全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (11): 1197~1204 1197
收稿 2013-10-10　　修定 2013-10-29
资助 国家大麦、青稞产业技术体系(CARS-05)、上海市科委基
础研究重点项目(12JC1407800)和上海市种业发展项目[沪
农科种字(2012)第7号]。
* 共同第一作者。
** 共同通讯作者(E-mail: cs7@saas.sh.cn; Tel: 021-62202965;
E-mail: sw1@saas.sh.cn; Tel: 021-62201032)。
大麦氮敏感基因型苗期对氮饥饿的生理响应
徐红卫1,*, 王亦菲1,*, 刘成洪1, 陈志伟1, 杜志钊1, 高润红1, 郭桂梅1, 何婷1, 邹磊1, 卜姝明2, 黄亦
辰2, 陆瑞菊1,**, 黄剑华1,**
1上海市农业科学院生物技术研究所, 上海市农业遗传育种重点实验室, 上海201106; 2上海海洋大学水产与生命学院, 上海
201306
摘要: 以大田试验获得的大麦氮敏感基因型BI-45为材料, 利用溶液培养方法, 测定了苗期株高、根长、叶绿素含量、含氮
量、谷氨酰胺合成酶和硝酸还原酶活性, 以及与氮代谢相关的基因(GS1_1、GS1_2、GS1_3、GS2、Nar1、NRT2.1、
NRT2.2、NRT2.3和NRT2.4)的表达。结果表明: 相对于正常供氮, 氮饥饿胁迫下, BI-45根和叶中的氮素利用率提高, 含氮量
降低, 叶绿素含量减少, 根冠比增加; 叶片中的谷氨酰胺合成酶活性和硝酸还原酶的活性高于根, 但是, 与叶中的相比, 根中
的谷氨酰胺合成酶活性升高及硝酸还原酶活性降低的差异性更显著; 与正常供氮相比, 氮饥饿处理下, 根中基因GS家族, 基
因Nar1和硝酸盐转运蛋白基因NRT2家族的相对表达量皆达到显著性差异, 其中GS1_1、GS1_2和NRT2.2在苗期大麦氮饥
饿处理下表现尤为突出, 并且在6 h都有上调表达。
关键词: 氮饥饿; 氮素利用率; 谷氨酰胺合成酶; 硝酸还原酶; 硝盐酸转运蛋白
The Physiological Responses of a Nitrogen Sensitive Genotype to Nitrogen
Starvation in Barley Seedlings
XU Hong-Wei1,*, WANG Yi-Fei1,*, LIU Cheng-Hong1, CHEN Zhi-Wei1, DU Zhi-Zhao1, GAO Run-Hong1, GUO Gui-Mei1, HE
Ting1, ZOU Lei1, BU Shu-Ming2, HUANG Yi-Chen2, LU Rui-Ju1,**, HUANG Jian-Hua1,**
1Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding, Biotech Research Institute, Shanghai Academy of
Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China; 2College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai
201306, China
Abstract: In this study, using nitrogen sensitive genotype BI-45 of barley obtained from field experiments, we
investigated the morphological, physiological and molecular responses, such as stem length, root length,
chlorophyll content, nitrogen content, glutamine synthetase activity, nitrate reductase activity and the expression
of several genes related to N uptake and assimilation. The results showed that nitrogen use efficiency and the
ratios of shoot and root increase while chlorophyll and nitrogen content decrease under N starvation. Both GS
and NR activities were higher in leaves than those in roots. However, compared with leaves, significant
differences can be found in roots, that is, N starvation increased GS activity but decreased NR activity. In
addition, genes (GS family, Nar1 and NRT2 family) in the roots also showed more significant differences,
especially GS1_1, GS1_2, and NRT2.2 which were all up-regulated at 6 h might play important roles in N
assimilation of barley seedlings under N starvation condition.
Key words: nitrogen starvation; nitrogen use efficiency; glutamine synthetase; nitrate reductase synthetase;
nitrate transporter
氮是植物生长发育需求量最大的营养元素,
既是构成植物有机体的结构物质, 也是植物生理
代谢过程中起催化作用的物质(张子义等2010; 赵
平等1998)。植物吸收的氮主要来源于土壤, 而在
自然条件下, 土壤中的氮通常是有限的。因此土
壤缺氮已成为全世界限制植物生长和发育的重要
因素之一(赵平等1998; 曹翠玲等1999)。所以研究
植物如何高效吸收利用土壤氮素、氮胁迫条件下
植物生长发育与生理代谢, 分子调控的变化及其
植物生理学报1198
与植物氮效率的关系已成为植物营养、作物遗传
育种以及土壤等学科领域的重大研究命题。
有关植物不同品种(基因型)在氮饥饿下响应
氮的生理分子机制, 前人在水稻(李宝珍等2007; 曹
云2006)和拟南芥(Richard-Molard等2008)已有一定
的报道, 大麦在低氮胁迫下与产量相关的生理性
状也有初步研究(陈志伟等2010), 但是氮饥饿下,
大麦氮效率的生理生化及分子调控机制的研究未
见报道。
本研究利用氮敏感基因型BI-45 (陈志伟等
2010), 研究正常供氮和氮饥饿条件下, 苗期氮素利
用率、根冠比、叶绿素、含氮量、氮代谢关键的
酶活性以及相关基因的表达, 从形态、生理、分
子三个方面分析氮敏感基因型对氮饥饿的响应,
为解析大麦氮敏感的生理分子机制提供线索。
材料与方法
1 试验材料
大麦(Hordeum vulgare L.)供试材料为BI-45,
由上海市农业科学院生物技术研究所植物细胞工
程研究室提供。
2 试验方法
2.1 植物水培
首先将种子用1% NaClO消毒30 min, 清水冲
洗干净, 浸泡6~8 h, 25 ℃催芽过夜。然后选取露
白一致的种子, 播于周转箱中进行水培。水培试
验在光照培养箱中完成, 按昼/夜16 h/8 h给予光照,
光照强度为300 μmol·m-2·s-1 (Vidmar等2000b), 设置
温度为(20±2) ℃, 湿度为75%。营养液配方采用
1/2Hoagland营养液, 正常供氮氮源由四水硝酸钙
0.48 g·L-1、硝酸钾0.25 g·L-1和硝酸铵0.04 g·L-1提
供, 氮饥饿时以氯化钙0.22 g·L-1和硫酸钾0.22 g·L-1
提供, 其他营养液组成不变。到了两叶一心期, 进
行氮饥饿处理, 10 d后从早上10:30开始并分别在
此后的0、6、24、48 h取材。
2.2 生理指标测定
2.2.1 干重和含氮量测量 供氮处理不同时间后收
获植株, 重复3次, 分别测量其株高和根长, 再将地
上部和根分开, 放入105 ℃烘箱杀青30 min, 再在
70 ℃烘干至恒重, 称其干重。利用上海光明种业
公司的凯氏定氮仪测定了含氮量。
2.2.2 叶绿素含量测定 采用SPAD-502叶绿素仪测
定大麦倒二叶尖部, 避开叶脉, 每株测定一叶, 重
复测量3次, 每材料重复测量5株, 平均值即为测得
的SPAD值。
2.2.3 硝酸还原酶测定 分别采集倒二叶片和根0.3
g左右, 加入0.1211 g半胱氨酸, 0.0372 g EDTA的提
取缓冲液, 冰磨成匀浆, 12 000 r·min-1 4 ℃下离心
15 min, 上清液即为粗酶提取液。具体测定方法参
照对氨基苯磺酸 -α萘胺比色法 (陈薇和张德颐
1980)。
2.2.4 谷氨酰胺合成酶测定 分别采集倒二叶片和
根0.3 g左右, 加入磷酸缓冲液, pH 7.2, 内含0.5
mmol·L-1的EDTA, 50 mmol·L-1的K2SO4, 冰上研磨
成匀浆, 12 000 r·min-1 4 ℃下离心20 min后得到的
上清液, 即为粗酶提取液。具体测定方法参考曹
云(2006)。
2.3 RNA提取和定量PCR
利用Trizol Reagent (Invitrogen)提取总RNA,
然后用ND-1000分光光度计(NanoDrop)测定RNA
的质量和浓度。再利用SuperScript™ III反转录酶
(Invitrogen)得到cDNA。我们选择了大麦耐低氮相
关基因Nar1、GS1_1、GS1_2、GS1_3、GS2、
NRT2.1、NRT2.2、NRT2.3、NRT2.4和管家基因
CDC48。通过GenBank查找到相关序列 , 利用
Primer5和Oligo6软件分别设计引物, 引物序列如
表1所示, 由上海生工生物技术有限公司合成。采
用StepOne Real-Time PCR system (Applied
Biosystem)进行荧光定量PCR, 反应试剂使用
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyobo)。荧
光定量PCR反应体系(20 μL)包括2×Mix 10 μL、引
物(10 μmol·L-1)各0.6 μL、样品cDNA (约50 ng·μL-1)
2 μL、ddH2O 6.8 μL。荧光定量PCR反应程序为:
95 ℃预变性10 min; 95 ℃ 15 s, 65 ℃ 30 s, 45个循
环(陆瑞菊等2012)。
实验结果
1 氮饥饿处理后供试材料在形态和生理活性上的
变化
1.1 苗期的氮素利用率
氮敏感品种BI-45不论是根还是叶中, 氮素生
理利用率在氮饥饿和正常供氮的处理下都具有极
徐红卫等: 大麦氮敏感基因型苗期对氮饥饿的生理响应 1199
显著性差异(P<0.01) (图1-A), 且氮饥饿时的氮素
生理利用率都明显大于正常供氮, 此外, 根中的氮
素生理利用率都大于叶(P<0.05); 而BI-45的根和叶
中全N和缺N两个处理下氮素积累量都没有显著差
异(P<0.05), 但是在氮饥饿条件下, 根和叶中具有
显著性差异(P<0.05), 且氮素积累量根小于叶(图
1-B)。
1.2 根冠比、含氮量和叶绿素含量
如图2, 相比正常供氮, 氮饥饿后, 根冠比增加,
但是, 氮饥饿后叶绿素SPAD值相比正常供氮明显
下降(P<0.05)。
正常供氮和饥饿处理下, 根和叶的含氮量之
间都有显著差异(P<0.05), 并且在缺氮情况下, 根
中的含氮量明显小于叶(P<0.01); 无论根还是叶正
常供氮和缺氮处理, 都有极显著差异, 氮饥饿时的
含氮量都明显小于正常供氮(P<0.01) (图3)。
1.3 谷氨酰胺合成酶和硝酸还原酶的活性
如图4, BI-45在正常供氮时, 叶片中的谷氨酰
胺合成酶的活性明显高于根中的活性(P<0.01), 氮
饥饿时, 叶片中的谷氨酰胺合成酶的活性也高于
表1 荧光定量PCR中所用引物序列
Table 1 The primer sequences used in real-time PCR
基因名称 登录号 引物序列(5→3) 扩增产物长度/bp
HvGS1_1 JX878489 For: GGACCGTCGGTGATGGGG 178
Rev: AAGACGAGAACGAGAAGAGAGACCAGAC
HvGS1_2 JX878490 For: CACTTTGGGCAGGCTCTCGTCTC 106
Rev: CAGACTAGACCTTGCAATTGCAAAAGAAAC
HvGS1_3 JX878491 For: CTCCAATGGCAAGTAGAGTTACCTGTG 107
Rev: TTATTCAAACCTTGCCAGTCTCATCAC
HvGS2 AK360336 For:: AAGCTGGCGCTGAAGGTATGAAGG 124
Rev: GACGGAACCACAGGATCAACAAGAATG
HvNarl X57844 For: CATACACCATCAAGGGATACGC 163
Rev: TCTACCGACCAGAAGCACCAG
HVNRT2.1 U34198 For: CCCTTGTCCCCATCATTCGTG 82
Rev: GACCCAGAAACGGATGCCACA
HVNRT2.2 U34290 For: TGCCACCCAGCTCATTATGCC 129
Rev: AGCACGAGCAAGCCCATCACC
HVNRT2.3 AF091115 For: TGCCACACAACTCATCATGCC 128
Rev: GTACCAGCAAGCCCATCACGA
HVNRT2.4 AF091116 For: ACACAGCTCATCATGCCCCTC 100
Rev: GCATCATCCCCGGCACGAA
CDC48 AF045927.1 For: CCCCAAAGAGAGAGAAGACCAATG 178
Rev: ATGTCAATCTCACGATCAAACCTACC

图1 正常供氮和氮饥饿两个处理下BI-45在根和叶中的氮素生理利用率和氮素积累量
Fig.1 Physiological N use efficiency and accumulation in the root and leaf of BI-45 under normal nitrogen and starvation
植物生理学报1200
根中的活性(P<0.05), 并且根中的谷氨酰胺合成酶
活性饥饿后高于正常供氮, 叶片中除了24 h也有此
规律; 氮敏感基因型BI-45根中氮饥饿时的硝酸还
原酶的活性明显小于正常供氮时的活性(P<0.05),
叶片中硝酸还原酶的活性两个处理之间没有显著
差异, 但无论是正常供氮还是氮饥饿, 叶片中的硝
酸还原酶活性都大于根中的活性(P<0.05)。
2 氮饥饿处理后供试材料相关基因表达的变化
2.1 Nar1基因的表达
如图5, 氮饥饿后, 氮敏感基因型BI-45根中的
基因相对表达量都高于正常供氮, 并且在6 h有较大
的上调表达, 且叶片中饥饿处理的Nar1基因表达量
在24 h也有个上调表达的趋势。
2.2 GS基因家族的表达
氮敏感基因型BI-45叶片中缺氮条件下的
GS1_1和GS1_2的相对表达量都小于正常供氮时的
表达量(P<0.05), GS1_3和GS2除了0 h也有此规律;
根中GS1_1、GS1_2、GS1_3和GS2在2个N处理之
间都有显著差异(P<0.05)。其中, GS1_1和GS1_2根
中饥饿处理后基因相对表达量明显高于正常供氮
处理, 总趋势是下调表达, 但是在6 h有上调表达, 并
且在氮饥饿的时候根和叶之间有显著性差异
(P<0.05), 根中基因表达量基本大于叶; GS1_3和GS2
在根中饥饿处理后基因相对表达量都明显低于正
常供氮处理, 在6 h也有个上调表达的趋势, 并且GS2
根中的基因表达量小于叶(P<0.05) (图6)。
图2 正常供氮和氮饥饿下BI-45的根冠比和叶绿素SPAD值
Fig.2 Ratios of shoot and root and SPAD of BI-45 under normal nitrogen and starvation
图3 正常供氮和氮饥饿下BI-45在根和叶中的含氮量
Fig.3 Nitrate content in the root and leaf of BI-45 under
normal nitrogen and starvation
图4 正常供氮和氮饥饿下BI-45根和叶中的谷氨酰胺合成酶和硝酸还原酶的活性
Fig.4 GS activity and NR activity in root and leaf of BI-45 under normal nitrogen and starvation
徐红卫等: 大麦氮敏感基因型苗期对氮饥饿的生理响应 1201
2.3 硝盐酸转运蛋白基因的表达
从图7-A中可以看出NRT2.1基因在氮敏感基
因型BI-45根中的表达, 氮饥饿后尤其是在6 h有个
很高的上调表达。NRT2.2基因在根中2个处理之
间存在显著性差异(P<0.05), 饥饿后基因相对表达
量明显高于正常供氮处理(图7-B)。从图7-C中也
可以看出NRT2.3基因在氮饥饿后的相对表达量高
于正常供氮, 和NRT2.1基因的表达类似。NRT2.4
基因也是氮饥饿后的相对表达量高于正常供氮(图
7-D)。
图6 正常供氮和氮饥饿下BI-45根和叶中的GS家族基因(GS1_1、GS1_2、GS1_3和GS2)的相对表达量
Fig.6 Expression of genes of GS family (GS1_1, GS1_2, GS1_3 and GS2) in root and leaf of BI-45 under
normal nitrogen and starvation
讨　　论
1 氮饥饿时氮敏感基因型的一些表现
(1)相比正常供氮, 大麦氮饥饿后, 氮素利用率
增加。由于该研究为苗期试验, 没有产量, 所以苗
期的氮素生理利用率定义为生物积累量和氮素积
累量的比值(Shi等2010)。氮饥饿后氮素生理利用
率增加, 氮素积累量没有显著差异, 所以氮素利用
率增加。与之前的研究中低氮胁迫下得到的结果
类似(陈志伟等2010)。
(2)相比正常供氮, 氮饥饿时, 根中氮代谢相关
指标的显著性差异比叶中的大。根冠比增加, 推
测有利于对氮素胁迫的适应, 提高品种的氮素利
用率。已有研究表明, 大麦通过根系对土壤中的
氮素和施加的氮肥吸收, 与根系的性状有密切联
系(Lynch 1995; 史正军和樊小林2003; Ericsson
1995; Ameziane等1997; 李海波等2001)。而叶绿素
含量减少, 单位含氮量减少, 影响植物的光合作用,
图5 正常供氮和氮饥饿下BI-45根和叶中的Nar1的
相对表达量
Fig.5 Expression of Nar1 in root and leaf of BI-45 under
normal nitrogen and starvation
植物生理学报1202
进而影响其生长发育(Osborne等2002; 吴长山等
2000; Blackmer和Schepers 1994; Schepers等1992;
Yang等2003; Evans 1983; Blachmer等1994), 推测
饥饿后自身机制已开始无法补偿地上部所需, 并
且观察到第12天根冠比也开始降低。
2 氮饥饿时氮敏感基因型表现的内在可能机理
分析氮饥饿时氮敏感基因型的一些表现, 到
底什么因素起到了重要的调节作用？首先, 硝酸
还原酶和谷氨酰胺合成酶是氮素同化过程中的关
键酶。(1)相比正常供氮, 氮饥饿下硝酸还原酶活
性降低, 可能是因为硝酸还原酶是氮代谢过程中
第一个关键酶, 反映了植物吸收、积累外界硝酸
盐的能力下降。与早前的研究相比较, 在缺氮条
件下, 水稻中检测不到硝酸还原酶的活性(李宝珍
等2007), 可能是由于物种的差异, 根系中的硝酸还
原酶含量还主要和体内的NO3
-浓度有关系(Leleu
和Vuylsteker 2004)。叶片中的含量也明显高于根
中的含量, 因为硝酸还原酶主要在地上部同化(陈
薇和张德颐1980)。(2)在氮饥饿条件下, 谷氨酰胺
合成酶活性却增加, 有利于提高氮素利用率。GS
有两种同工酶, 一个是胞液型GS1, 主要作用是在
种子萌发时储存氮源的转运和叶片衰老时的氮源
再利用, 所以提高GS1的活性, 有利于提高氮素的
转移效率, 另一个是质体型GS2, 主要存在于叶绿
体中, 参与光呼吸和硝酸还原的氮代谢过程, 所以
提高GS2, 有利于提高氮素的同化效率(Ishiyama等
2004; 黄冰艳等2010; 王小纯等2010)。同样的, 也
发现叶中的活性高于根中的活性。
其次, 氮代谢相关的分子调控可能机制: (1)大
麦中编码硝酸还原酶的基因有2个(Nar1和Nar7)
(Sueyoshi等1995), 之前预实验中观察到该品种中
Nar7的表达十分不稳定, 并且有研究发现Nar1可
能是主效基因, 所以我们选择了Nar1基因, 结果证
实BI-45在氮饥饿条件下相比正常供氮处理表达量
上调, 可能是硝酸还原酶表现机制主要发生在翻
译水平, 而不是在转录水平。(2)大麦中目前发现
由3个核基因编码GS1, 分别是GS1_1、GS1_2和
GS1_3。我们研究观察到GS1_1和GS1_2的相对表
达量都明显高于GS1_3, 且GS1_1和GS1_2的基因
表达趋势和谷氨酰胺合成酶活性都是氮饥饿后增
强, 说明这两个基因对酶活性贡献较大, 可能起到
调控作用, 并且已有研究发现GS1家族可以作为代
图7 正常供氮和氮饥饿下BI-45根中NRT2基因家族(NRT2.1、NRT2.2、NRT2.3和NRT2.4)的相对表达量
Fig.7 Expression of genes of NRT2 family (NRT2.1, NRT2.2, NRT2.3 and NRT2.4) in root and leaf of BI-45 under
normal nitrogen and starvation
徐红卫等: 大麦氮敏感基因型苗期对氮饥饿的生理响应 1203
表氮高效利用和产量的关键因子(吴长山等2000;
Blackmer等1994), 主要在根中表达, 而GS2则是由
一个核基因编码, 主要在叶片中大量表达(Edwards
等1990; Zhao和Shi 2006), 早先研究也显示, GS2主
要在叶绿体中进行NH4
+的初级同化和光呼吸途径
中释放NH3的再利用(Wallsgrove等1987; Shi等
2010; Cheng等1986)。
此外, 我们还做了根部硝盐酸转运蛋白基因
的表达。由于植物根系对NO3
-的吸收是一个主动
吸收过程, NRT2基因家族是对诱导型高亲和力转
运系统iHATS (inducible HATS)主要负责的基因家
族(黄冰艳等2010), 在拟南芥和水稻中已有报道
(Orsel等2006; Li等2007; Cai等2008; 李静等
2012)。我们观察到: NRT2.2的相对表达趋势与
NRT2.1、NRT2.3和NRT2.4不同 , 可能是因为
NRT2.1、NRT2.3和NRT2.4相比NRT2.2存在较高同
源性(Vidmar等2000a), NRT2家族基因在缺氮情况
下表达量很高, 早有研究表明, 其在侧根的发生过
程中起主要的调节作用(王小纯等2010; Trueman等
1996; Vidmar等2000a)。
相比正常供氮, 缺氮时, 根中的谷氨酰胺合成
酶、硝酸还原酶代谢活性以及氮代谢某些相关基
因比叶的差异性显著, 其中, 根部GS1_1、GS1_2和
NRT2.2表现尤为突出, 并且在6 h都有上调表达。
说明氮素胁迫下, 氮敏感基因型加强苗期根系形
态的建成, 会有利于当时及而后的氮素吸收、利
用, 这些实验结果为解析大麦氮敏感的生理分子
机制提供了有价值的线索。
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