全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (9): 1429~1434　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0262 1429
收稿 2014-05-28　　修定 2014-06-30
资助 杭州市科技发展计划项目(20120332H03)。
* 共同通讯作者(E-mail: lcn0814@126.com, Tel: 0571-
87313243; E-mail: hrcui@zju.edu.cn, Tel: 0571-86971405)。
利用SRAP标记分析中国主栽孔雀草品种的遗传多样性
李春楠1,*, 傅巧娟1, 陈一1, 赵福康1, 孙瑶1, 崔海瑞2,*
1杭州市农业科学研究院园艺研究所, 杭州310024; 2浙江大学原子核农业科学研究所, 农业部核农学重点开放实验室, 杭州
310029
摘要: 为了解中国主栽孔雀草品种的遗传背景, 采用相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记分析了28份孔雀草材料的遗传多
样性。14对SRAP引物组合共获得271个位点, 其中多态位点151个, 占55.72%。每对引物可扩增出14~24条DNA片段, 平均
19.4条。引物的多态信息含量PIC值在0.693~0.967之间, 平均为0.909; 每个材料得到的多态性条带比例介于38.78%与
51.42%之间, 平均46.38%, 说明SRAP分子标记可有效鉴别孔雀草种质在分子水平上的遗传变异。品种间的遗传距离值在
0.047~0.198之间, 平均为0.126; Shannon多样性指数变化于0.178~0.217之间, 平均0.201, 表明参试的孔雀草材料总体的遗传
多样性水平较低。UPGMA聚类后, 在遗传距离阈值为0.146处, 可将28份材料分为4大类群, 与花色表现基本相符, 花色可
考虑作为孔雀草基于表型分类的主要因子。本研究结果对孔雀草品种鉴定、杂交育种中亲本选配和分子标记辅助选择具
有重要意义。
关键词: 孔雀草; 遗传多样性; SRAP; 聚类
Analysis of Genetic Diversity of the Major Tagetes patula Varieties in China
Using SRAP Markers
LI Chun-Nan1,*, FU Qiao-Juan1, CHEN Yi1, ZHAO Fu-Kang1, SUN Yao1, CUI Hai-Rui2,*
1Institute of Horticulture, Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310024, China; 2Key Laboratory of Nuclear Agricul-
tural Sciences, Ministry of Agriculture, Institute of Nuclear-Agricultural Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China
Abstract: In order to understand the genetic variation of Tagetes patula varieties in China, the genetic diversity
of 28 major cultivars was assessed using SRAP (sequence-related amplified polymorphism) markers. A total of
271 scorable fragments were identified with 14 primer combinations, of which 151 (55.72%) were polymor-
phic. Each primer pairs amplified 14 to 24 DNA bands with an average of 19.4 bands. The polymorphism infor-
mation content (PIC) for each primer pair varied from 0.693 to 0.967 with a mean of 0.909 and the percentage
of polymorphic fragments for each variety ranged from 38.78% to 51.42% with an average of 46.38%. These
parameters suggest that the SRAP marker could effectively identify the genetic variation among T. patula vari-
eties. The genetic distance among varieties ranged from 0.047 to 0.198 with an average of 0.126 and Shannon
diversity index varied from 0.178 to 0.217 with an average of 0.201, indicating the low degree of genetic diver-
sity among these cultivars tested. The 28 cultivars could be divided into 4 groups when the genetic distance was
0.146 based on UPGMA cluster analysis, basically corresponding to the flower color, and it could be considered
as a predominant factor for the cluster of T. patula in terms of phenotypic traits. These data may provide a base
for cultivar identification, parent selection and marker assisted selection (MAS) in crossbreeding of T. patula.
Key words: Tagetes patula; genetic diversity; SRAP; cluster
孔雀草(Tagetes patula L.)又名小万寿菊、黄
菊花、红黄草等, 为一年生菊科(Asteraceae)万寿
菊属草本花卉。孔雀草适应性强, 花期长, 其橙
色、黄色花极为醒目, 具有很高的观赏价值和经济
价值, 已成为花坛花境、庭院布置、绿化工程的主
体花卉之一。此外, 孔雀草富含纯天然黄酮类色
素和萜烯类化合物(Tereschuck等1997; Bhattacha-
ryya等2010; Negi等2013), 具有抗氧化和抑菌活性,
全株均可入药, 有清热化痰、补血通经的功效。
孔雀草主要以种子繁殖, 而我国多数种子生
产仍需从国外进口, 国内通过太空诱变和杂交育
种也选育出一些孔雀草新品种(梁顺祥和唐道城
植物生理学报1430
2006; 陈肖英等2010; 柴小琴等2012; 张华丽和王
涛2012), 但推广应用上受地区气候条件的限制, 且
种子质量不均一, 仍不具备取代进口种子的明显
优势, 加强选育品质优良、适宜我国气候条件的
孔雀草自主品种已迫在眉睫。种质资源的遗传多
样性是育种工作的基础, 越来越受到育种家们的
重视(王述民等2011a, b)。因此, 有必要开展孔雀
草种质资源的遗传多样性研究, 了解我国孔雀草
种质资源现状, 为进一步开展育种工作和遗传研
究提供重要的依据和参考。
分子标记技术已广泛用于植物遗传多样性和
亲缘关系的研究中, 目前, 国内外用于孔雀草及万
寿菊属遗传关系分析的分子标记主要有ISSR (齐
迎春等2007; 曾丽等2010)和RAPD (Modi等2013),
但总体来看, 所用材料数量偏少(最多16份材料),
采用的分子标记比较单一。相关序列扩增多态性
(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是
由美国加州大学Li和Quiros (2001)开发的一种基
于基因开放阅读框的分子标记技术, 近几年广泛
用于种质资源的亲缘关系和遗传多样性分析, 具
有操作简便、多态性高、重复性好、易克隆目标
片段、降低成本等特点(傅洪拓等2010; Amar等
2011; 孙朝霞等2012; 吴雪霞等2012), 其有效性已
在多种园艺作物中得以验证(王晓菡等2009)。本
研究利用SRAP标记对目前我国主栽的28份孔雀
草资源进行了分析, 旨在评价其遗传多样性, 并为
这些材料在以后的育种利用提供理论依据。
材料与方法
1 材料
供试材料为28个孔雀草(Tagetes patula L.)品
种(系), 名称见表1。其中, P06-1、P06-2、H10-1、
LH-1、LH-2、P07-3、HY10、J10为杭州市农业
科学研究院自育品系(其中P07-3花为黄色, 其他均
为橙色), 其他品种分别来自美国、德国和中国内
蒙古赤峰。以上材料于2013年1月播种, 2月移栽至
杭州市农业科学研究院单体塑料大棚中, 试验期
间水肥管理条件一致。
表1 供试材料
Table 1 List of the experimental materials
编号 品种(系) 来源地 编号 品种(系) 来源地
1 英雄橙色 德国 15 金门橙色 中国内蒙古
2 英雄黄色 德国 16 金门黄色 中国内蒙古
3 小英雄橙色 德国 17 火星橙色 中国内蒙古
4 小英雄黄色 美国 18 火星黄色 中国内蒙古
5 沙发瑞橙色 美国 19 水星橙色 中国内蒙古
6 沙发瑞黄色 美国 20 木星橙色 中国内蒙古
7 鸿运橙色 美国 21 P06-1 中国杭州
8 鸿运黄色 美国 22 P06-2 中国杭州
9 珍妮橙色 美国 23 H10-1 中国杭州
10 珍妮黄色 美国 24 LH-1 中国杭州
11 珍妮深桔红 美国 25 LH-2 中国杭州
12 珍妮亮黄色 美国 26 P07-3 中国杭州
13 迪阿哥橙色 中国内蒙古 27 HY10 中国杭州
14 迪阿哥黄色 中国内蒙古 28 J10 中国杭州

2 方法
2.1 基因组DNA的提取
取以上材料的嫩叶, 采用改良的CTAB法提取
基因组总DNA (Maguire等1994), 用分光光度法测
定浓度和质量, 并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA
的完整性。统一稀释到25 ng⋅μL-1, –20 ℃保存。
2.2 SRAP反应体系及程序
在25 μL反应体系中, 包含1×PCR缓冲液(含
MgCl2 2.0 mmol⋅L
-1), 模板DNA量为50 ng, dNTP和
引物的浓度分别为0.2和0.24 μmol⋅L-1, Taq酶用量
为1 U。根据Li和Quiros (2001)的原则, 设计正反向
引物各8条(序列见表2), 可配对成64对引物组合,
李春楠等: 利用SRAP标记分析中国主栽孔雀草品种的遗传多样性 1431
从中筛选出扩增条带清晰、稳定、丰富的14对用
于实验, 委托上海生工生物工程有限公司合成。
扩增条件是: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性45 s, 35
℃复性l min, 72 ℃延伸90 s, 5个循环; 然后94 ℃变
性45 s, 50 ℃复性l min, 72 ℃延伸90 s, 35个循环;
最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用8%的聚丙烯酰
胺凝胶电泳分离, 银染检测, 利用扫描仪扫描图像
记录实验结果。
2.3 数据统计与处理
采取0/1赋值记录扩增条带, 有带记为1, 无带
记为0, 形成“0、1”数据矩阵。用NTSYSpc2.1软件
(Rohlf 2000)计算遗传距离(GD), 采用非加权类平
均法(UPGMA)进行聚类(Nei和Li 1979)。
有关多样性指数的计算公式如下: 多态信息
含量PIC=1–Σ(Pi)
2 (Botstein等1980); Shannon多样
性指数I=–ΣPilnPi (Pi为第i个等位基因发生变异的
频率); 多态位点比例(%)=扩增的多态性位点数/位
点总数×100。
实验结果
1 SRAP标记的多态性
从64对引物组合中选取扩增效果好、多态性
丰富的14对用于28份孔雀草材料的SRAP-PCR扩
增。共得到271个扩增位点, 其中多态性位点数
151条, 占55.72%。每对引物可扩增出14∼24条扩
增带, 平均19.4条。引物的多态信息含量(PIC)在
0.693~0.967之间, 平均高达0.909, 以引物组合
F1R1、F5R7和F6R4表现较为突出, 多态性带比例
分别为72.73%、66.67%和84.21%, PIC分别为
0.967、0.962和0.944 (表3), 对孔雀草不同种质基
因型的鉴别能力较强。这些参数表明SRAP可检
表2 所用SRAP正反引物序列
Table 2 Sequences of SRAP forward and reverse primers used in the present study
编号 正向引物序列(5→3) 编号 反向引物序列(5→3)
F1 TGAGTCCAAACCGGATA R1 GACTGCGTACGAATTAAT
F2 TGAGTCCAAACCGGAGC R2 GACTGCGTACGAATTTGC
F3 TGAGTCCAAACCGGAAT R3 GACTGCGTACGAATTGAC
F4 TGAGTCCAAACCGGACC R4 GACTGCGTACGAATTTGA
F5 TGAGTCCAAACCGGAAG R5 GACTGCGTACGAATTAAC
F6 TGAGTCCAAACCGGTAA R6 GACTGCGTACGAATTGCA
F7 TGAGTCCAAACCGGTCC R7 GACTGCGTACGAATTCAA
F8 TGAGTCCAAACCGGTGC R8 GACTGCGTACGAATTAGC

表3 14对引物组合的多态性标记信息
Table 3 Polymorphic information generated by 14 primer pairs
引物 位点 多态位 多态位点 多态信息
组合 总数 点数 比例/% 含量
F1R1 22 16 72.73 0.967
F1R2 18 10 55.56 0.860
F1R3 17 9 52.94 0.693
F2R3 19 7 36.84 0.889
F2R4 14 7 50.00 0.858
F3R4 15 8 53.33 0.900
F3R5 23 12 52.17 0.967
F4R5 24 13 54.17 0.960
F4R6 17 9 52.94 0.878
F5R6 18 8 44.44 0.931
F5R7 21 14 66.67 0.962
F6R4 19 16 84.21 0.944
F6R5 23 10 43.48 0.958
F7R6 21 12 57.14 0.953
平均 19.4 10.8 55.72 0.909

测到较高的多态性位点比率, 可用于孔雀草种质
资源的遗传多样性分析。
2 孔雀草资源的遗传变异
从28份孔雀草材料获得的扩增条带数介于
196∼247个(表4), 平均224.8个, 多态条带比例在
38.78%与51.42%之间, 平均每个基因型材料得到
104.8个多态性带, 占总数的46.38%。Shannon多样
性指数变化于0.178∼0.217之间, 平均0.201。这些
检测结果表明参试的孔雀草材料间尽管存在着遗
传差异, 但总体来看多样性水平较低。来自我国
内蒙古的品种火星橙色(编号17)和金门橙色(编号
15)的遗传变异相对较大, 多态条带比例和Shannon
多样性指数分别为51.42%、50.82%和0.217、
0.215; 火星黄色(编号18)和水星橙色(编号19)的遗
植物生理学报1432
表4 28个孔雀草材料的多态性扩增情况
Table 4 Polymorphic information among 28 T. patula cultivars
编号
扩增条带 多态条 多态条带 Shannon多样性
总数 带数 比例/% 指数
1 229 109 47.60 0.204
2 225 105 46.67 0.201
3 239 119 49.79 0.211
4 218 98 44.95 0.196
5 237 117 49.37 0.210
6 231 111 48.05 0.205
7 242 122 50.41 0.213
8 227 107 47.14 0.201
9 231 111 48.05 0.206
10 221 101 45.70 0.198
11 230 110 47.83 0.205
12 241 121 50.21 0.213
13 240 120 50.00 0.212
14 206 86 41.75 0.186
15 244 124 50.82 0.215
16 215 95 44.19 0.193
17 247 127 51.42 0.217
18 196 76 38.78 0.178
19 197 77 39.09 0.179
20 220 100 45.45 0.196
21 224 104 46.43 0.200
22 223 103 46.19 0.199
23 208 88 42.31 0.187
24 241 121 50.21 0.213
25 209 89 42.58 0.189
26 238 118 49.58 0.211
27 226 106 46.90 0.202
28 200 80 40.00 0.182
平均 224.8 104.8 46.38 0.201

表5 28个孔雀草材料间的遗传距离参数
Table 5 Genetic distance among 28 T. patula cultivars
编号 变化范围 平均 标准差 变异系数/%
1 0.096∼0.179 0.136 0.021 15.23
2 0.082∼0.179 0.118 0.024 20.00
3 0.047∼0.198 0.112 0.033 29.49
4 0.091∼0.175 0.124 0.023 18.50
5 0.076∼0.177 0.115 0.026 22.88
6 0.076∼0.175 0.118 0.026 22.26
7 0.086∼0.169 0.114 0.024 21.33
8 0.083∼0.172 0.121 0.025 20.37
9 0.081∼0.187 0.121 0.029 23.81
10 0.080∼0.170 0.124 0.020 16.41
11 0.079∼0.173 0.120 0.026 21.75
12 0.064∼0.180 0.110 0.027 24.18
13 0.058∼0.178 0.108 0.029 26.85
14 0.131∼0.188 0.154 0.014 9.15
15 0.053∼0.181 0.107 0.032 29.86
16 0.101∼0.168 0.139 0.018 12.69
17 0.055∼0.177 0.109 0.033 30.08
18 0.126∼0.169 0.152 0.013 8.74
19 0.148∼0.198 0.173 0.011 6.61
20 0.082∼0.151 0.120 0.017 14.19
21 0.091∼0.168 0.129 0.021 16.47
22 0.080∼0.164 0.116 0.022 18.93
23 0.103∼0.175 0.146 0.017 11.52
24 0.047∼0.175 0.105 0.036 34.12
25 0.110∼0.172 0.143 0.016 11.01
26 0.075∼0.185 0.113 0.028 24.58
27 0.099∼0.187 0.129 0.024 18.30
28 0.131∼0.179 0.154 0.011 7.09
平均 - 0.126 0.023 19.16

传分化程度则较低。
3 聚类分析
利用SRAP标记计算各材料之间的遗传距离
在0.047∼0.198之间, 平均为0.126 (表5)。从遗传距
离的变化来看, 以水星橙色(编号19)与其他材料的
变异系数最小(为6.61%), 遗传基础的变异范围狭
窄; 以LH-1(编号24)的变异系数最大(为34.12%),
火星橙色(编号17)和金门橙色(编号15)次之, 它们
的遗传变异比较丰富, 与其他材料相比, 基因组上
具有更加宽泛的遗传基础。
基于遗传距离的UPGMA聚类分析结果表明
(图1), 在遗传距离阈值为0.146处, 可将28份孔雀草
材料分为4个大类, 第I、II类均仅包含1个材料, 分
别为水星橙色和J10, 第III大类包含4份材料: 自选
品系H10-1、LH-2和品种火星黄色、迪阿哥黄色,
第IV大类包括其余的22份材料。在遗传距离阈值
为0.110处, 进一步将第IV大类群划分为5个亚类,
其中, 英雄橙色和HY01分别自成1、2亚类, 金门黄
色与珍妮黄色划为第3亚类, 木星橙色、英雄黄
色、鸿运黄色、沙发瑞黄色和小英雄黄色聚为第
4亚类, 其余13份材料合并为第5亚类。从聚类图
上可见, 大部分黄色品种或橙色品种因花色相同
或相近而成簇出现。如第IV类群第3亚类全部为
黄色品种; 第5亚类的组成中, 除木星橙色外, 其他
几个黄色品种聚在一起, 除珍妮亮黄色外, 余下材
料均为橙色或接近橙色品种并集聚在一起。聚类
结果与花色表现基本相符, 说明花色是影响聚类
结果的重要因子, 可考虑作为孔雀草表型分类的
一个主要依据。其中小英雄橙色与LH-1之间的遗
李春楠等: 利用SRAP标记分析中国主栽孔雀草品种的遗传多样性 1433
传距离最小, 亲缘关系最近; 而小英雄橙色与水星
橙色之间的遗传距离最大, 亲缘关系较远。另外,
来自相同国家或地区的孔雀草材料不因来源地而
聚在一起, 而是交错分布在聚类图上。
讨　　论
深入了解孔雀草种群内部遗传变异情况对于
孔雀草资源的再搜集、育种亲本的选择搭配以及
种质资源的保存利用具有重要意义。分子标记技
术是植物遗传多样性分析的有效工具, SRAP是一
种基于PCR的分子标记, 其通过特殊的引物设计对
ORFs (open reading frames)进行扩增, 从整个基因
组的角度, 整体、全面的反映生物的遗传信息, 已
在多种园艺作物的遗传关系分析和遗传育种(孙佳
琦等2010)中得以应用。目前, 在草花上的应用主
要有一串红(董爱香等2012; 李春楠等2013)、万寿
菊(张西西等2008)、矮牵牛(徐进等2008)、小菊
(秦贺兰等2010)、菊花(Zhang等2011; Chen和Li
2011)、凤仙花(何海峰2012)、三色堇和角堇(王涛
等2012)等, 其尚未用于孔雀草种质资源的遗传多
样性分析。本研究不仅成功的将SRAP标记引入
孔雀草种质的遗传关系分析中, 还获得了有价值
的遗传背景资料, 并且, 与以往的研究相比, 所搜
集到的材料更加丰富多样, 能够更真实地反映我
国孔雀草资源的遗传背景情况。
利用14对SRAP引物组合从28份孔雀草材料
中共获得271个扩增位点 , 其中多态性位点占
55.47%, Shannon多样性指数在0.178∼0.217之间,
平均0.201。这些指标表明参试的孔雀草资源在
DNA水平上存在一定的遗传差异, 具有较为丰富
的基因资源 , 但总体变异表现居于中等偏下水
平。可能的原因是, 目前孔雀草育种仍以系统选
育为主, 杂交育种开展的较少, 而且选育出的品种
常是进口品种经多代筛选的衍生后代, 与亲本的
遗传相似度很高。聚类后, 这些亲缘关系较近的
材料容易聚为一类, 如LH-1是从小英雄橙色中选
育出的自交系后代 , 它们之间的遗传距离最近;
P06-1和P06-2是从同一品种选育的两个自交系, 在
株型、花型、花色等表型上都较为接近, 也因此
而聚在一起(图1)。再者, 聚类图中, 花色相近的材
料趋于聚为同一类组, 从分子水平上说明花色相
对其他性状变异程度较高(图1)。
图1 28个孔雀草材料的UPGMA聚类图
Fig.1 UPGMA dendrogram of 28 T. patula cultivars
植物生理学报1434
本研究取得的结果可为今后开展孔雀草杂交
育种以及生产实践提供一定的指导。首先, 根据
基因组DNA序列结合表型差异性, 以及品种资源
间亲缘关系的远近, 可以指导育种者合理选择孔
雀草杂交育种组配亲本, 提高育种效率。通过杂
交选配, 使现有的基因资源相互渗透和组合, 也能
拓宽孔雀草育种的遗传背景。其次, 基因组DNA
上的多态性可为分子标记辅助选择打下一定的基
础, 特别是有些特有基因片段的插入或缺失, 对于
分析农艺性状相关联的基因多态性、QTL定位以
及基因突变检测等都具有重要意义。第三, DNA
指纹图谱鉴定是品种质量监控和真实性鉴别的重
要措施之一。目前, 国际植物新品种保护联盟(In-
ternational Union for the Protection of New Varieties
of Plants, UPOV)已将DNA标记的鉴定纳入农作物
品种DUS测试内容(苗晗等2014)。2013年3月20日,
我国农业部第2次常务会议审议通过了万寿菊属
加入中华人民共和国农业植物品种保护名录(第九
批), 因此, 本研究利用SRAP分子标记分析孔雀草
品种资源的遗传关系将为中国孔雀草品种的DUS
测试和品种真实性鉴定奠定技术基础。
参考文献
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