全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (7): 626~636626
收稿 2013-04-22　　修定 2013-05-24
资助 国家自然科学基金(31070253)和转基因生物新品种培育重
大专项(2011ZX08009-002)。
* 通讯作者(E-mail: hlan@sdau.edu.cn; Tel: 0538-8249909)。
ZFN/TALEN技术与作物遗传改良
李奇, 安海龙*
山东农业大学生命科学学院, 作物生物学国家重点实验室, 山东泰安271018
摘要: 近年来, 以锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)和TALE核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TAL-
ENs)为代表的基因组编辑技术开始出现并快速发展。这种技术把锌指或TALE (DNA识别结构域)与核酸酶融合, 使之能够
在特定的位点切开基因组DNA, 随后利用基因组的修复/重组机制人工编辑基因组序列。利用ZFN/TALEN基因组编辑技
术, 可以实现基因敲除、片段置换、片段删除、定点插入等遗传操作。本文对ZFN/TALEN技术的工作原理和其在植物上
的成功案例进行了综述, 并对其在作物遗传改良研究中的应用前景进行了探讨。
关键词: ZFN; TALEN; 基因组编辑; 作物遗传改良; 生物安全性
ZFN/TALEN Technology and Crop Genetic Improvement
LI Qi, AN Hai-Long*
State Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong 271018,
China
Abstract: In recent years, genome-editing technologies represented by ZFN (zinc-finger nucleases) and TAL-
EN (transcription activator-like effector nucleases) were developed rapidly and used to facilitate the research of
crop genetic improvement. These technologies rely mainly on the fusion of zinc fingers or TALEs (DNA-bind-
ing domains) to a non-specific nuclease, which could cut genomic DNA at a given site and induce site-directed
genome modifications through DNA repair/recombination mechanisms. Using the ZFN/TALEN technology, it
is easy to produce desirable genetic modifications such as indels, deletions, fragment insertions and substitu-
tions in the plant genomes. In this review, the principle and evolution of ZFN and TALEN technologies are de-
scribed and their potentials for crop improvement are also discussed.
Key words: ZFN; TALEN; genome editing; crop genetic improvement; biosafety
在经济全球化背景下, 我国的粮食安全将长
期面临耕地面积持续减少、资源短缺的刚性制约
以及市场竞争激烈的多重压力。据测算, 要保障
2020年14.5亿人口的粮食安全, 农产品生产水平必
须提高20%。也就是说, 在今后一段时期内18亿亩
耕地、16亿亩播种面积的红线不突破的前提下,
农作物单位面积产量必须每年增长1%~2%。传统
的育种方法主要是通过筛选自然的或者诱变的优
良性状, 然后杂交组合。常规杂交育种使各种作
物种内的有利基因得到了充分利用, 但是存在变
异幅度过大、目标性状稳定慢、育种周期长、可
预见性差等缺陷, 新潜力的挖掘越来越困难。多
年徘徊不前的粮食单产表明, 传统的育种技术已
不足以承载我国未来粮食安全面临的巨大挑战。
随着生物技术的发展, 分子育种技术逐渐兴
起。分子标记和转基因技术是引领现代分子育种
研究的关键技术: 分子标记通过利用与目标性状
紧密连锁的DNA标记对目标性状进行间接选择,
能够加速育种进程, 提高育种效率; 转基因技术则
是用基因工程技术把外源基因整合到作物中, 打
破了种间界限, 使得作物改良目标性更强, 操作更
精细, 可用基因来源更广泛, 育种周期更短。然而
转基因作物自从上世纪80年代出现伊始, 便饱受
争议, 至今仍是如此。其中的原因之一便是转基
因技术只能把外源基因随机整合到基因组中, 遗
传后果无法完全预知, 因此迫切需要有新的技术
出现来打破这一发展瓶颈。
在过去几年中, 以ZFN (zinc-finger nucleases)
和TALEN (transcription activator-like effector nucle-
ases)为代表的序列特异性核酸酶技术以其能够高
李奇等: ZFN/TALEN技术与作物遗传改良 627
效率地进行定点基因组编辑, 在基础研究、基因
治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。这
项技术依赖一种人工嵌合蛋白, 该蛋白由一个可
定制的DNA-识别结构域和一个无序列特异性的
核酸内切酶融合而成, 这使得核酸酶具有了识别
并切割特异DNA序列而产生双链断裂(double-
strand breaks, DSB)的能力。随后DSB会激活细胞
的DNA修复机制, 从而定点修饰基因组。该技术
原理清晰、操作简单, 能适用于包括动植物在内
的大多数生物以及培养的细胞, 是较好的转基因
替代技术。
1 锌指核酸酶(ZFNs)
1.1 ZFN的出现
最早的ZFN出现在17年前。Johns Hopkins大
学的Chandra把锌指(zinc finger, ZF)结构域与IIs型
限制性核酸内切酶FokI的切割域融合, 获得了具有
新识别特性的核酸内切酶(Kim等1996)。Utah大学
的Carroll一直致力于真核生物基因打靶研究, 他和
其他人的研究表明, 在基因组靶位点处引入DSB,
会显著提高这个位点的同源重组效率(Rouet等
1994; Choulika等1995; Cohen-Tannoudji和Babinet
1998)。Chandra的ZFNs研究发表以后, Carroll认为
这种嵌合蛋白是一个很好的切开DNA双链的工
具。不久, Carroll与Chandra合作, 在爪蟾(Xenopus
laevis)卵母细胞开展了ZFN介导的外源DNA修复
实验, 并取得了成功(Bibikova等2001)。次年, Car-
roll又用ZFN敲除了果蝇(Drosophila melanogaster)
的一个内源基因(Bibikova等2002)。这两个实验标
志着用ZFN定点修饰真核生物基因组的开端。
1.2 ZFN的结构和原理
锌指结构域通常由3~6个Cys2-His2型锌指单元
串联而成。每个锌指单元包括大约30个氨基酸,
它们可以借助一个锌离子形成ββα构象 (Klug
2010)。其中的α螺旋可以深入到DNA双螺旋的大
沟来识别3~4个连续的核苷酸碱基(Pabo等2001)。
这样几个锌指串联起来就可以识别更多的核苷酸
序列。双链DNA的切割需要2个FokI切割域的二
聚化来完成。因此, ZFNs通常是成对使用: 每个
ZFN分别结合切割位点两侧各一条链上的核苷酸,
中间有一个5~7 bp (base pairs)的间隔。只有2个
ZFN以正确的方向识别并结合各自的序列, 并且形
成精确的间隔时, FokI才能具有切割活性, 这种结
构大大增强了ZFN的特异性(图1) (Handel等2009;
Urnov等2005)。
1.3 ZFN的构建方法
最早Wright等(2006)把几个具有固定识别特
性的锌指按顺序拼接起来[即模块组装(modular as-
sembly, MA)]构建ZFN。这种方法简单易行, 但是
成功率较低(Ramirez等2008), 这是由于相邻锌指
之间会相互影响识别效率, 也就是锌指的上下文
效应(context-dependent effects) (钟强和赵书红
2010)。多年来, 不同研究机构都发展了各自的新
识别特性ZFN构建策略, 这些策略各有特点, 可供
科研人员斟酌。其中最有效的可能是Sangamo公
司开发的CompoZr方法。这种方法效率高, 特异性
强, 在Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)可以商业化制
备, 但是价格不菲(Miller等2007; Perez等2008;
Geurts等2009; Doyon等2011)。由于CompoZr法具
有专利, Joung意识到自己需要创建一种开放的、
高效的构建策略, 于是他联合其他人开发了寡聚
文库构建(oligomerized pool engineering, OPEN)
(Maeder等2008; Zhang等2010), 正如它的缩写,
OPEN是完全向公众开放的。这种方法通过细菌
系统筛选出高活性的三锌指阵列, 成功率较高, 但
是构建过程需要2~3个月, 费时费力, 而且由于筛选
池有限, 平均200 bp才能有一个靶位点。后来,
Joung等又基于OPEN开发出上下文依赖组装(con-
text-dependent assembly, CoDA)方案(Sander等
2011a; Curtin等2011)。这种方法结合了OPEN和
MA的特点, 可以在网站上(http://www.zincfingers.
org/)设计并直接构建。但是, 最近的报道显示CoDA
的成功率并不太高(Sood等2013; Chen等2013)。此
外, Wolfe实验室也发表了基于筛选和模块组装的
构建方案(Meng等2008; Gupta等2012)。
2 TALE核酸酶
2.1 TALE密码破译
黄单胞杆菌(Xanthomonas)是一种广泛存在的
植物病原菌, 对于农业生产具有重大的危害。这
种细菌可以通过III型分泌系统把avrBs3/PthA蛋白
(也就是TALE蛋白)注入到植物细胞, 激活植物自
身某些基因的表达而更有利于病原菌的侵染(Boch
和Bonas 2010)。TALE蛋白包含三个部分(图1): N
植物生理学报628
端序列(N-terminal sequence, NTS); C端序列(C-ter-
minal sequence, CTS); 一段由12~30个高度保守的
重复单元组成的中心重复区(Moscou和Bogdanove
2009; Boch等2009)。每个重复单元含有33~35个氨
基酸, 除第12和13位可变外, 其他序列几乎相同,
这两个氨基酸残基被称为双氨基酸残基(repeat
varible di-residues, RVDs)。每个重复单元能结合
一个核苷酸, 而识别特异性正是由RVDs决定的。
晶体结构显示: 每个重复单元形成V型的2个螺旋
结构, 这种结构正好把RVDs呈现在DNA双螺旋的
大沟中(Mak等2012; Deng等2012)。RVD的12位氨
基酸能稳定这种结构, 第13位氨基酸的残基则直
接与碱基作用, 决定识别特异性。
TALE密码非常简单, 每一个模块识别一个核
苷酸, 并且可以按任意顺序随意组合。因此, TALE
核酸酶(TALEN)的可用靶位点十分广泛, 并且大部
分都有切割活性。这使得TALEN出现以后的应用
和发展十分迅速。最近, 又出现了一种新的基因
组修饰系统, 即CRSPR/Cas9系统。该系统利用
RNA介导靶序列的识别, 构建简单, 而且能一次识
别多个基因(Wang等2013)。CRISPR/Cas9系统的
识别位点为GN20GG (N为任意碱基), 因此靶位点
的选择上有一定的局限性。
2.2 TALEN构建方案
由于TALEN模块序列高度重复, 而且每一条
TALEN都需要大约20个模块, 所以如何方便快捷
低成本地组装这些模块显得尤为重要。目前的
TALEN组装方法有三种主要的策略(Joung和Sand-
er 2013): 标准的限制性酶切和连接组装、Golden
Gate组装方法以及固相组装法。标准的限制性酶
切和连接方法原理很简单, 但是工作量很繁重、
拼接慢, 不能大规模构建。比如REAL、REAL-
fast和NheI-SpeI方案都属于此类(Sander等2011b;
Reyon等2012a; Huang等2011)。Golden Gate用于
TALEN的拼接大大减少了工作量, 缩短了构建周
期, 这也是目前应用最为广泛的构建策略(Cermak
图1 ZFN/TALEN结构和TALE蛋白
Fig.1 Schematic structures of ZFN/TALEN and TALE proteins
A: ZFN结构。灰色序列代表DNA双链, 灰白色椭圆代表FokI的切割域(FN), 锌指与DNA的识别以锥形表示。B: 天然TALE蛋白。重复
单元以彩色矩形表示, N*代表13位RVD空缺, 半个矩形表示最后的半个重复单元, N端分泌信号、C端的核定位信号和转录激活域都以黑
色标出。C: TALEN结构。灰色序列代表DNA双链, 浅蓝色和粉红色长矩形分别代表NTS和CTS, 4种颜色的矩形分别表示4种识别模块。
李奇等: ZFN/TALEN技术与作物遗传改良 629
等2011; Geissler等2011; Li等2012; Li等2011b;
Morbitzer等2011; Sanjana等2012; Weber等2011;
Zhang等2011)。近期, 又有人报道了与Golden Gate
类似的LIC (ligation-independent cloning)拼接TAL-
EN (Schmid-Burgk等2013)。LIC保真性很强, 构建
速度快, 可以高通量构建。固相组装法的出现, 使
TALEN可以工厂化、低成本地大规模构建。这种
策略是先把模块固定在固相磁珠上, 然后在反应
体系中加入下一个模块和连接酶, 然后洗脱反应
液。重复此过程, 就可以完成模块拼接。这些连
接反应在磁珠上完成, 避免了重复的切胶, 电泳,
大肠杆菌转化工作。这类策略有Reyon等(2012b)
的FLASH (fast ligation-based automatable solid-
phase high-throughput)和Wang等(2012a)的ICA (it-
erative capped assembly)。
3 ZFN/TALEN的应用类型和植物应用实例
ZFN/TALEN第一次提供了一种高效的而且
相对简单的定点基因组修饰平台, 这恰恰是植物
基础研究和应用所急需的。早在2005年, 就有人
在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana
表1 植物中的ZFN/TALEN基因组编辑案例
Table 1 Reports on ZFN/TALEN-mediated genome-editing in plants
物种 靶序列 类型 研究内容 参考文献
拟南芥 ADH1 TALEN 用Golden Gate反应拼接TALEN模块, 并在拟南芥原生质 Cermak等2011
体中测试敲除ADH1基因
拟南芥 转基因 ZFN 农杆菌法获得2%的NHEJ突变, 从3 000株转基因苗中分离 de Pater等2009
3个HR事件
拟南芥 人工靶位点a ZFN 用拟南芥卵细胞增强子EASE启动ZFN Even-Faitelson
等2011
拟南芥 人工靶位点a ZFN 首次在植物中用ZFN产生最高19.6%的NHEJ变异 Lloyd等2005
拟南芥 ABI4 ZFN 发现拟南芥atku80突变体中发生NHEJ事件的效率比野生 Osakabe等2010
型高2.6倍
拟南芥 ADH1、TT4、 ZFN 在ku70和lig4背景拟南芥中, HR发生效率显著提高, NHEJ Qi等2013
MPK8 变异的特点也发生了改变, smc6b背景中, HR和NHEJ效率
都有提升
拟南芥、烟草 人工靶位点a ZFN 创建了用GUS活性检测突变事件的方法 Tovkach等2009
拟南芥、烟草 人工靶位点a ZFN 用NHEJ实现了基因替换, 即供体DNA与ZFN靶序列没有 Weinthal等2013
同源序列
拟南芥 ADH1、TT4 ZFN 用CoDA方法构建ZFN, 以16%的效率敲除了拟南芥的内 Zhang等2010
源基因
烟草 人工靶位点a、 ZFN 用ZFN在烟草内源基因上精准插入报告基因, 效率为10% Cai等2009
CHN50
烟草 Hax3-box TALEN 把天然的TALE-Hax3与FokI切割域融合, 在烟草叶片中能 Mahfouz等2011
检测到NHEJ变异
烟草 人工靶位点a ZFN 用两对ZFN高效地删除了转基因DNA片段 Petolino等2010
烟草 SurA、SurB ZFN 1对ZFN破坏烟草的2个同源基因 Townsend等2009
烟草 人工靶位点a ZFN 在烟草原生质体中用ZFN获得了10%的同源重组修复效率 Wright等2005
烟草 SurA、SurB TALEN 把TALEN转化烟草原生质体, 基因同源重组效率高达4% Zhang等2013
矮牵牛、烟草 人工靶位点a ZFN 用病毒表达载体TRV瞬时表达ZFN基因来代替稳定整合 Marton等2010
玉米 IPK1 ZFN 首次在玉米中以精准插入方式破坏内源基因 Shukla等2009
大豆 DCL1、DCL4、 ZFN 首次在大豆上用ZFN敲除重复基因, 并且用发根农杆菌快 Curtin等2011
RDR6、HEN1、 速检测ZFN切割活性
eGFP
水稻 Os11N3 TALEN 用TALEN敲除水稻的感病基因Os11N3, 提高了水稻的抗病性 Li等2012
衣藻b COP3 ZFN 在衣藻中实现了用ZFN敲除内源基因 Sizova等2012
短柄草d、水稻 BdSMC6等、 TALEN 用Golden Gate构建TALEN高效敲除了一系列短柄草和水 Shan等2013
OsBADH2等c 稻中的基因
　　a: 根据ZFN的识别序列设计好靶位点预先整合到植物基因组中; b: 衣藻(Chlamydomonas); c: OsDEP1、OsBADH1、OsCKX2、
OsSD1、BdABA、BdCKX2、BdSMC6、BdSPL、BdSPB、BdCOI1、BdRHT、BdHTA1; d: 短柄草(Brachypodium distachyon)。
植物生理学报630
tabacum)中用ZFN产生变异, 此后, 特别是TALEN
出现以后, 相继有文章报道了在模式植物和作物
中进行的基因组编辑(表1)。ZFN/TALEN产生的
DSB可以通过非同源末端连接(non-homologous
end joining, NHEJ)或同源重组(homologous recom-
bination, HR)机制进行修复(图2) (Urnov等2005),
修复过程中会产生多种基因组变异。接下来, 我
们将探讨各种变异类型如何用于作物的遗传改良,
并且分析已报道文献中植物, 特别是作物中的应
用实例。
3.1 定点突变
这种变异是基因组编辑中最容易实现也是最
常见的。ZFN/TALEN产生的DSB经由细胞的NHEJ
(non-homologous end joining)途径修复时, 经常在
断点处产生小片段DNA的插入或缺失(indels) (图
2)。如果这种突变发生在基因的编码区, 也就是外
显子上, 就有三分之二的概率产生移码突变, 导致
基因丧失功能, 即所谓的“基因敲除”。同样, 如果
发生在启动子上, 则极有可能破坏重要的顺式作
用元件, 导致基因的表达特性发生变化。
目前, 多种作物上都报道了这种定点突变, 比
如: 烟草(Nicotiana tabacum)、矮牵牛(Petunia hy-
brida)、大豆(Glycine max)、水稻(Oryza sativa) (表
1)。2011年Curtin等(2011)用CoDA构建的ZFN敲
除了大豆的内源基因。大豆是古四倍体, 大约75%
的大豆基因都是重复的。因此, 他们测试了用一
对ZFN敲除序列高度相似的重复基因。这种策略
对于其他有高度重复基因的物种也可以借鉴。首
先, 他们用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)
系统做了瞬时检测, 把有活性的ZFN转化100个外
植体, 获得的3株转基因苗中, 有2株发生了indel
突变。
黄单胞杆菌属的Xanthomonas oryzae能引起
水稻枯叶病, 给农业生产带来巨大损失。这种细
菌感染水稻时, 会分泌TALE蛋白结合到水稻OsS-
WEET14基因启动子的EBE元件上, 激活该基因表
达, 向细菌提供更多营养。OsSWEET14也是水稻
发育的重要基因, 不能简单的敲除。Li等(2012)用
TALEN破坏了EBE元件, 使OsSWEET14不受细菌
劫持, 而不影响其生长发育中的功能。他们用2对
TALEN获得的T1代植株中分别有48%和63%带有
indel变异, 与ZFN相比, 效率显著提高。突变后的
图2 ZFN/TALEN引起的基因组变异类型
Fig.2 ZFN/TALEN-induced genomic variations
A: ZFN/TALEN引起的序列改变。黑色剪刀代表ZFN/TALEN, 红色五角星代表indel突变; 基因精准插入中黄色部分代表要插入的
外源DAN片段, 黑色交叉线代表供体DNA与靶位点发生同源重组; 基因替换中黄色部分代表供体DNA中的与靶位点差异序列。B: ZFN/
TALEN引起的染色质结构变异。黑色竖杠代表中间片段缺失后, 两端直接连接处; 黑色箭头代表DNA序列的方向; 紫色和红色双线代表
两条不同的染色质。
李奇等: ZFN/TALEN技术与作物遗传改良 631
植株产生了明显的抗病性, 这是用ZFN/TALEN技
术改良作物的农艺性状的一个成功例子。
3.2 基因替换
除了基因定点敲除外, ZFN/TALEN还能产生
更为精细的操作。细胞修复DSB时, 如果加入与断
点处序列有部分同源的供体DNA, 则有可能通过
HR机制进行修复(图2)。修复时, 供体DNA与断点
处的序列发生同源重组, 替换掉内源序列。这种
操作需要把供体DNA与核酸酶表达载体同时导入
细胞, 难度更大。我们可以通过设计供体DNA序
列而得到预期的结果, 比如: 改变启动子元件、改
变基因的结构域、引入有利QTL或者替换不利
QTL。
2009年, Townsend等(2009)在烟草原生质体中
用同源重组改造了内源基因SurA和SurB。SurA和
SurB是烟草的乙酰乳酸合成酶, 特定的变异能带
来某种除草剂的抗性。Townsend等用电击法把
ZFN载体和供体DNA导入烟草原生质体, 获得了
从0.2%到4%的基因替换效率。
2013年, Zhang等(2013)又报道了用TALEN编
辑烟草SurA和SurB基因。他们用PEG方法把
TALEN载体和一个322 bp的供体DNA导入烟草原
生质体后, 不经药物筛选, 让原生质体恢复长成愈
伤组织。检测发现有4%的愈伤组织都能检测到供
体DNA上的6 bp标记。
值得注意的是, 最近Weinthal等(2013)报道了
用NHEJ方式实现了基因替换, 即供体DNA与靶位
点没有任何同源序列。首先, ZFN把要替换的基因
切下来, 在NHEJ修复的过程中, 可能把细胞中存在
的游离DNA整合到断点处。由于与HR相比, 植物
细胞更倾向于用NHEJ方式修复DSB, 这种方法也
许会提高基因替换的效率。
3.3 基因精准插入
除基因替换外, HR修复还可以实现外源DNA
的精准插入(图2)。与常规的转基因技术不同, 它
能在特定的位点插入外源DNA片段。一方面, 这
种插入可以破坏特定基因, 并且引入一个报告基
因, 便于检测。另一方面, 把外源基因插入到特定
的活跃表达的部位, 能显著地提高外源基因的表
达量。另外, 通过多次插入事件, 可以在同一位点
引入多个外源基因(比如一个合成途径的多种酶),
这样就可以把这些基因连锁在一起, 方便地导入
其他品种。
美国陶氏益农和Sangamo BioSciences公司合
作报道了在玉米中用ZFN把抗除草剂基因插入到
玉米(Zea mays) IPK1基因中(Shukla等2009)。玉米
IPK1基因编码肌醇-1,3,4,5,6-戊基磷酸酶, 该酶是
玉米种子中植酸生物合成的关键酶。植酸中的磷
占种子中磷总量的75%, 被认为是一种负营养, 而
且能产生磷污染。因此, 敲除IPK1基因, 降低玉米
种子的植酸含量, 是长久以来的愿望。Shukla等以
IPK1上的5个靶位点设计了66对ZFN, 通过酵母和
动物中的检测系统, 挑选出4对效率较高的ZFN与
供体DNA一起转化玉米细胞。在获得的600块抗
除草剂愈伤组织中, 检测到了预期的变异。
3.4 染色质结构变异
如果同时使用两对核酸酶, 在染色质上产生2
个切口, 修复时将有一定几率直接把切口接上而
删除掉中间的片段。这种DNA片段的删除有很多
用处。首先, 某些有调控活性的长链非编码RNA
(lncRNA)不能用移码突变方式敲除, 只能用这种
方式删除整个基因; 其次, 片段删除可用于去除转
基因时所带的报告基因; 再次, 也可以用来删除整
个不利基因簇, 改良作物。另外, 如果中间片段反
转后再修复, 则可能产生染色质的倒位。同样, 如
果两个切点在不同的染色质上, 则有可能产生染
色质的易位。
在应用方面, Petolino等(2010)首次报道了用
ZFN切除了4.3 kb的GUS表达盒。他们把含有GUS
表达盒的烟草与含有能识别GUS两侧位点的ZFN
的烟草杂交, 获得的F1子代中, 有35%丧失了GUS
活性。
真正的染色质结构变异在植物中还没有应用。
2010年, Lee等(2010)用ZFN在人类(Homo sapiens)
细胞中以10-3到10-1概率删除了最长15 Mb的大片
段。动物中也有很多染色质倒位、易位和重复的
报道(Brunet等2009; Simsek等2011; Lee等2012;
Gupta等2013)。这些变异产生的效率较低, 但是让
我们能在更复杂的染色质水平上改造物种。
4 ZFN/TALEN技术用于作物遗传改良-展望
当前形势下, 单纯依靠常规技术和扩大生产
规模将难以满足未来不断增长的粮食需求压力, 分
植物生理学报632
子育种和遗传工程成为必然的选择。ZFN/TALEN
等基因组编辑技术的出现为作物的遗传改良研究
带来了全新的希望。
赵开军等详细阐述了TALEN法改良植物基因
组的具体步骤(赵开军和杨兵2012)。我们认为具
体到作物改良, 基因组编辑技术有以下几个优势:
首先, 可以通过片段置换引入有利的QTL, 甚至可
以是其他物种的QTL。还可以通过片段置换和片
表2 部分已全基因组测序的作物
Table 2 Part of whole genome sequenced crops
作物名称 拉丁文学名 品种/自交系 染色质数目 染色质倍性 基因组大小 参考文献
水稻 Oryza sativa ssp. indica 93-11 24, n=12 二倍体 466 Mb Yu等2002
水稻 Oryza sativa ssp. japonica Nipponbare 24, n=12 二倍体 420 Mb Goff等2002
杨树 Populus trichocarpa Nisqually 1 38, n=19 二倍体 485 Mb Tuskan等2006
葡萄 Vitis vinifera PN40024a 38, n=19 二倍体 487 Mb Jaillon等2007
木瓜 Carica papaya SunUp 18, n=9 二倍体 372 Mb Ming等2008
黄瓜 Cucumis sativus 9930 14, n=7 二倍体 367 Mb Huang等2009
玉米 Zea mays B73 20, n=10 二倍体 2.2 Gb Schnable等2009
高粱 Sorghum bicolor BTx623 20, n=10 二倍体 730 Mb Paterson等2009
蓖麻 Ricinus communis Hale 20, n=10 二倍体 350 Mb Chan等2010
大豆 Glycine max Williams 82 40, n=20 二倍体 1.1 Gb Schmutz等2010
土豆 Solanum tuberosumb Phureja 24, n=24 二倍体 844 Mb Xu等2011
野生草莓c Fragaria vesca Hawaii 4 14, n=7 二倍体 240 Mb Shulaev等2011
大麻 Cannabis sativa Purple Kush 20, n=10 二倍体 818 Mb van Bakel等2011
木豆 Cajanus cajan ICPL 87119 22, n=11 二倍体 833 Mb Varshney等2011
可可树 Theobroma cacao B97-61/B2 20, n=10 二倍体 430 Mb Argout等2011
大白菜 Brassica rapa Chiifu-401-42 20, n=10 二倍体 284 Mb Wang等2011
西红柿 Solanum lycopersicum Heinz 1706 24, n=12 二倍体 900 Mb Sato等2012
亚麻 Linum usitatissimum CDC Bethune 30, n=15 二倍体 373 Mb Wang等2012b
木薯 Manihot esculenta AM560-2 36, n=18 二倍体 770 Mb Prochnik等2012
甜瓜 Cucumis melo DHL92 24, n=12 二倍体 375 Mb Garcia-Mas等2012
梅花 Prunus mume Tongmai WTd 16, n=8 二倍体 237 Mb Zhang等2012b
棉花e Gossypium raimondii D5-3 26, n=13 二倍体 880 Mb Wang等2012c
香蕉f Musa acuminata DH-Pahang 22, n=11 二倍体 523 Mb DHont等2012
大麦 Hordeum vulgare Morex 14, n=7 二倍体 5.1 Gb International Barley
Genome Sequencing
Consortium等2012
小麦 Triticum aestivum Chinese Spring 42, n=21 异源六倍体 17 Gb Brenchley等2012
谷子 Setaria italica Zhang gu 18, n=9 二倍体 490 Mb Zhang等2012a
橡胶树 Hevea brasiliensis RRIM 600 36, n=18 二倍体 2.15 Gb Rahman等2013
西瓜 Citrullus lanatus 97103 22, n=11 二倍体 425 Mb Guo等2013
梨 Pyrus bretschneideri Dangshansuli 34, n=17 二倍体 512 Mb Wu等2013
桃 Prunus persica Lovell 16, n=8 二倍体 265 Mb The International
Peach Genome
Initiative等2013
鹰嘴豆 Cicer arietinum kabuli 16, n=8 二倍体 738 Mb Varshney等2013
乌拉尔图小麦g Triticum urartu G1812 14, n=7 二倍体 4.94 Gb Ling等2013
毛竹 Phyllostachys heterocycla pubescens 48, n=24 二倍体 2.075 Gb Peng等2013
粗山羊草h Aegilops tauschii AL8/78 14, n=7 二倍体 4.36 Gb Jia等2013
苹果 Malus X domesticai Golden Delicious 34, n=17 二倍体 742 Mb Velasco等2010
　　a: PN40024为93%纯合的葡萄品种。b: 大部分栽培土豆是四倍体, 高度杂合, 该测序品种是加倍单倍体。c: 普通草莓为异源八倍体,
基因组复杂, 因此选用这种二倍体野生草莓测序。d: 栽培梅花高度杂合, 测序品种为取自西藏的野生品种。e: 栽培棉花为多倍体, 测序品
种是二倍体棉花。f: 栽培香蕉大多是异源三倍体, 该测序品种是二倍体小果野蕉。g: 普通小麦的A基因组来源。h: 普通小麦的D基因组
来源。i: 大部分栽培苹果高度杂合, Golden Delicious杂合度较低。
李奇等: ZFN/TALEN技术与作物遗传改良 633
段删除去除不利的QTL。其次, 用此技术可以在某
一固定位置引入外源基因, 这样可以确保高表达
量并且不引起内源基因的改变。另外还可以依次
引入多个外源片段, 并且这些片段都可以连锁起
来遗传。这些都是转基因技术不易实现的。再次,
利用该技术改良农作物时, 可以做到仅仅改变一
个或几个碱基, 与传统的转基因技术相比, 安全性
要更高, 性质上类似于自发突变, 能在一定程度上
减少公众的疑虑。最后, 此技术提供的染色质层
面的修饰, 使我们可以最大限度的去改良作物。
除了功能强大外, ZFN/TALEN技术的另一个
特点是简单高效。ZFN/TALEN融合蛋白在任何一
个分子实验室都能很方便的构建成功, 不存在困
难。在实际使用中面临的问题可能是如何把载体
和供体DNA导入到植物细胞。目前, 报道最多的
是用农杆菌稳定整合方法, 然后在子代中分离转
基因成分(Li等2012)。因为ZFN/TALEN只需在细
胞中表达发挥作用就行, 并不需要稳定整合, 瞬时
表达体系成为更好的选择。Marton等(2010)用
TRV病毒表达系统在烟草和矮牵牛中使用ZFN成
功获得了突变的子代。Zhang等(2013)用PEG法把
TALEN和供体DNA导入烟草原生质体, 在发生同
源重组的再生植株中大部分都没有TALEN表达基
因的整合。当前, 大部分作物都已经建立了稳定
表达或瞬时表达体系(如农杆菌转化、基因枪转
化、原生质体转化等), 可以很方便地应用ZFN/
TA L E N技术。效率方面 , B e d e l l等 ( 2 0 1 2 )用
GoldyTALEN敲除斑马鱼基因时, 在某些位点达到
了100%的效率。在烟草中 , Zhang等(2013)用
TALEN敲除基因和基因替换的效率分别是30%和
14%。可以说, 如此高的效率可以很大程度上降低
实际应用过程中的工作量。
在作物遗传改良研究中, 应用基因组编辑技
术的两大前提是序列信息已知和基因功能清楚。
当前, 高通量测序技术突飞猛进, 已经有30多种粮
食和经济作物完成了全基因组测序 , 为Z F N /
TALEN技术的应用打下了良好的基础(表2)。目前
以拟南芥、水稻等为代表的模式植物的功能基因
组学研究非常地广泛和深入 , 小麦、玉米、大
麦、高粱、番茄、土豆等作物的研究也进展迅速,
越来越多的基因调控网络被发掘出来, 为作物的
遗传工程改良研究提供了源源不断的极佳的思
路。这些进展必将显著地促进应用ZFN/TALEN技
术改良作物的研究, 对作物的遗传改良产生革命
性的影响。
参考文献
赵开军, 杨兵(2012). TALENs: 植物基因组定点剪辑的分子剪. 中
国农业科学, 45 (14): 2787~2792
钟强, 赵书红(2010). 锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用. 遗传,
33 (2): 123~130
Argout X, Salse J, Aury JM, Guiltinan MJ, Droc G, Gouzy J, Allegre
M, Chaparro C, Legavre T, Maximova SN et al (2011). The ge-
nome of Theobroma cacao. Nat Genet, 43 (2): 101~108
Bedell VM, Wang Y, Campbell JM, Poshusta TL, Starker CG, Krug
RG 2nd, Tan W, Penheiter SG, Ma AC, Leung AY et al (2012).
In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.
Nature, 491 (7422): 114~118
Bibikova M, Carroll D, Segal DJ (2001). Stimulation of homologous
recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases.
Mol Cell Biol, 21 (1): 289~297
Bibikova M, Golic M, Golic KG, Carroll D (2002). Targeted chromo-
somal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger
nucleases. Genetics, 161 (3): 1169~1175
Boch J, Bonas U (2010). Xanthomonas AvrBs3 family-type III ef-
fectors: discovery and function. Annu Rev Phytopathol, 48:
419~436
Boch J, Scholze H, Schornack S, Landgraf A, Hahn S, Kay S, Lahaye
T, Nickstadt A, Bonas U (2009). Breaking the code of DNA
binding specificity of TAL-type III effectors. Science, 326 (5959):
1509~1512
Brenchley R, Spannagl M, Pfeifer M, Barker GL, DAmore R, Al-
len AM, McKenzie N, Kramer M, Kerhornou A, Bolser D et
al (2012). Analysis of the bread wheat genome using whole-
genome shotgun sequencing. Nature, 491 (7426): 705~710
Brunet E, Simsek D, Tomishima M, DeKelver R, Choi VM, Gregory P,
Urnov F, Weinstock DM, Jasin M (2009). Chromosomal translo-
cations induced at specified loci in human stem cells. Proc Natl
Acad Sci USA, 106 (26): 10620~10625
Cai CQ, Doyon Y, Ainley WM, Miller JC, Dekelver RC, Moehle
EA, Rock JM, Lee YL, Garrison R, Schulenberg L et al (2009).
Targeted transgene integration in plant cells using designed zinc
finger nucleases. Plant Mol Biol, 69 (6): 699~709
Cermak T, Doyle EL, Christian M, Wang L, Zhang Y, Schmidt C,
Baller JA, Somia NV, Bogdanove AJ, Voytas DF (2011). Ef-
ficient design and assembly of custom TALEN and other TAL
effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res,
39 (12): e82
Chan AP, Crabtree J, Zhao Q, Lorenzi H, Orvis J, Puiu D, Melake-
Berhan A, Jones KM, Redman J, Chen G (2010). Draft genome
sequence of the oilseed species Ricinus communis. Nat Biotech-
nol, 28 (9): 951~956
Chen S, Oikonomou G, Chiu CN, Niles BJ, Liu J, Lee DA, An-
toshechkin I, Prober DA (2013). A large-scale in vivo analysis
reveals that TALENs are significantly more mutagenic than
ZFNs generated using context-dependent assembly. Nucleic Ac-
植物生理学报634
ids Res, 41 (4): 2769~2778
Choulika A, Perrin A, Dujon B, Nicolas JF (1995). Induction of ho-
mologous recombination in mammalian chromosomes by using
the I-SceI system of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol,
15 (4): 1968~1973
Cohen-Tannoudji M, Babinet C (1998). Beyond knock-out mice: new
perspectives for the programmed modification of the mammalian
genome. Mol Hum Report, 4 (10): 929~938
Curtin SJ, Zhang F, Sander JD, Haun WJ, Starker C, Baltes NJ,
Reyon D, Dahlborg EJ, Goodwin MJ, Coffman AP et al (2011).
Targeted mutagenesis of duplicated genes in soybean with zinc-
finger nucleases breakthrough technologies. Plant Physiol, 156
(2): 466~473
de Pater S, Neuteboom LW, Pinas JE, Hooykaas PJ, van der Zaal BJ
(2009). ZFN-induced mutagenesis and gene-targeting in Arabi-
dopsis through Agrobacterium-mediated floral dip transforma-
tion. Plant Biotechnol J, 7 (8): 821~835
Deng D, Yan C, Pan X, Mahfouz M, Wang J, Zhu JK, Shi Y, Yan N
(2012). Structural basis for sequence-specific recognition of
DNA by TAL effectors. Science, 335 (6069): 720~723
DHont A, Denoeud F, Aury JM, Baurens FC, Carreel F, Garsmeur
O, Noel B, Bocs S, Droc G, Rouard M et al (2012). The banana
(Musa acuminata) genome and the evolution of monocotyledon-
ous plants. Nature, 488 (7410): 213~217
Doyon Y, Vo TD, Mendel MC, Greenberg SG, Wang J, Xia DF, Miller
JC, Urnov FD, Gregory PD, Holmes MC (2011). Enhancing
zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodi-
meric architectures. Nat Methods, 8 (1): 74~79
Even-Faitelson L, Samach A, Melamed-Bessudo C, Avivi-Ragolsky N,
Levy AA (2011). Localized egg-cell expression of effector pro-
teins for targeted modification of the Arabidopsis genome. Plant
J, 68 (5): 929~937
Garcia-Mas J, Benjak A, Sanseverino W, Bourgeois M, Mir
G, González VM, Hénaff E, Câmara F, Cozzuto L, Lowy E et
al (2012). The genome of melon (Cucumis melo L.). Proc Natl
Acad Sci USA, 109 (29): 11872~11877
Geissler R, Scholze H, Hahn S, Streubel J, Bonas U, Behrens SE,
Boch J (2011). Transcriptional activators of human genes with
programmable DNA-specificity. PLoS One, 6 (5): e19509
Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y, Zeitler B, Miller JC, Choi VM, Jen-
kins SS, Wood A, Cui X, Meng X et al (2009). Knockout rats
via microinjection of zinc-finger nucleases. Science, 325 (5939):
433~433
Goff SA, Ricke D, Lan TH, Presting G, Wang R, Dunn M, Glazebrook
J, Sessions A, Oeller P, Varma H et al (2002). A draft sequence
of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science, 296
(5565): 92~100
Guo S, Zhang J, Sun H, Salse J, Lucas WJ, Zhang H, Zheng Y, Mao
L, Ren Y, Wang Z et al (2013). The draft genome of watermelon
(Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.
Nat Genet, 45 (1): 51~58
Gupta A, Christensen RG, Rayla AL, Lakshmanan A, Stormo GD,
Wolfe SA (2012). An optimized two-finger archive for ZFN-
mediated gene targeting. Nat Methods, 9 (6): 588~590
Gupta A, Hall VL, Kok FO, Shin M, McNulty JC, Lawson ND, Wolfe
SA (2013). Targeted chromosomal deletions and inversions in
zebrafish. Genome Res, 23 (6): 1008~1017
Handel EM, Alwin S, Cathomen T (2009). Expanding or restrict-
ing the target site repertoire of zinc-finger nucleases: the inter-
domain linker as a major determinant of target site selectivity.
Mol Ther, 17 (1): 104~111
Huang P, Xiao A, Zhou M, Zhu Z, Lin S, Zhang B (2011). Heritable
gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Bio-
technol, 29 (8): 699~700
Huang S, Li R, Zhang Z, Li L, Gu X, Fan W, Lucas WJ, Wang X, Xie
B, Ni P et al (2009). The genome of the cucumber, Cucumis sati-
vus L.. Nat Genet, 41 (12): 1275~1281
International Barley Genome Sequencing Consortium, Mayer
KF, Waugh R, Brown JW, Schulman A, Langridge P, Platzer
M, Fincher GB, Muehlbauer GJ, Sato K et al (2012). A physical,
genetic and functional sequence assembly of the barley genome.
Nature, 491 (7426): 711~716
Jaillon O, Aury JM, Noel B, Policriti A, Clepet C, Casagrande
A, Choisne N, Aubourg S, Vitulo N, Jubin C et al (2007). The
grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization
in major angiosperm phyla. Nature, 449 (7161): 463~467
Jia J, Zhao S, Kong X, Li Y, Zhao G, He W, Appels R, Pfeifer M, Tao Y,
Zhang X et al (2013). Aegilops tauschii draft genome sequence
reveals a gene repertoire for wheat adaptation. Nature, 496
(7443): 91~95
Joung JK, Sander JD (2013). TALENs: a widely applicable technol-
ogy for targeted genome editing. Nat Rev Mol Cell Biol, 14 (1):
49~55
Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S (1996). Hybrid restriction en-
zymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl
Acad Sci USA, 93(3): 1156~1160
Klug A (2010). The discovery of zinc fingers and their applications in
gene regulation and genome manipulation. Annu Rev Biochem,
79: 213~231
Lee HJ, Kim E, Kim JS (2010). Targeted chromosomal deletions in
human cells using zinc finger nucleases. Genome Res, 20 (1):
81~89
Lee HJ, Kweon J, Kim E, Kim S, Kim JS (2012).Targeted chromo-
somal duplications and inversions in the human genome using
zinc finger nucleases. Genome Res, 22 (3): 539~548
Li T, Huang S, Jiang WZ, Wright D, Spal ding MH, Weeks DP, Yang
B (2011a). TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed
of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain. Nucleic Acids
Res, 39 (1): 359~372
Li T, Huang S, Zhao X, Wright DA, Carpenter S, Spalding MH,
Weeks DP, Yang B (2011b). Modularly assembled designer TAL
effector nucleases for targeted gene knockout and gene replace-
ment in eukaryotes. Nucleic Acids Res, 39 (14): 6315~6325
Li T, Liu B, Spalding MH, Weeks DP, Yang B (2012). High-efficiency
TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice. Nat
Biotechnol, 30 (5): 390~392
Ling HQ, Zhao S, Liu D, Wang J, Sun H, Zhang C, Fan H, Li D,
Dong L, Tao Y et al (2013). Draft genome of the wheat A-genome
progenitor Triticum urartu. Nature, 496 (7443): 87~90
Lloyd A, Plaisier CL, Carroll D, Drews GN (2005). Targeted muta-
genesis using zinc-finger nucleases in Arabidopsis. Proc Natl
Acad Sci USA, 102 (6): 2232~2237
Maeder ML, Hibodeau-Beganny S, Osiak A, Wright DA, Anthony RM,
Eichtinger M, Jiang T, Foley JE, Winfrey RJ et al (2008). Rapid
李奇等: ZFN/TALEN技术与作物遗传改良 635
“open-source” engineering of customized zinc-finger nucleases for
highly efficient gene modification. Mol Cell, 31 (2): 294~301
Mahfouz MM, Li L, Shamimuzzaman M, Wibowo A, Fang X, Zhu JK
(2011). De novo-engineered transcription activator-like effec-
tor (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity
creates double-strand breaks. Proc Natl Acad Sci USA, 108 (6):
2623~2628
Mak AN, Bradley P, Cernadas RA, Bogdanove AJ, Stoddard BL
(2012). The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to
its DNA target. Science, 335 (6069): 716~719
Marton I, Zuker A, Shklarman E, Zeevi V, Tovkach A, Roffe S,
Ovadis M, Tzfira T, Vainstein A (2010). Non-transgenic genome
modification in plant cells. Plant Physiol, 154 (3): 1079~1087
Meng X, Noyes MB, Zhu LJ, Lawson ND, Wolfe SA (2008). Targeted
gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucle-
ases. Nat Biotechnol, 26 (6): 695~701
Miller JC, Holmes MC, Wang J, Guschin DY, Lee YL, Rupniewski I,
Beausejour CM, Waite AJ, Wang NS, Kim KA et al (2007). An
improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific
genome editing. Nat Biotechnol, 25 (7): 778~785
Ming R, Hou S, Feng Y, Yu Q, Dionne-Laporte A, Saw JH, Senin
P, Wang W, Ly BV, Lewis KL et al (2008). The draft genome
of the transgenic tropical fruit tree papaya (Carica papaya Lin-
naeus). Nature, 452 (7190): 991~996
Morbitzer R, Elsaesser J, Hausner J, Lahaye T (2011). Assembly of
custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning.
Nucleic Acids Res, 39 (13): 5790~5799
Moscou MJ, Bogdanove AJ (2009). A simple cipher governs DNA
recognition by TAL effectors. Science, 326 (5959): 1501~1501
Osakabe K, Osakabe Y, Toki S (2010). Site-directed mutagenesis in
Arabidopsis using custom-designed zinc finger nucleases. Proc
Natl Acad Sci USA, 107 (26): 12034~12039
Pabo CO, Peisach E, Grant RA (2001). Design and selection of novel
Cys2His2 zinc finger proteins. Annu Rev Biochem, 70: 313~340
Paterson AH, Bowers JE, Bruggmann R, Dubchak I, Grimwood J,
Gundlach H, Haberer G, Hellsten U, Mitros T, Poliakov A et al
(2009). The Sorghum bicolor genome and the diversification of
grasses. Nature, 457 (7229): 551~556
Peng Z, Lu Y, Li L, Zhao Q, Feng Q, Gao Z, Lu H, Hu T, Yao N, Liu
K et al (2013). The draft genome of the fast-growing non-timber
forest species moso bamboo (Phyllostachys heterocycla). Nat
Genet, 45 (4): 456~461
Perez EE, Wang J, Miller JC, Jouvenot Y, Kim KA, Liu O, Wang N,
Lee G, Bartsevich VV, Lee YL et al (2008). Establishment of
HIV-1 resistance in CD4-T cells by genome editing using zinc-
finger nucleases. Nat Biotechnol, 26 (7): 808~816
Petolino JF, Worden A, Curlee K, Connell J, Strange Moynahan TL,
Larsen C, Russell S (2010). Zinc finger nuclease-mediated trans-
gene deletion. Plant Mol Biol, 73 (6): 617~628
Prochnik S, Marri PR, Desany B, Pablo D. Rabinowicz, Kodira C,
Mohiuddin M, Rodriguez F, Fauquet C, Tohme J, Harkins T et al
(2012). The cassava genome: current progress, future directions.
Tropical Plant Biol, 5 (1): 88~94
Qi Y, Zhang Y, Zhang F, Baller JA, Cleland SC, Ryu Y, Starker CG,
Voytas DF (2013). Increasing frequencies of site-specific muta-
genesis and gene targeting in Arabidopsis by manipulating DNA
repair pathways. Genome Res, 23 (3): 547~554
Rahman AY, Usharraj AO, Misra BB, Thottathil GP, Jayasekaran
K, Feng Y, Hou S, Ong SY, Ng FL, Lee LS et al (2013). Draft
genome sequence of the rubber tree Hevea brasiliensis. BMC
Genomics, 14: 75
Ramirez CL, Foley JE, Wright DA, Muller-Lerch F, Rahman SH,
Cornu TI, Winfrey RJ, Sander JD, Fu F, Townsend JA et al (2008).
Unexpected failure rates for modular assembly of engineered
zinc fingers. Nat Methods, 5 (5):374~375
Reyon D, Khayter C, Regan MR, Joung JK, Sander JD (2012a). En-
gineering designer transcription activator-like effector nucleases
(TALENs) by REAL or REAL-Fast assembly. Curr Protoc Mol
Biol, 100: 12.15.1~12.15.14
Reyon D, Tsai SQ, Khayter C, Foden JA, Sander JD, Joung JK (2012b).
FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome edit-
ing. Nat Biotechnol, 30 (5): 460~465
Rouet P, Smih F, Jasin M (1994). Expression of a site-specific endo-
nuclease stimulates homologous recombination in mammalian
cells. Proc Natl Acad Sci USA, 91 (13): 6064~6068
Sander JD, Cade L, Khayter C, Reyon D, Peterson RT, Joung JK, Yeh
JR (2011b). Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells
using engineered TALENs. Nat Biotechnol, 29 (8): 697~698
Sander JD, Dahlborg EJ, Goodwin MJ, Cade L, Zhang F, Cifuentes
D, Curtin SJ, Blackburn JS, Thibodeau-Beganny S, Qi Y et al
(2011a). Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by
context-dependent assembly (CoDA). Nat Methods, 8 (1): 67~69
Sanjana NE, Cong L, Zhou Y, Cunniff MM, Feng G, Zhang F (2012).
A transcription activator-like effector toolbox for genome engi-
neering. Nat Protoc, 7 (1): 171~192
Sato S, Tabata S, Hirakawa H, Asamizu E, Shirasawa K, Isobe
S, Kaneko T, Nakamura Y, Shibata D, Aoki K et al (2012). The
tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evo-
lution. Nature, 485 (7400): 635~641
Schmid-Burgk JL, Schmidt T, Kaiser V, Honing K, Hornung V (2013).
A ligation-independent cloning technique for high-throughput
assembly of transc ription activator-like effector genes. Nat Bio-
technol, 31 (1): 76~81
Schmutz J, Cannon SB, Schlueter J, Ma J, Mitros T, Nelson W, Hyten
DL, Song Q, Thelen JJ, Cheng J et al (2010). Genome sequence
of the palaeopolyploid soybean. Nature, 463 (7278): 178~183
Schnable PS, Ware D, Fulton RS, Stein JC, Wei F, Pasternak S, Liang
C, Zhang J, Fulton L, Graves TA et al (2009). The B73 maize ge-
nome: complexity, diversity, and dynamics. Science, 326 (5956):
1112~1115
Shan Q, Wang Y, Chen K, Liang Z, Li J, Zhang Y, Zhang K, Liu
J, Voytas DF, Zheng X et al (2013). Rapid and efficient gene
modification in rice and Brachypodium using TALENs. Mol
Plant, doi: 10.1093/mp/sss162
Shukla VK, Doyon Y, Miller JC, Dekelver RC, Moehle EA, Worden
SE, Mitchell JC, Arnold NL, Gopalan S, Meng X et al (2009).
Precise genome modification in the crop species Zea mays using
zinc-finger nucleases. Nature, 459 (7245): 437~441
Shulaev V, Sargent DJ, Crowhurst RN, Mockler TC, Folkerts
O, Delcher AL, Jaiswal P, Mockaitis K, Liston A, Mane SP et al
(2011). The genome of woodland strawberry (Fragaria vesca).
Nat Genet, 43 (2): 109~116
Simsek D, Brunet E, Wong SY, Katyal S, Gao Y, McKinnon PJ, Lou
J, Zhang L, Li J, Rebar EJ et al (2011). DNA ligase III promotes
植物生理学报636
alternative nonhomologous end-joining during chromosomal
translocation formation. PLoS Genet, 7 (6): e1002080
Sizova I, Greiner A, Awasthi M, Kateriya S, Hegemann P (2012). Nu-
clear gene targeting in Chlamydomonas using engineered zinc-
finger nucleases. Plant J, 73 (5): 873~882
Sood R, Carrington B, Bishop K, Jones M, Rissone A, Candotti F,
Chandrasekharappa SC, Liu P (2013). Efficient methods for tar-
geted mutagenesis in zebrafish using zinc-finger nucleases: data
from targeting of nine genes using compoZr or CoDA ZFNs.
PLoS One, 8 (2): e57239
The International Peach Genome Initiative, Verde I, Abbott AG, Sca-
labrin S, Jung S, Shu S, Marroni F, Zhebentyayeva T, Dettori
MT, Grimwood J et al (2013). The high-quality draft genome
of peach (Prunus persica) identifies unique patterns of genetic
diversity, domestication and genome evolution. Nat Genet, 45:
487~494
Tovkach A, Zeevi V, Tzfira T (2009). A toolbox and procedural notes
for characterizing novel zinc finger nucleases for genome editing
in plant cells. Plant J, 57 (4): 747~757
Townsend JA, Wright DA, Winfrey RJ, Fu F, Maeder ML, Joung JK,
Voytas DF (2009). High-frequency modification of plant genes
using engineered zinc-finger nucleases. Nature, 459 (7245):
442~445
Tuskan GA, Difazio S, Jansson S, Bohlmann J, Grigoriev I, Hellsten
U, Putnam N, Ralph S, Rombauts S, Salamov A et al (2006).
The genome of black cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. &
Gray). Science, 313 (5793): 1596~1604
Urnov FD, Miller JC, Lee YL, Beausejour CM, Rock JM, Augustus
S, Jamieson AC, Porteus MH Gregory PD Holmes MC (2005).
Highly efficient endogenous gene correction using designed
zinc-finger nucleases. Nature, 435 (7042): 646~651
van Bakel H, Stout JM, Cote AG, Tallon CM, Sharpe AG, Hughes
TR, Page JE et al (2011). The draft genome and transcriptome of
Cannabis sativa. Genome Biol, 12 (10): R102
Varshney RK, Chen W, Li Y, Bharti AK, Saxena RK, Schlueter JA,
Donoghue MT, Azam S, Fan G, Whaley AM et al (2011). Draft
genome sequence of pigeonpea (Cajanus cajan), an orphan legume
crop of resource-poor farmers. Nat Biotechnol, 30 (1): 83~89
Varshney RK, Song C, Saxena RK, Azam S, Yu S, Sharpe AG, Can-
non S, Baek J, Rosen BD, Taran B et al (2013). Draft genome
sequence of chickpea (Cicer arietinum) provides a resource for
trait improvement. Nat Biotechnol, 31 (3): 240~246
Velasco R, Zharkikh A, Affourtit J, Dhingra A, Cestaro A, Kalyanara-
man A, Fontana P, Bhatnagar SK, Troggio M, Pruss D et al
(2010). The genome of the domesticated apple (Malus×domestica
Borkh.). Nat Genet, 42 (10): 833~839
Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang
F, Jaenisch R (2013). One-step generation of mice carrying
mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome
engineering. Cell, 153 (4): 910~918
Wang K, Wang Z, Li F, Ye W, Wang J, Song G, Yue Z, Cong L, Shang
H, Zhu S et al (2012c). The draft genome of a diploid cotton
Gossypium raimondii. Nat Genet, 44 (10): 1098~1103
Wang X, Wang H, Wang J, Sun R, Wu J, Liu S, Bai Y, Mun JH, Ban-
croft I, Cheng F et al (2011). The genome of the mesopolyploid
crop species Brassica rapa. Nat Genet, 43 (10): 1035~1039
Wang Z, Li J, Huang H, Wang G, Jiang M, Yin S, Sun C, Zhang
H, Zhuang F, Xi JJ (2012a). An integrated chip for the high-
throughput synthesis of transcription activator-like effectors.
Angew Chem Int Ed Engl, 51 (34): 8505~8508
Wang Z, Hobson N, Galindo L, Zhu S, Shi D, McDill J, Yang
L, Hawkins S, Neutelings G, Datla R et al (2012b). The genome
of flax (Linum usitatissimum) assembled de novo from short
shotgun sequence reads. Plant J, 72 (3): 461~473
Weber E, Gruetzner R, Werner S, Engler C, Marillonnet S (2011). As-
sembly of designer TAL effectors by Golden Gate cloning. PLoS
One, 6 (5): e19722
Weinthal DM, Taylor RA, Tzfira T (2013). Nonhomologous end join-
ing-mediated gene replacement in plant cells. Plant Physiol, 162:
1390~1400
Wright DA, Hibodeau-Beganny S, Sander JD, Winfrey RJ, Hirsh
AS, Eichtinger M, Fu F, Porteus MH, Dobbs D, Voytas DF et
al (2006). Standardized reagents and protocols for engineering
zinc finger nucleases by modular assembly. Nat Protoc, 1 (3):
1637~1652
Wright DA, Townsend JA, Winfrey RJ Jr, Irwin PA, Rajagopal J,
Lonosky PM, Hall BD, Jondle MD, Voytas DF (2005). High-
frequency homologous recombination in plants mediated by
zinc-finger nucleases. Plant J, 44 (4): 693~705
Wu J, Wang Z, Shi Z, Zhang S, Ming R, Zhu S, Khan MA, Tao
S, Korban SS, Wang H et al (2013). The genome of the pear
(Pyrus bretschneideri Rehd.). Genome Res, 23 (2): 396~408
Xu X, Pan S, Cheng S, Zhang B, Mu D, Ni P, Zhang G, Yang S, Li
R, Wang J et al (2011). Genome sequence and analysis of the
tuber crop potato. Nature, 475 (7355): 189~195
Yu J, Hu S, Wang J, Wong GK, Li S, Liu B, Deng Y, Dai L, Zhou
Y, Zhang X et al (2002). A draft sequence of the rice genome
(Oryza sativa L. ssp. indica). Science, 296 (5565): 79~92
Zhang F, Cong L, Lodato S, Kosuri S, Church GM, Arlotta P (2011).
Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for
modulating mammalian transcription. Nat Biotechnol, 29 (2):
149~153
Zhang F, Maeder ML, Unger-Wallace E, Hoshaw JP, Reyon D, Chris-
tian M, Li X, Pierick CJ, Dobbs D, Peterson T et al (2010).
High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana
using zinc finger nucleases. Proc Natl Acad Sci USA, 107 (26):
12028~12033
Zhang G, Liu X, Quan Z, Cheng S, Xu X, Pan S, Xie M, Zeng P, Yue Z,
Wang W et al (2012a). Genome sequence of foxtail millet (Setaria
italica) provides insights into grass evolution and biofuel poten-
tial. Nat Biotechnol, 30 (6): 549~554
Zhang Q, Chen W, Sun L, Zhao F, Huang B, Yang W, Tao Y, Wang
J, Yuan Z, Fan G et al (2012b). The genome of Prunus mume.
Nat Commun, 3: 1318
Zhang Y, Zhang F, Li X, Baller JA, Qi Y, Starker CG, Bogdanove AJ,
Voytas DF (2013). Transcription activator-like effector nucleases
enable efficient plant genome engineering. Plant Physiol, 161 (1):
20~27