全 文 ：第 31卷第 1期
2007年 1月 　　　　　　　　　　
水　产　学　报
JOURNALOF FISHERIES OF CH INA
　　　　　　　　　　　　Vo.l 31, No. 1　
Jan. , 2007　
文章编号:1000 - 0615(2007)01 - 0090 - 07
收稿日期:2006-05-29
项目资助:国家自然科学基金项目 (30670396和 30470343);广东省自然科学基金项目 (04010990);广东省科技计划项目
(2006B20601005)
作者简介:徐智广(1977 -),男 ,河北唐山人 ,硕士研究生 ,主要从事海洋环境和海藻生物学的研究
通讯作者:邹定辉 , E-mai l:dhzou@ s tu. edu. cn
光照和不同形态氮营养盐供应对坛紫菜硝酸还原酶活性的影响
徐智广 1 , 　邹定辉 1 , 　张　鑫 1 , 　刘树霞1 , 　高坤山1, 2
(1.汕头大学海洋生物研究所 , 广东 汕头　515063;
2.中国科学院水生生物研究所 , 湖北 武汉　430072)
摘要:为了探讨光照 、NO3 - -N 和 NH4 +-N 对坛紫菜 (Porphyra ha itanensis)硝酸还原酶活性
(NRA)的影响 ,在光照和黑暗条件下分别对坛紫菜叶状体进行氮 (N)饥饿→氮(N)加富和 N
加富→N饥饿处理 ,并测定 NRA的变化。结果表明:在 N饥饿→N加富过程中 ,光照下 NRA
比黑暗中要高;NO3 - -N的加富能提高 NRA ,且在光照下比黑暗中 NRA达到最大值的时间要
短;而 NH4 +-N与 NO3 - -N共同对 N饥饿藻体加富时 NRA没有明显变化 ,并与 NH4 +-N单独
加富无显著差异 。另外 ,对于 N加富→N饥饿的处理 ,在光照下 NO3 - -N加富和 NH4 +-N与
NO3
- -N共同加富的 NR都能在 N饥饿处理后的一段时间内维持较高的活性。这些结果说
明:光照和硝酸盐对 NRA起正调节作用 ,而铵盐对 NRA起负调节作用 ,但 NRA与体外硝酸
盐浓度并不成直接的正相关关系 。
关键词:坛紫菜;硝酸还原酶活性;氮饥饿;氮加富;光照;营养盐
中图分类号:S 917　　　　　　　文献标识码:A
E ffect of light and d ifferent form s of nitrogen on the activ ity
of nitrate reductase ofPorphyra haitanensis (Rhodophyta)
XU Zhi-guang1 , ZOU D ing-hui1 , ZHANG X in1 , L IU Shu-xia1 , GAO Kun-shan1, 2
(1. MarineB iology Institute, Shantou University, Shantou　515063, China;
2. Institute of Hydrobiology, Ch inese Academy of Science, Wuhan　430072, China)
Abstract:To investigate the effects of light, nitrate (NO3 - -N) and ammonium (NH4 +-N) on the activity
of n itrate reductase (NRA) in the red a lga Porphyra haitanensis, thalli were incuba ted in seawater w ith
differentN supply (N-enrichm ent and N-starva tion) in the ligh t or in darkness. The results showed tha t
NRA was h igher in the ligh t than in darkness;NRA increased when thalliwere incubated inNO3 - -N , and
it enhanced faster in the light than in darkness. There was no sign ificant difference ofNRA be tween thalli
incubated in seawater enriched by NO3
- -N and NH4 +-N sim ultaneously and those enriched by NH 4 +-N
solely. Add itionally, NR in light could m ain tain re lative h igh activity for several hours when thalli were
transferred from N-enrichm ent toN-starvation. Itwas concluded tha t ligh t and / orNO3 - -N increased NRA
of Porphyra haitanensis, but NH 4 +-N restrained i.t However, NRA was not in d irect proportion to the
concen tra tion ofNO3
- -N in culture.
Key words:Porphyra ha itanensis;activity of n itrate reductase;N-starvation;N-enrichm ent;light;nutrien t
　　近些年陆源污染物对海洋的污染日益加重 ,
同时由于海水养殖业的迅猛发展 ,近海富营养化
现象日趋严重 [ 1] 。由于海水中营养盐元素的化
合价具有多态性 ,因而造成了水体富营养化形式
与过程的多样化;另一方面 ,由于营养物质的来源
复杂 ,且营养盐因子还受到季节变换 、生物作用及
温度 、盐度等理化因子的影响 ,海水营养盐在一定
时空范围内表现出动态分布特征 [ 2] ,从而增加了
海水富营养化治理的难度 。目前 ,国内外学者普
遍认为养殖大型海藻是吸收 、利用营养物质 ,延缓
并改善水域富营养化的有效措施之一 [ 3 - 5] 。
海水中的营养盐主要指无机态的氮 (N)、磷
(P)和硅 (Si),而 N是限制海藻生长的主要营养
元素。在海洋生态系统中 ,硝酸根 (NO3 - )是 N
的主要形式 ,而它必须被还原成铵根 (NH4 +)才
能参与海洋植物的 N代谢过程 。由 NO3 -还原到
NH 4
+的反应分为两步:第一步是 NO3 -还原成
NO2
- ,此步反应由硝酸还原酶 (NR)催化;第二
步是 NO2 -还原成 NH4 +,由亚硝酸还原酶(N iR)
催化。其中 ,第一步反应是整个过程的限速反应 ,
而 NR是整个过程的限速酶[ 6] 。因此研究 NR的
活性对于海藻 N代谢的研究具有重要意义 [ 7] 。
坛紫菜 (Porphyra haitanensis)是中国南方海
域海水养殖的主要大型经济海藻 ,近年来 ,由于其
在食品 、纺织 、医药等行业的广泛应用 ,以及人工
养殖技术问题的解决 ,坛紫菜的养殖面积和规模
越来越大。除了经济上的效益 ,坛紫菜的大规模
养殖也是降低中国南方近海富营养化的一条有效
途径[ 8] 。很多学者对坛紫菜的生理生化及分子
方面展开了比较深入的研究 [ 9 - 12] 。但是 ,目前对
于坛紫菜营养代谢与富营养环境关系的研究报道
还很少见 。本文对坛紫菜 NRA与光照 、N供应
状况之间的关系进行了研究 ,以探讨光照及不同
形式营养盐浓度的剧烈变化对坛紫菜 NRA的影
响 ,进而为坛紫菜缓解富营养化作用提供一定的
理论依据。
1　材料和方法
1. 1　材料
坛紫菜 (叶状体阶段)采自广东省汕头市南
澳岛近海筏式吊养区 。采集时选择健康一致的叶
状体 ,长度 15 cm左右 ,放于盛有少量海水的塑料
袋中 ,用低温箱 (温度 4 ℃左右)在 3 h内运到实
验室。然后选用藻体同一部位 (因为藻体不同部
位 NRA可能不同[ 13] ,本研究选用叶状体中部 ),
剪成 1. 5 cm ×1. 5 cm的小块 ,在高压灭菌的自然
海水(pH:8. 2;盐度:33;NO3 - -N浓度:10μmol
L
-1;NH 4 +-N浓度:0. 9 μmo l L- 1)中培养 24 h
(培养条件为:温度 15 ℃;光照强度 120 μmo l
m
- 2 s-1;光暗比为 12 h∶12 h;用充气泵 24 h充空
气 ),使藻体受伤组织愈合 、恢复活性 ,然后用作实
验材料。实验在 4 d内进行 ,超过 4 d则丢掉剩余
藻体 ,重新采用新鲜的材料。
1. 2　培养水体的配制
人工海水的配制　　参照 Larsson等[ 14]的方
法 ,在蒸馏水中加入 NaCl 450 mmol L -1 , KC l
10mmo l L -1 , CaCl2 10 mmo l L -1 ,M gSO4 30
mmol L- 1 , NaHCO3 2. 2mmo l L- 1 ,配成溶液 。
N缺乏的 F /2加富培养基的配制　　参照
Borow itzka
[ 15]的方法 ,其中不加入 NaNO3 ,使培
养水体中不缺乏其他营养元素而保证 N浓度为
零 。
各种处理培养水体的配制
(1)N饥饿处理:人工海水 +N 缺乏的 F /2
加富培养基;
(2)N加富处理:最终 N浓度都保持为 400
μmo l L- 1:
①氨氮(NH4 +)加富:人工海水 +N缺乏的
F /2加富培养基 +NH 4Cl;
②氨氮和硝氮 (NH4 + +NO3 - )共同加富:人
工海水 +N缺乏的 F /2加富培养基 +NH4C l和
NaNO3(二者摩尔浓度比为 1∶1);
③硝氮(NO3 - )加富:人工海水 +N缺乏的
F /2加富培养基 +NaNO3。
1. 3　自然海水中坛紫菜 NRA的日变化
实验室培养 24 h后的藻体 ,放入新鲜的高压
灭菌的自然海水中培养 (培养条件为:温度 15
℃;光照强度 120 μmol m - 2 s- 1;光暗比为 12
h∶12 h;培养密度 1 L水体放 1. 0 g湿重藻体;每
天 24 h充空气 ), 24 h(一昼夜 )内每隔 3 h取样
测定 NRA。
911期　　　　　　　　　徐智广 , 等:光照和不同形态氮营养盐供应对坛紫菜硝酸还原酶活性的影响
1. 4　对藻体处理后 NRA的变化
N饥饿 →N加富处理时光照 (或黑暗 )条件
下 NRA的变化　　实验室培养 24 h后的藻体 ,
放入 N饥饿条件下培养 48 h(培养条件同 1. 3),
然后转入 3种 N加富处理的水体中(其他培养条
件不变 ),从光照 (或黑暗)的 0时刻到第 3小时 ,
每隔 1 h分别取样测其 NRA ,第 3到第 12小时每
隔 3 h分别取样测其 NRA。
N加富 →N饥饿处理时光照 (或黑暗 )条件
下 NRA的变化　　实验室培养 24 h后的藻体 ,
分别放入 3种 N加富水体中培养 48 h(培养条件
同 1. 3),然后分别转入 N饥饿处理中 (其他培养
条件不变),从光照 (或黑暗 )的 0时刻到第 3小
时 ,每隔 1 h分别取样测其 NRA ,第 3到第 12小
时每隔 3 h分别取样测其 NRA。
连续光照(或连续黑暗 )条件下 N饥饿与 N
加富交替处理时 NRA的变化　　实验室培养 24
h后的藻体 ,放入 N饥饿条件下培养 6 h ,分别转
入 3种 N加富水体中培养 6 h,然后再次转入 N
饥饿条件下培养 6 h(培养条件同 1. 3)。全程每
隔 2 h分别取样测定 NRA ,在每次处理开始的 2 h
内每隔 1 h测定一次 。整个处理过程为连续光照
(或连续黑暗 )。
1. 5　硝酸还原酶活性 (NRA)的测定
参照 Corzo等[ 16]的方法 ,通过测定一定量藻体
(活体)在一定量反应介质中单位时间内产生的亚硝
氮(NO2 - -N)的量来表示藻体的 NRA。具体方法
为:称取 0. 1 g藻体 (鲜重)→加入 10mL反应介质
缓冲液 (0. 1 mol L-1磷酸缓冲液 , pH:7. 5;0. 01
mmol L-1的葡萄糖;0. 5mmol L -1的 Na-EDTA;
200mmol L-1的 NaNO3)→充氮气 2m in(赶出溶
液中的氧气)→黑暗条件下 30℃反应 30m in→取出
藻体→吸取反应介质缓冲液 2mL加入 1mL磺胺试
剂 , 5m in后加入 1mL盐酸萘乙二氨试剂 ,混匀 ,静
置 15m in→测定 543 nm处的吸光值→用标准曲线
回归方程计算亚硝氮(NO2 - -N)的含量 ,然后计算酶
活性。以每克鲜重藻体每 h产生的 NO2 - -N量表示
NRA(单位为:μmol g-1 h-1)。标准曲线用不同
浓度的 NaNO2标准溶液制作。
1. 6　统计分析
所有测定结果表示为平均数 ±标准差 (n≥3),
用方差分析(ANOVA)和 t-检验进行统计显著性分
析 ,以 P <0. 05作为差异的显著性水平。
2　结果
2. 1　硝酸还原酶日变化
自然海水中 ,在温度 15℃、光照强度 120μmol
m
-2
s
- 1、光暗比为 12h∶12h条件下 ,坛紫菜的
NRA从光照周期开始时逐渐升高 ,至第 6小时达
到最高值 [ (1. 045±0. 304) μmo l NO2 - g-
h
-1 ] ,以后又逐渐降低 , 光照结束以后其值没有
明显的变化 ,维持在 0. 6 μmol NO2 - g- 1 h- 1
左右(图 1)。
图 1　自然海水中 NRA的日变动
F ig. 1　D aily changes of NRA in the Porphyra
haitanensis thalli incubated in natura l seawa te r
2. 2　N饥饿→N加富处理时 NRA的变化
在光照条件下 (图 2-A), NH4 +加富和 NH 4 +
+NO3 -共同加富两种处理的 NRA在整个处理
的 12 h内都没有明显的变化 ,一直保持较低的
值 ,在 0. 05至 0. 3 μmol g- 1 h- 1之间。而
NO3
-加富处理的 NRA先增大 , 2 h后达到最大值 ,
为(1. 321±0. 250)μmol g- 1 h-1 ,然后又降低 ,在
第 3小时降低到(0. 748±0. 055)μmol g-1 h- 1 ,
其后 NRA维持在较稳定的水平 。
在黑暗条件下(图 2-B), NH4 +加富和 NH 4 +
+NO3 -共同加富两种处理的 NR在整个处理的
12 h内几乎都没有活性。 NO3 -加富处理的 NRA
在处理初期逐渐变大 , 6 h后达到最大值 (1. 503±
0. 317 μmol g-1 h-1),以后逐渐降低至 1. 0
μmo l g- 1 h- 1左右后保持较稳定的水平。
2. 3　N加富→N饥饿处理时 NRA的变化
在光照条件下 , 3种处理之间 NRA的变化存
在显著差异 (P <0. 05)。 NH4 +加富处理的 NRA
92 水　产　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　31卷
始终保持很低的水平 ,在 0. 2 μmol g-1 h-1以
下;NH4 + +NO3 -共同加富与 NO3 -加富处理的
NRA初始值之间没有显著差异(约为 0. 5μmol
g
-1 h- 1),但随光照时间的延长 , NH4 + +NO3 -
共同加富处理的 NRA在 6 h内都没有显著变化 ,
6 h以后开始降低直到与 NH4 +加富处理的 NRA
相似;而 NO3 -加富处理的 NRA经 1 h就升高到
(1. 110±0. 293)μmo l g- 1 h- 1 ,以后 5 h内均
维持在较高水平 , 6 h后开始降低 ,直到 0. 5 μmo l
g- 1 h-1(图 3-A)。
图 2　N饥饿→N加富处理 NRA的变化
F ig. 2　T ime-course of changes forNRA in the
N-depleted Porphyra haitanensis thalli
when transferred to N-enr iched seaw ater
　　黑暗条件下 , NH4 +加富和 NH 4 + +NO3 -共
同加富两种处理的 NR在整个处理的 12 h内几
乎都没有活性;而 NO3 -加富处理 NRA先下降再
升高 ,最后又下降 ,直到与另两种处理没有显著差
异 ,但其最大值也只有光照下最大值的 26. 8%
(图 3-B)。
2. 4　N饥饿与 N加富交替处理时 NRA的变化
光照条件下 , 3种情况在开始的 6 h内经过同
样的饥饿处理 , NRA出现升高→降低→升高→降
低的变化趋势 (如图 4-A)。 在以后的处理中 ,
NH4
+加富和 NH4 + +NO3 -共同加富两种处理的
NRA不再升高 ,始终保持很低的值 ,在 0. 1μmol
g
-1 h- 1左右;NO3 -加富的 NRA在第 6 ～ 12小
时内有一定程度的升高 ,这种升高的趋势一直持
续到 12 ～ 18 h的饥饿处理结束以后 。
图 3　N加富→N饥饿处理 NRA的变化
F ig. 3　T ime-course of changes forNRA in the
N-repleted Porphyra haitanensis thalli
when transfe rred to N-deple ted seawa ter
图 4　N饥饿→N加富→N饥饿交替处理 NRA的变化
F ig. 4　T ime-course of changes forNRA in the
N-deple ted Porphy ra haitanensis thalli when transferred
to N-enr iched seaw ater for 6 h, and then to
N-dep leted seaw ater for another 6 h
　　黑暗条件下 , 3种处理的 NRA整个过程都比
较低 ,始终保持在 0. 2 μmol NO2 - g- 1 h- 1以
下 ,且 3种处理之间没有显著性差异 (图 4-B)。
3　讨论
坛紫菜作为中国南方改善近海富营养化程度
的推荐养殖品种 ,对于它的营养代谢等生理方面
的研究急需加强 [ 8] 。作为氮代谢过程的关键
酶 [ 6] , NR的研究具有非常重要的意义 。本研究
结果表明 , 坛紫菜的 NRA 受到光照 、底物
931期　　　　　　　　　徐智广 , 等:光照和不同形态氮营养盐供应对坛紫菜硝酸还原酶活性的影响
(NO3 - )水平及 NH4 +的调节。
3. 1　光照调节
坛紫菜在自然海水中 ,温度 15 ℃、光照强度
120μmo l m -2 s- 1 、光暗比为 12 h ∶12 h条件
下 ,其 NRA所呈现的日变化规律 (图 1)与其他许
多海藻 NRA的规律相似:最高的 NRA出现在光
照的中间时刻 ,而黑暗阶段的活性都比较低[ 6, 17] ;
对比图 2中的 A、B ,发现同是 NO3 -加富处理 ,在
光照条件下 NRA在 2 h内就达到最高值 ,黑暗条
件下则要 6 h;对比图 3中的 A、B, NO3 -加富转
到饥饿条件中 ,黑暗下 NRA比光照下低的多;而
图 4中连续黑暗时 ,各种处理下 NRA都很低。可
见光照可以促进 NRA的升高 ,其原因可能是由
于 NO3 -还原过程所必需的 ATP(提供能量 )、
NADH(作为电子供体)和中间产物均来自于光合
作用。其它一些研究也表明光照对 NRA有促进
作用 , 例如:Chow 等 [ 18]以智利江篱 (Gracilaria
chilensis)为材料 ,在连续黑暗阶段分别给予 10
m in和 60 m in的光照 ,结果发现 NRA分别提高
了 30%和 45%,因而指出 ,智利江篱 NR对于光
非常敏感 ,短时间的光照就能够增大 NRA。但也
有学者认为光照在调节 NRA中的作用并不大 ,
而生物钟调节则起着更大的调节作用 。例如:
G ranbom 等 [ 19] 对 长 心 卡 帕 藻 (Kappaphycus
alvarezii)的研究结果表明 ,在连续光照下 ,当光强
为 100μmo l m - 2 s- 1时 , NRA在 24 ～ 48 h内
出现了自然日变化那样的摆动:生理节奏上的白
天活性高而生理节奏的晚上低 ,最高活性出现在
生理白天的第 4小时 。从而说明长心卡帕藻的
NR活性受到生物钟的调节。本研究中坛紫菜从
N饥饿 、12 ∶12(D ∶L)条件下转到黑暗中 ,同时
加富 NO3 - (图 2-B),结果 NRA在 6 h内上升到
最大值 (本处理的 0 ～ 12 h相当于生理节奏上的
白天),其摆动规律类似于自然条件下的日变动 ,
说明坛紫菜 NR也受到生物钟的调节 ,其 NR表
达所需的 ATP、NADH等可能是来自黑暗处理之
前的光合作用产物在细胞内的积累。因此 ,本研
究结果表明 ,坛紫菜的 NRA既受到光照的促进 ,
同时也受到生物钟的调节 。至于光照和生物钟调
节在 NR表达中如何协调的起作用 ,尚需进一步
研究。
3. 2　底物调节
对高等植物 、真菌类和海藻类一些种类的有
关研究表明 , NR是一种底物诱导酶 ,底物 NO3 -
的存在或其浓度的升高可以诱导 NR的产生 ,从
而使其活性升高 [ 20] 。Amy等 [ 21]把培养在 NH+4 -
N为唯一 N 源中的假脚海链藻 (Thalassiosira
pseudonana)转入到 NO3 - -N 浓度为 18 mmol
L
-1的 F /2培养基中 , NRA迅速升高 ,从而推测底
物 NO3 -对 NR的表达起着诱导作用 。本研究以
大型海藻坛紫菜为材料 ,对其进行 N饥饿→N加
富的处理 (图 2),结果表明 NO3 -的从无到有刺
激产生了 NRA ,说明底物 NO3 -对坛紫菜 NR存
在相似的诱导作用 ,只是诱导时间比假脚海链藻
要长 ,这可能是由于海藻种类不同所致。另外 ,本
研究中坛紫菜的 NRA 并不与培养水体中的
NO3
-浓度成直接的正相关关系 ,从图 3-A和图
4-A可以看到:当材料从 N加富转到 N饥饿培养
水体中时 , NRA仍能在一段时间内维持较高的水
平 ,这可能是因为在坛紫菜细胞中存在着 N库 ,
当培养水体中的 NO3 -浓度比较大时 ,细胞吸收
NO3
-的速度可能会超过 NR对 NO3 -的还原速
度 ,于是 NO3 -就在液泡中暂时储存 , 当水体中
NO3
-缺乏时 , N库中积累的 NO3 -再次释放到细
胞质中 , 以满足 N代谢的需要。对于海藻的 N
库 ,已经有了一些研究报道:Dortch等[ 22]在中肋
骨条藻 (Skeletonema costa tum )中发现 , 在外界
NO3
-耗尽的过程中或耗尽后 ,胞内储备 NO3 -的
利用使藻类在外界极低的 NO3 -水平下仍维持很
高的 NRA。本研究中 ,当坛紫菜转到 N饥饿条件
时仍能保持高的 NRA ,这与 Dortch等的研究结果
十分相似。许多大型海藻都能储存 N ,基于这一
特点 ,海藻可能更易适应在营养不足状态下的持
续快速生长 。正因为这种营养库的储存能力 ,使
NRA不仅被外界 NO3 -浓度所调节 ,同时也被自
身 N库的大小所调节 ,并且导致 NRA 与外界
NO3
-浓度相关性较差 ,而与胞内 NO3 -浓度的增
加成正相关关系 [ 23] 。所以 , 笔者推测坛紫菜
NRA可能与细胞内 NO3 -浓度的相关性更好一
些 ,而 N库在调节胞内 NO3 -浓度中有着一定的
作用 ,但直接证据还需进一步研究。
3. 3　NH4 +调节
本文结果表明 ,与底物 NO3 -和光照可以促
进坛紫菜 NRA的作用相反 , NH4 +对 NRA起着
负调控的作用。关于 NH4 +对 NRA的抑制作用 ,
94 水　产　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　31卷
以前的研究也有过报道 。例如:Amy等 [ 21] 把培
养在 NO3 - -N中的假脚海链藻转入到 NH4 +-N为
唯一 N源的 F /2培养基中 ,或者把 NH4 +-N加入
到培养藻体的 NO3 - -N F /2培养基中 , NRA都迅
速下降 。本研究中 ,当 NO3 - -N和 NH4 +-N共同
加富时 (图 2),其 NRA与单独用 NH4 +-N加富处
理的没有显著差异 ,都很低 ,这与 Amy等的研究
结果相似。不过 , NH4 +的这种抑制作用并不是永
久性的 。 Cannons等 [ 24]在藻类研究中发现 ,当抑
制因子消除后 , NR基因又得以表达。本研究中
在去掉抑制因子 NH4 +后 ,在光照和 NO3 - -N库
提供 NO3 -的条件下 , NR仍能够再次表达 (图 3-
A),说明 NH4 +对 NRA的抑制作用是可调节的 ,
当去除抑制条件时 , NR仍能够继续合成而恢复
活性 ,这与 Cannons等的结论相似 。
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