列
Table 1 PCR primer sequences
用途 引物名称 碱基序列(5→ 3)
PaHAK1 cDNA保守片段的克隆 P 1 ATGACAATGG(A/C/G)GAAGGTGGAA
P 2 AACCGATAGT(A/C/G)ACAGCAAGACA
PaHAK1 cDNA 5端序列的克隆 5R GTACATGCAACTGGGAGTTCAA
PaHAK1 cDNA 3端序列的克隆 3F CAGGGACATTCTCAATCATCAA
PaHAK1荧光定量 PCR引物 P 3 TAACAATCCAATCAAGAAAGAGTCA
P 4 TAATGTCCAAAACACAAATGATAGA
商陆 PaActin基因的克隆 P 5 GTGGTCGTACAAC(A/T)GGTATTGTG
P 6 GA(A/C/T)CCTCCAATCCAGACACTG
PaActin荧光定量 PCR引物 P 7 CTTGACTTTGAGCAGGAATCGGAGA
P 8 ACCTGCTGCTTCCATACCTATCAAT
图 1 DNA电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis pattern of DNAs
A: 商陆组织总 RNA提取电泳图谱; B: PaHAK1基因片段; C: 3RACE的扩增产物; D: 5RACE扩增产物; E: PaActin基因片段。
结果与讨论
1 PaHAK1基因 cDNA中间保守序列的克隆
商陆组织总RNA提取结果如图1-A所示。以
简并引物 P1和 P2配对进行PCR, 获得商陆高亲和
性K+ 转运体基因 PaHAK1 cDNA序列中间保守片
段(图 1-B), 片段长度为 981 bp, GenBank登录号为
AY879592。BLAST结果表明PaHAK1与冰叶日中
花的HAK1相似性可达88%。应用ClustalW/X (1.83)
软件对商陆 PaHAK1、冰叶日中花McHAK1和拟
南芥 AtHAK5进行序列比对, 结果如图 2所示, 表
明已克隆出PaHAK1片段与其他植物的HAK基因
的同源性较高。
2 商陆高亲和性K+转运体基因PaHAK1全长cDNA
序列的克隆
以 cDNA为模板, 3 F (表 1)为特异正向引物
进行 3 RACE反应, 获得了 1 224 bp的条带(图 1-
植物生理学报9 4
C); 以5 R (表1)作为5 RACE反应的反向引物, 得
到 483 bp的DNA序列(图 1-D)。然后应用BioEdit
软件对克隆到的 3个DNA片段(981 bp、1 224 bp
和483 bp)进行分析和拼接, 获得商陆HAK1基因全
长 cDNA序列, 其碱基序列长 2 337 bp, 该基因编
码的蛋白质含有 771个氨基酸残基, PI为7.54, 分
子量为 86.66 kDa。该基因全长 cDNA序列在
GenBank数据库中的登录号为AY919346。
通过NCBI中的在线工具进行序列比较分析
(图3), 商陆PaHAK1与冰叶日中花McHAK1序列相
图 3 商陆(PaHAK1)、冰叶日中花(McHAK1)和拟南芥(AtHAK5) HAK转运体氨基酸序列的比对
Fig.3 Alignments of some HAK transporters amino sequences among Phytolacca acinosa (PaHAK1), Mesembryanthemum
crystallinum (McHAK1), and Arabidopsis thaliana (AtHAK5)
图 2 商陆(PaHAK1)、冰叶日中花(McHAK1)和拟南芥(AtHAK5) HAK基因序列的部分比对结果
Fig.2 Alignments of HAKs among Phytolacca acinosa (PaHAK1), Mesembryanthemum crystallinum (McHAK1), and
Arabidopsis thaliana (AtHAK5)
蔺万煌等: 商陆高亲和性K+转运体基因 PaHAK1的克隆与表达分析 9 5
图 4 商陆HAK1转运体蛋白的疏水性分析
Fig.4 The hydrophobicity plot of Phytolacca acinosa HAK1
似性达90%, 与其他植物的HAK转运体的同源性也
较高, 由此确定本试验中已克隆的商陆cDNA全长
序列为高亲和性K+转运体HAK基因。通过对蛋白
质进行疏水性和拓扑结构分析 (图 4、图 5), 结果
显示该蛋白质氨基酸序列为一典型的疏水蛋白结构
组成, 疏水氨基酸占总氨基酸组成 41.1%, 共有
12~13个跨膜区和2个大的极性连接环(P-loop), 分
子进化分析表明跨膜区氨基酸序列从单细胞的酵母
到高等植物间存在保守性。
3 PaHAK1的特异性表达分析
利用简并引物克隆到了557 bp长的PaActin基
图 5 商陆HAK1转运体蛋白的拓扑结构分析
Fig.5 The topology prediction of Phytolacca acinosa HAK1
L1: 连接环长度; KR: 赖氨酸和精氨酸的数目。
图 6 商陆不同组织基因表达的相对含量
Fig.6 Relative expression level of gene in different
tissues of Phytolacca acinosa
因片段(图 1-E), 通过BLAST发现该片段与其他植
物的 Actin基因的相似性很高。配制 Real-Time
PCR反应混合液, 以Actin为内参基因, 每个样品设
3个重复, 在ABI7900高通量实时荧光定量PCR系
统中进行反应。反应所得溶解曲线峰值单一(文中
未列出), 表明目的基因的特异性良好, 能够较准确
的反映出所扩增基因的相对表达量。
由图6可以看出PaHAK1基因在根中的表达高
于在茎中的表达, 远远高于在叶中的表达, 这说明
PaHAK1基因主要在商陆根中表达, 其功能可能就
是参与根对K+的高亲和吸收。大麦HvHAK1是大
肠杆菌和酵母的HAKs的同源基因, 当HvHAK1在
酵母K+吸收缺失突变体中表达时, 酵母突变体能在
低K+ (0.1 mmol·L-1)条件下正常生长。HvHAK1仅
在大麦根中表达, 当生长在缺 K + 的介质中时,
HvHAK1的表达量比生长在 1 mmol·L-1 K+的介质
中的表达量至少高 5倍, 说明HvHAK1介导了高亲
和的K+吸收(Santa-Maria等 1997)。同样, 缺钾和
低钾水平能诱导 AtHAK5高表达, 从而促进植物对
K+的吸收(Qi等 2008; Pyo等 2010)。另外, 水稻
植物生理学报9 6
HAK1 (Banuelos等2002)、辣椒(Capsicum annuum)
HAK1 (Martínez-Cordero等 2004)和芦苇 HAK5
(Takahashi等 2007b)也具有类似的功能。图 6中
表明, 在根中, PaHAK1基因的表达受钾离子浓度
的影响, 随着K+浓度的升高, 其表达量明显降低, 缺
钾和低钾能诱导 PaHAK1基因的高表达。而在商
陆茎叶中, K+浓度对PaHAK1基因表达的影响没有
明显的规律, 从而可以初步证明PaHAK1是一个高
亲和性K+转运体, 其可能在低钾情况下参与钾离子
吸收和转运, 具体的功能和在钾离子吸收和转运中
发挥的作用还需要进一步加以验证。
商陆植株含钾量高, 具有耐低钾特性, 是一种
野生高钾资源植物, 其钾素营养相关基因有待挖掘
和利用。克隆商陆高亲和性 K+转运体相关基因,
分析其功能结构, 可望进一步揭示高亲和性K+吸
收、转运机制和耐低钾机制, 为最终利用商陆等野
生高钾植物基因资源进行农作物钾素营养遗传改良
提供有益的参考, 从而弥补我国土壤供钾普遍不足
和缓解我国钾肥供需矛盾。
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