全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (9): 1502~1512　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.02551502
收稿 2015-05-04　　修定 2015-08-28
资助 青岛农业大学高层次人才科研基金(630929)、青岛农业大
学大学生科技创新基金项目、山东省高等学校优秀中青
年骨干教师国际合作培养计划、公益性行业(农业)科研专
项项目(201203075-04)和山东省现代农业产业体系水果创
新团队建设基金(SDAIT-03-022-10)。
* 通讯作者(E-mail: yyb@qau.edu.cn; Tel: 0532-88030513)。
苹果谷胱甘肽S-转移酶基因MdGSTF3的克隆及其表达分析
樊连梅1,2, 刘更森2, 李思琪1, 原永兵2,*
青岛农业大学1生命科学学院/山东省高校植物生物技术重点实验室; 2园艺学院/青岛市现代农业质量与安全工程重点实验
室, 山东青岛266109
摘要: 以‘富士’苹果果皮为试材, 利用RT-PCR和RACE-PCR克隆得到1个全长为868 bp的苹果谷胱甘肽S-转移酶基因
MdGSTF3全长cDNA序列, GenBank的登录号为KP234026, 该基因5非翻译区49 bp, 3非翻译区151 bp, 含有26 bp的PolyA尾,
编码区为642 bp, 编码213个氨基酸, 编码的蛋白质含有19种氨基酸, 不含有半胱氨酸Cys, 相对分子质量为23.993 kDa, 等电
点为6.17。氨基酸多重序列比对分析结果表明MdGST与梅的PmGST蛋白(XP_008235026)遗传相似性为83%。实时荧光定
量PCR结果表明, MdGSTF3在条红‘富士’的茎、叶和花中表达量高于其突变体片红‘富士’; 而在果皮和果肉中, 片红‘富士’
该基因的表达量高于条红‘富士’; 在表达量达到最大值时, 片红‘富士’比条红‘富士’分别高出46.6%和22.1%。实验结果表
明, MdGSTF3的表达与苹果果实不同组织花青苷的积累和分布密切相关。
关键词: ‘富士’苹果; 谷胱甘肽S-转移酶(GST); 花青苷; 克隆; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Glutathione S-Transferase Gene MdGSTF3
from Apple (Malus domestica)
FAN Lian-Mei1,2, LIU Geng-Sen2, LI Si-Qi1, YUAN Yong-Bing2,*
1College of Life Sciences/Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong; 2College of Horticulture/Qingdao Key Lab
of Modern Agriculture Quality and Safety Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: A full-length glutathione S-transferase gene named MdGSTF3 was cloned with RT-PCR and RACE-
PCR from Malus domestica cv. ‘Fuji’ peel. The GenBank accession number was KP234026. MdGSTF3 was
868 bp in length including 49 bp of 5 untranslated region, 151 bp of 3 untranslated region and 26 bp polyA. It
had a coding sequence (CDS) of 642 bp, encoding 213 amino acid residues. This predicted polypeptide includ-
ed 19 kinds of amino acids except for cysteine, with the molecular mass of 23.993 kDa, isoelectric point of 6.17.
Real-time fluorescent quantitative PCR analysis showed that the expression level of MdGSTF3 in stems, leaves,
flowers of striped-red ‘Fuji’ was higher than that of the mutant blushed-red ‘Fuji’, but the expression level of
MdGSTF3 in peel and pulp of blushed-red ‘Fuji’ was higher than that of striped-red ‘Fuji’. The most relative
expression quantity of MdGSTF3 from peel and pulp of blushed-red ‘Fuji’ were 46.6% and 22.1% higher than
that of striped-red ‘Fuji’ respectively. The results indicated that the expression level of MdGSTF3 was closely
related with anthocyanin accumulation and distribution of apple peel.
Key words: Malus domestica cv. ‘Fuji’; glutathione S-transferase (GST); anthocyanin; cloning; expression
analysis
苹果花青苷的生物合成与运输受基因表达的
调控, 也受光照、温度和海拔等环境因素以及栽
培措施的影响。生产上通过套袋、转果和铺反光
膜等促进苹果果实着色, 主要是通过改变环境因
子, 进而在分子水平调控果实的色泽发育。花青
苷是由一系列附着在细胞膜和内质网膜上的酶,
如苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶、查尔酮异构
酶、黄烷酮-3-羟化酶、二氢黄酮醇-4-还原酶、花
色素苷合成酶和类黄酮-3-O-葡糖基转移酶等催化
合成, 然后运输并积累于液泡中(Holton和Cornish
1995)。谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transfer-
ase, GST, EC 2.5.1.18)参与液泡花青苷沉积过程
(Marrs等1995)。
樊连梅等: 苹果谷胱甘肽S-转移酶基因MdGSTF3的克隆及其表达分析 1503
GST是一类广泛存在于动植物中的多功能蛋
白家族。GST能够催化还原型谷胱甘肽(reduced
glutathione, GSH)与各种亲电子外源化学物质, 诸
如有毒异源物或氧化产物的结合, 从而促进此类
物质的代谢、区域化隔离或清除反应(Marrs 1996;
王光勇等2010)。根据其氨基酸序列的相似性和基
因结构的特异性 , 可将植物中GST分为Zeta、
Phi、Tau、Theta、lambda以及脱氢抗坏血酸还原
酶(dehydroascorbate reductase, DHAR)等6大类
(Wagner等2002; Edwards和Dixon 2005), 前5类GST
可依次用大写字母来表示: Z代表Zeta, F代表Phi,
U代表Tau, T代表Theta, L代表Lambda (Edwards等
2000)。前三类是最早在植物中发现的GST, 接着
发现了Theta、Lambda和DHAR类GST (Chang和
Tam 1993; Dixon等2002; Nutricati等2006)。Phi和
Tau类GST是植物特有的, 种类最多, 含量最丰富;
动植物中共有的类型是Zeta和Theta类GST; Lamb-
da和DHAR类与其他种类的GST亲缘关系较远
(Moons 2005)。
GST促进谷胱甘肽结合杂环有机阴离子, 谷
胱甘肽S交联结合泵是结合ATP的ABC运输转运
器, 属于MRP (multidrug resistance associated pro-
tein)亚族蛋白(Theodoulou 2000)。葡萄果皮和果
肉的花青苷积累与GST相关(于淼等2010; 刘海峰
和王军2011; Cardoso等2012), GST参与了小泡运
输花青苷(Gomez等2011)。葡萄ATP结合蛋白
ABCC1运输花青苷依赖于谷胱甘肽的含量(Fran-
cisco等2013); 玉米Bz2基因编码GST III, 功能分析
表明Bz2基因对花青苷的液泡积累是必需的, 玉米
缺失Bz2, 花青苷不能被运输入液泡而保留在细胞
质中(Alfenito等1998)。矮牵牛中与Bz2的同源蛋
白AN9可把花青苷转运到液泡膜上, 进而被运输到
液泡内(Mueller等2000)。拟南芥TT19编码的GST
同样可以转运花青苷(Kitamura等2004; Lepiniec等
2006; Sun等2012)。
鉴于GST在花青苷运输中的重要作用, 本研
究采用RT-PCR和RACE-PCR方法克隆与苹果花青
苷运输相关MdGSTF3基因的全长cDNA序列; 应用
分子生物学与生物信息学对该基因的分子特性进
行解析; 并应用荧光定量PCR技术分析MdGSTF3
基因在苹果不同组织和果实不同着色期的表达情
况, 为阐明MdGST基因在苹果花青苷代谢过程中
的分子机制提供研究基础, 并对进一步解析花青
苷合成与运输的调控网络及信号响应机制, 以及
利用基因工程手段对果实色泽性状进行定向改良
具有重要理论与实践意义。
材料与方法
1 植物材料
本研究以‘富士’苹果(Malus domestica Borkh.
cv. ‘Fuji’)及其芽变品系为材料, ‘富士’苹果果面着
色模式呈现条红分布, 芽变品系表现片红分布。
实验用果实采自青岛市莱西苹果良种场, 分别于
解袋后的0、3、5、7、9和11 d采集。用蒸馏水冲
洗干净, 分别削取果皮和果肉, 经液氮速冻, 然后
置于–80 ℃超低温冰箱备用。苹果茎和叶片于4
月26日采集, 花于初花期(25%花开时)采集, 以上
样品经液氮速冻后同样置于–80 ℃超低温冰箱
保存。
2 方法
2.1 总RNA与cDNA第一链的合成
苹果总RNA的提取采用TIANGEN® RNAplant
Plus Reagent方法; cDNA第一链的合成使用Femen-
tas公司RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis
Kit逆转录试剂盒, 按照试剂盒操作说明进行。经
过凝胶电泳和微量分光光度计检测, RNA样品置
于–80 ℃超低温冰箱保存备用; cDNA第一链产物
置于–20 ℃冰箱保存备用。
2.2 MdGSTF3全长cDNA克隆
以FP/RP为引物克隆到一段长432 bp的苹果
MdGSTF3片段为依据, 设计RACE-PCR引物, 本研
究所用到的相关引物信息如表1所示。
设计基因特异性引物F3和F5 (表1), 利用
SMARTerTM RACE cDNA Amplication Kit (Clon-
tech)进行RACE PCR, PCR反应条件为: 94 ℃ 30
s、68 ℃ 30 s、72 ℃ 3 min, 30个循环PCR, 扩增采
用50 μL反应体系。全长cDNA克隆PCR反应的总
体系为50 μL, 包括10 µL 5×PrimerSTAR Buffer、4
µL dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1 each)、1 µL正向引
物、1 µL反向引物、2 µL模板、0.5 µL Prim-
erSTAR HS DNA聚合酶(2.5 U·µL-1)、31.5 µL
ddH2O; PCR反应条件为: 98 ℃变性10 s, 55 ℃退火
植物生理学报1504
15 s, 72 ℃延伸1 min, 30个循环; 72 ℃再延伸10
min; 4 ℃保存。PCR反应的退火温度和延伸时间
根据引物的Tm值和目的扩增片段长度进行相应调
整。上述获得的PCR产物经过琼脂糖凝胶回收, 回
收产物添加A尾, 然后与载体pMD19-T连接, 进行
涂板, 挑取单克隆, 菌落PCR, 阳性克隆送英潍捷基
(上海)贸易有限公司进行测序。利用ContigEx-
press软件将测得的3及5 RACE片段与MdGST1基
因片段进行序列拼接, 得到该基因全长。以拼接
序列设计1对引物FL/RL (表1), 验证RACE-PCR结
果的可靠性; 苹果GST基因的命名参照文献(Ed-
wards等2000)的标准命名法进行, 根据苹果的基因
组信息, 由GST基因所在的染色体来编号。
2.3 MdGSTF3的生物信息学分析
利用BLASTx, 将MdGSTF3 cDNA序列在
NCBI非冗余蛋白数据库搜索, 对MdGSTF3蛋白进
行注释; 并利用BLASTn对MdGSTF3全长cDNA序
列进行序列相似性分析; 使用ORF Finder (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)软件预测
MdGSTF3的编码区序列; 通过BLASTP (http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行MdGSTF3蛋白
同源性比对分析; 并用NCBI的Conserved Domains
程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/
wrpsb.cgi)预测该蛋白的保守功能域 ; 下载与
MdGSTF3蛋白同源的其他植物的GST蛋白序列,
氨基酸多重比较分析利用Vector NTI 11的组件
AlignX完成; 采用Neighbor-Joining方法进行分子
系统学分析 , 1 000次bootstrap统计学检验 , 用
MEGA 5.10软件(Tamura等2011)构建系统进化树;
应用Protparam程序(http://au.expasy.org/tools/prot-
表1 苹果MdGSTF3基因克隆所用的相关引物序列
Table 1 Primers sequence used for cloning of MdGSTF3 in apple
引物名称 引物序列(5→3) 用途
FP GTGAACACAAAAAGGAGCCCTTCAT MdGST1基因片段扩增
RP TCGATTGCGTTCCCATCAAGTAATG MdGST1基因片段扩增
F3 GGCTGATCTTCACCACCTCCCCACC MdGST1基因3′端RACE扩增
F5 GCTGGAACTTGACCAAATGGATTGAGGG MdGST1基因5′端RACE扩增
FL GACAACACCTCTTTCTCAGTTGCTCA 全长cDNA扩增
RL GCAAAAGGCATCAGCAGCAGTAGC 全长cDNA扩增
FQ CCACGAGTATGCTGACAA 基因表达分析
RQ ACCTCCGACCACAATGAT 基因表达分析
FQ-MdEF1-α AACTGGTCTGACTACTGA 基因表达分析内参
RQ-MdEF1-α TGACAGCAACATTCTTAAC 基因表达分析内参
param.html)分析氨基酸序列组成、相对分子质量
和等电点等理化性质; 利用2种在线分析软件Yloc
(http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/YLoc/we-
bloc.cgi) (Briesemeister等2010a, b)和LocTree
(https://rostlab.org/services/loctree2/) (Goldberg等
2012, 2014)进行亚细胞定位预测; 利用TMHMM
Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/
TMHMM-2.0)和TMpred Server (http://www.
ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)软件进
行蛋白质跨膜结构域预测; 利用SignalP 4.1 Server
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序和
WoLF PSORT (http://psort.hgc.jp/)服务器预测蛋白
N末端信号肽序列; 利用ExPASy Proteomics Server
的ProtScale程序预测蛋白的亲水性和疏水性(Kyte
和Doolittle 1982); 利用SOPMA (http://npsa-devel.
ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)预测MdGSTF3蛋白
质的二级结构(Geourjon和Deléage 1995); 采用在线
工具SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)
进行三维预测(Arnold等2006; Biasini等2014)。
2.4 MdGSTF3的实时荧光定量PCR分析
根据MdGSTF3 cDNA序列设计荧光定量PCR
(RT-qPCR)引物FQ/RQ (表1), 采用ABI 7500 Re-
al-Time PCR System实时荧光定量PCR系统, 分析
苹果茎、叶、花、果皮和果肉组织以及不同解袋
时间果皮中MdGSTF3的表达情况, 以SYBR green I
法进行RT-qPCR分析, 具体操作依据仪器使用说明
书进行。取4 μg苹果总RNA, 逆转录合成cDNA第
一链, 稀释30倍作为RT-qPCR分析的模板; RT-qP-
CR反应总体系20 μL, 包含2 μL cDNA模板、10 μL
2×SYBR® Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)、10
樊连梅等: 苹果谷胱甘肽S-转移酶基因MdGSTF3的克隆及其表达分析 1505
μmol·L-1的正向和反向引物各0.4 μL、0.4 µL ROX
Reference Dye II、6.8 µL ddH2O; 扩增程序为: 95
℃预变性30 s, 95 ℃变性5 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃
延伸34 s, 40个循环。每个样品设置3个生物学重
复。以苹果MdEF1-α (表1)为内参基因(樊连梅等
2014), 分析MdGSTF3的相对表达水平。
实验结果
1 MdGSTF3全长cDNA的克隆与序列分析
以苹果果皮总RNA的反转录产物为模板进行
RT-PCR扩增, 以FP/RP为引物, 扩增产物经测序后
得到432 bp的中间片段; 分别以F3和F5为基因特异
性引物, 利用SMARTerTM RACE cDNA Amplica-
tion Kit (Clontech)进行RACE PCR, 获得325 bp的3′
RACE PCR产物和219 bp的5′ RACEPCR产物 (图
1-A和B)。
将获得的3个片段经ContigExpress软件拼接,
得到苹果MdGSTF3基因cDNA序列全长868 bp。
序列分析表明, 该序列5′端非翻译区(5′ UTR)长49
bp; 3′端非翻译区(3′ UTR)长151 bp, 含有642 bp的
图1 苹果MdGST3 PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1 Agrose gel electrophoresis of PCR amplification of MdGST3 in apple
M: Marker (DL2000); 1: cDNA中间片段; 2: 3′ RACE片段; 3: 5′ RACE片段; 4: 全长扩增序列。
完整读码框, 编码213个氨基酸。应用Protparam程
序对‘富士’苹果MdGSTF3基因的氨基酸序列进行
分析发现, 编码的蛋白质含有19种氨基酸, 不含有
半胱氨酸Cys, 相对分子质量为23.993 kDa, 理论等
电点为6.17, Ala含量最高, 达到12.2%; 含量较高的
还有Leu (8.9%)、Lys (8.5%)、Glu (8.0%)、Val
(8.0%); 而含量最低的是Trp, 为1.4%。其终止密码
子为TGA, 含有26 bp的PolyA序列(图2)。依据以
上特征判断, 本研究获得了MdGSTF3的完整cDNA
序列。以FL/RL为引物, 经PCR扩增、TA克隆, 阳
性克隆测序, 得到842 bp的序列(图1-C), 与RACE-
PCR结果相一致(26 bp的polyA序列不在引物设计
的范围内)。根据GST的命名原则中, 用大写字母F
来表示Phi类GST。通过搜索蔷薇科基因组数据库
(genome database for rosaceae, GDR, http://www.ro-
saceae.org/), 确定该基因位于苹果的第3号染色体
上, 所以将该基因命名MdGSTF3 (GenBank登录号
KP234026)。
在NCBI的核苷酸数据库中进行Blastn比对时
发现, MdGSTF3与Boechera×divaricarpa (DQ22-
6975)和野草莓(Fragaria vesca subsp. vesca, XM_
004290715)的GST同源性比较高, 相似性分别为
84%和81%; 与其他物种GST基因的亲缘关系也比
较近, 相似性在70%~80%之间。
2 MdGSTF3蛋白质的结构域预测和亚细胞定位
及疏水性分析
2.1 蛋白质的结构域预测
用Conserved Domains程序通过同源性检索
NCBI非冗余蛋白数据库预测MdGSTF3蛋白的保
守功能域, 预测结果(图3)表明, 该酶蛋白含有2个
结构域, 氨基酸序列的3~78具有硫氧还蛋白类超
家族(Thioredoxin_like superfamily)的特点, 属于
GST_N_Phi结构域, 此区域包含由6个保守氨基酸
残基(A14、Q54、V55、P66、E67和S68)构成的谷胱甘
肽GSH结合位点(GSH binding site, G-Site); 氨基酸
序列的92~209具有谷胱甘肽S-转移酶碳末端超家
族(GST_C_terminal family superfamily)的特点, 属于
GST_C_Phi结构域, 此区域包含由15个保守氨基酸
植物生理学报1506
图2 苹果MdGSTF3全长cDNA序列及编码区推测的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the full-length cDNA of MdGSTF3 in apple
下划线序列表示推导蛋白质序列的起始密码子; 星号表示终止密码子。
图3 苹果MdGSTF3保守域分析
Fig.3 Analysis of conserved domain of MdGSTF3 in apple
实线表示N端结构域; 虚线表示C端结构域。带星号氨基酸分别表示位于G位点(G-Site)或H位点(H-Site)的保守氨基酸残基。
樊连梅等: 苹果谷胱甘肽S-转移酶基因MdGSTF3的克隆及其表达分析 1507
残基(S101、E104、A105、D109、T113、T116、H169、
L171、P172、T173、Y176、R202、A204、K207和V208)构成
的底物结合位点(substrate binding pocket, H-Site)。
介于79~91位的13个氨基酸的短序列(Y79-A80-D81-
K82-G83-T84-P85-L86-V87-I88-R89-D90-S91)将N端GST_N_
Phi和C端GST_C_Phi 2个结构域连接起来。
2.2 亚细胞定位分析
利用Yloc和LocTree 2种在线分析软件预测
MdGSTF3蛋白可能位于细胞质, 定位于细胞质的
概率分别为96.6%和90%。同时, 进行跨膜结构域
和信号肽预测分析能全面认识和理解蛋白质的亚
细胞定位, 利用TMHMM Server v. 2.0和TMpred
Server软件对MdGSTF3进行蛋白质跨膜结构域预
测, 结果均表明该蛋白不存在跨膜结构域, 整条肽
链都位于膜外。利用SignalP 4.1 Server程序的euk
networks预测MdGSTF3发现该蛋白不存在信号肽
序列。利用WoLF PSORT服务器对苹果MdGSTF3
进行N末端信号预测, 结果表明该蛋白无任何线粒
体靶向或叶绿体转运肽等N末端信号。
2.3 疏水性分析
利用ExPASy Proteomics Server的ProtScale程
序(http://web.expasy.org/protscale/), 根据模型
Hphob./Kyte＆Doolittle对苹果的MdGSTF3蛋白质
疏水性和亲水性进行分析, 由于氨基酸分值越低
亲水性越强, 分值越高疏水性越强, 所以从疏水性
分析结果可以看出, MdGSTF3蛋白的中部有较强
疏水区, 而其两端为明显亲水区。多肽链第41位
His具有最低的分值–2.522和最强的亲水性; 第196
位Val具有最高的分值1.956和最强的疏水性。
以上诸多结果表明‘富士’苹果的MdGSTF3蛋
白属于非分泌型、非跨膜类蛋白。
3 MdGSTF3蛋白的二级和三级结构预测
用SOPMA程序预测MdGSTF3蛋白的二级结
构, 分析表明MdGSTF3蛋白的二级结构中包括
47.89%的α螺旋(alpha helix)、13.62%的延伸链(ex-
tended strand)、6.10%的β转角(beta turn)、32.39%
的无规则卷曲(random coil) (图4)。
利用SWISS-MODEL对MdGSTF3的三级结构
进行在线预测, 以谷胱甘肽S-转移酶(PDB code:
1bx9.1.A)为模板, 对MdGSTF3进行同源建模, 结果
如图5。
4 MdGSTF3编码的氨基酸序列同源性及系统进化
分析
4.1 氨基酸序列的同源性分析
利用NCBI的Blastp程序将MdGSTF3 cDNA推
导的氨基酸序列进行检索, 结果表明MdGSTF3蛋
白与其他物种的GST蛋白的氨基酸序列同源性比
较高, 其中与梅(PmGST, Prunus mume, XP_00-
图4 MdGSTF3二级结构预测
Fig.4 Predication of the secondary structures of MdGSTF3
序列长度为213; h: α螺旋; e: 延伸链; t: β转角; c: 无规则卷曲。
图5 MdGSTF3三维结构图
Fig.5 The tertiary structure of MdGSTF3
植物生理学报1508
8235026)、野草莓(FvGST, Fragaria vesca subsp.
vesca, XP_004290763)、木榄(BgGST, Bruguiera
gymnorhiza, AEB77871)、紫花苜蓿(MsGST, Medi-
cago sativa, BAB70616)、葡萄(VvGST, Vitis vinif-
era, ABK81651)、毛果杨(PtGST, Populus tricho-
carpa, XP_006386753)、鹰嘴豆(CaGST, Cicer
图6 MdGSTF3编码的氨基酸序列与其他物种相似蛋白的同源性比对
Fig.6 Multiple alignment of amino acid sequence encoded by MdGSTF3 with homologous proteins from other plants
蓝底白字: 同源性为100%; 黄底黑字: 80%<同源性<100%; 灰底黑字: 30%<同源性<80%; 白底红字: 0<同源性<30%; 白底黑字: 没有同
源性。Consensus: 序列比对一致性。
arietinum, XP_004495977)和林烟草(NsGST, Nico-
tiana sylvestris, XP_009789274)等植物GST氨基酸
序列的相似性分别为83%、77%、73%、73%、
72%、72%、71%和70%。利用Vector NTI 11的组
件AlignX将MdGSTF3的氨基酸序列和其他高等植
物GST氨基酸序列进行多重比对, 结果见图6。
4.2 MdGSTF3蛋白质的系统进化分析
利用NCBI网站的Blastp程序在非冗余蛋白质
序列库中对MdGSTF3进行同源性检索和比对分
析, 获取了来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、毛
果杨、甜橙(Citrus sinensis)、葡萄、白梨(Pyrus×
bretschneideri)、野草莓、辣椒(Capsicum annu-
um)、番茄(Solanum lycopersicum)以及芜菁(Bras-
sica rapa)等31个不同的植物物种的6个GSTs家族
的54个蛋白的氨基酸序列。利用MEGA 5.10软件
将该蛋白与这54个GSTs蛋白进行多重序列比对,
并构建系统进化树(图7)。这55个GST蛋白明显地
聚类为Zeta、Phi、Tau、Theta、l ambda以及
DHAR等6大类群。MdGSTF3与GST蛋白的Phi
家族蛋白聚为一个类群, 亲缘关系最近。
5 苹果MdGSTF3基因的表达特性分析
根据克隆的基因序列合成探针, 用Real Time
樊连梅等: 苹果谷胱甘肽S-转移酶基因MdGSTF3的克隆及其表达分析 1509
PCR技术检测其在苹果各器官和不同取样期的基
因时空特异性的表达规律。
荧光定量P C R结果表明 , 茎、叶、花中
MdGSTF3在条红‘富士’中的表达量高于片红‘富
士’; 而在解袋第5天时的果皮和果肉中, 条红‘富
士’中的表达量低于片红‘富士’, 且片红‘富士’果皮
中的相对表达量达到最高, 比条红‘富士’果皮的相
对表达量高出46.6% (图8)。解袋0~3 d时, 条红‘富
士’果皮MdGSTF3的表达量高于片红‘富士’。解袋
5 d时该基因相对表达最高, 5 d之后表达量呈逐渐
图7 MdGSTF3蛋白质及其他31种植物的GSTs的系统进化树
Fig.7 Phylogenetic tree of MdGSTF3 and 54 GSTs from 31 different plant species
毛果杨PtDHAR3: ADB11345; 毛果杨PtDHAR2: ADB11344; 白梨PbDHAR2: XP_009357653; 拟南芥AtDHAR2: NP_177662; 拟
南芥AtDHAR1: NP_173387; 甜椒CaDHAR1: AIP90069; 葡萄VvDHAR1: NP_001267992; 小麦TaDHAR1: ACV89491; 荠蓝CsGSTL1:
XP_010452124; 拟南芥AtGSTL1: NP_001119157; 鹰嘴豆CaGSTL3: XP_004493930; 白梨PbGSTL3: XP_009341972; 甜橙CsGSTL3:
XP_006480549; 葡萄VvGSTL3: XP_002276301; 毛果杨PtGSTL2: ADB11342; 毛果杨PtGSTF8: ADB11336; 陆地棉GhGSTF: AJY54643; 山
葡萄VaGSTF: ACN38271; 红紫苏PfGSTF1: BAG14300; 拟南芥AtGSTF12: AED92398; 拟南芥AtGSTF11: NP_186969; 野生大豆GsGSTF9:
KHN13182;油松PtGSTT: AGC13145; 玉米ZmGSTT1: NP_001152125; 野草莓FvGSTT1: XP_011463848; 拟南芥AtGSTT1: NP_198937; 甜
橙CsGSTT1: XP_006476596; 蒺藜苜蓿MtGSTT: XP_003630524; 大豆GmGSTT23: NP_001236903; 芥蓝CsGSTU5: XP_010469954; 荠
菜CrGSTU34: ABW81138; 芜菁BrGSTU5: XP_009133847; 北美南芥菜BdGSTU2: ABW74578; 拟南芥AtGSTU6: NP_180505; 拟南芥
AtGSTU5: NP_180506; 醉蝶花ThGSTU1: XP_010542655; 芜菁BrGSTU3: XP_009141005; 甜橙CsGSTU7: XP_006488416; 拟南芥AtGSTU7:
NP_180503; 拟南芥AtGSTZ1: NP_178344; 可可TcGSTZ1: XP_007010577; 圆叶锦葵MpGSTZ1: AAO61856; 毛果杨PtGSTZ: XP_006385118;
麻疯树JcGSTZ: XP_012078858; 木榄BgGSTZ: AEB77870; 番茄SlGSTZ: XP_004230388; 林烟草NsGSTZ: XP_009783128; 甜椒CaGSTZ:
ABQ88335; 葡萄VvGSTZ: XP_002273077; 甜橙CsGSTZ: XP_006470782; 野草莓FvGSTZ: XP_004300051; 梅PmGSTZ: XP_008218606; 沙
梨PpGSTZ: ADZ05465; 苹果MdGSTZ: XP_008378975; *标注的为苹果MdGSTF3。
植物生理学报1510
此外, 还发现了一些与花青苷运输相关的液泡转
运蛋白, 如ABC运输转运器、MATE家族蛋白等
(Grotewold 2004)。ABC转运器通过疏水基之间的
交互作用结合花青苷, 然后运送到液泡膜上; 在拟
南芥中TT12编码的MATE家族蛋白控制着内种皮
中原花青苷的液泡积累过程。在苹果中两个
MATE基因能对拟南芥TT12突变体进行功能互补
(Frank等2011)。花青苷也可通过小囊泡转运到液
泡中(Conn等2003)。GST则参与了液泡花青苷的
沉积过程(Marrs等1995), 并且其基因表达具有组
织特异性(Licciaradello等2014)。
本研究在前期工作的基础上克隆到苹果谷胱
甘肽S-转移酶基因MdGSTF3全长cDNA序列。通
过搜索蔷薇科基因组数据库 , 确定该基因位于
苹果的第3号染色体上。进一步分析发现, 苹果
MdGSTF3蛋白具有明显的结构特征, 该酶蛋白含
有2个结构域, 即GST_N_Phi和GST_C_Phi结构
域。不同软件对亚细胞定位分析认为, MdGSTF3
蛋白可能位于细胞质, 定位于细胞质的概率分别
为96.6%和90%。对MdGSTF3蛋白疏水性研究发
现, 该蛋白中部有较强疏水区, 而其两端为明显亲
水区。以上结果表明, ‘富士’苹果的MdGSTF3蛋白
属于非分泌型、非跨膜蛋白类。用SOPMA程序预
测MdGSTF3蛋白的二级结构时发现, 该蛋白含α螺
旋、β转角、延伸链和无规则卷曲, 其中以α螺旋
和无规则卷曲为主, 分别占47.89%和32.39%。研
究还发现, 苹果MdGSTF3蛋白与梅等其他8个物种
的GST蛋白的氨基酸序列均有较高的同源性, 达
70%以上。在与31个不同植物物种6个GSTs家族
54个蛋白的氨基酸序列进行多重比对结果表明, 55
个GST蛋白明显地聚类为Zeta、Phi、Tau、Theta、
lambda以及DHAR等6大类群, MdGSTF3与GST蛋
白的Phi家族蛋白聚为一个类群, 亲缘关系最近。
由于GST具有特殊的亲和性, 能将花青苷和谷胱甘
肽形成偶联物, 对花青苷的固定、运输、积累和
贮存起到重要调控作用(Alfenito等1998; Zhang等
2006)。
苹果果皮呈现片红和条红的着色表型与花青
苷积累、运输和分布有关, 在分子水平受相关基
因时空表达的影响。本实验发现, 在苹果茎、叶
和花等器官以及果实着色过程中MdGSTF3基因表
下降趋势, 但片红‘富士’果皮中的表达量明显高于
条红‘富士’果皮(图9)。实验结果表明, MdGSTF3
基因在苹果果皮花青苷积累和分布中起到重要的
作用, 其具体的分子作用机制需要进一步研究。
讨　　论
苹果果皮花青苷的生物合成受结构基因和调
节基因的调控(高华君等2006)。现已发现MYB类
转录因子对苹果(王延玲等2010)、葡萄(Kobayashi
等2002)、月季(谢吉容等2008)和拟南芥(Dubos等
2001)等植物花青苷合成基因有重要的调节作用。
图8 苹果MdGSTF3基因在不同组织中的表达水平
Fig.8 Expression levels of MdGSTF3 in
different tissues of apple
果皮和果肉取自解袋第5天。
图9 苹果MdGSTF3基因在不同解袋时间果皮中的表达水平
Fig.9 Expression levels of MdGSTF3 of peel in apple on
different debagging time
樊连梅等: 苹果谷胱甘肽S-转移酶基因MdGSTF3的克隆及其表达分析 1511
达与解袋时间有关, 且不同着色性状的苹果果皮
MdGSTF3基因表达量不同。MdGSTF3基因在条红
‘富士’的茎、叶和花中的表达量明显高于片红‘富
士’。而解袋第5天时, 该基因在条红‘富士’果皮和
果肉中的表达量明显低于片红‘富士’, 且在片红
‘富士’果皮中的达到最大相对表达量, 比条红‘富
士’高出46.6%。解袋0~3 d时, 条红‘富士’果皮
MdGSTF3的表达量高于片红‘富士’, 解袋5 d时该
基因相对表达最高, 5 d之后表达量缓慢下降, 但片
红‘富士’果皮中的表达量明显高于条红‘富士’。这
表明MdGSTF3基因表达与苹果果皮花青苷的积累
和分布有着紧密的联系, 其具体的分子作用机制
还需要进一步的研究。上述实验结果可在分子水
平为苹果果实花青苷积累与运输的研究开辟一个
新的视角, 进而为解析苹果花青苷代谢的基因调
控网络提供科学依据。
参考文献
樊连梅, 王超, 刘更森, 原永兵(2014). 苹果着色期实时定量PCR内
参基因的筛选和验证. 植物生理学报, 50 (12): 1903~1911
高华君, 王少敏, 王江勇(2006). 套袋对苹果果皮花青苷合成及着色
的影响. 果树学报, 23 (5): 750~755
刘海峰, 王军(2011). 山葡萄谷胱甘肽S-转移酶基因(VAmGST4)克
隆及表达分析. 植物生理学报, 47 (12): 1161~1166
王光勇, 刘迪秋, 葛锋, 方松刚, 田荣欢,丁元明(2010). GSTs在植物
非生物逆境胁迫中的作用. 植物生理学通讯, 46 (9): 890~894
王延玲, 张艳敏, 冯守千, 田长平, 王海波, 刘遵春, 宋杨, 陈学森
(2010). 新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因的克隆、序列
分析及原核表达. 中国农业科学, 43 (13): 2735~2743
谢吉容, 熊运海, 程在全, 黄兴奇(2008). 月季MYB基因cDNA全长
克隆和表达分析. 中国农业科学, 41 (12): 4173~4179
于淼, 刘海峰, 杨成君, 王军(2010). 葡萄VJyGST全长cDNA克隆及
其在果实着色过程中的表达. 果树学报, 27 (6): 887~891
Alfenito MR, Souer E, Goodman CD, Buell R, Mol J, Koes R, Walbot
V (1998). Functional complementation of anthocyanin seques-
tration in the vacuole by widely divergent, glutathione S-trans-
ferases. Plant Cell, 10 (7): 1135~1149
Arnold K, Bordoli L, Kopp J, Schwede T (2006). The SWISS-MOD-
EL workspace: a web-based environment for protein structure
homology modelling. Bioinformatics, 22 (2): 195~201
Biasini M, Bienert S, Waterhouse A, Arnold K, Studer G, Schmidt
T, Kiefer F, Cassarino TG, Bertoni M, Bordoli L et al (2014).
SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary
structure using evolutionary information. Nucleic Acids Res, 42
(W1): W252~W258
Briesemeister S, Rahnenführer J, Kohlbacher O (2010a). Going from
where to why–interpretable prediction of protein subcellular lo-
calization. Bioinformatics, 26 (9): 1232~1238
Briesemeister S, Rahnenführer J, Kohlbacher O (2010b). YLoc–an
interpretable web server for predicting subcellular localization.
Nucleic Acids Res, 38 (web server issue): W497~W502
Cardoso S, Lau W, Eiras Dias J, Fevereiro P, Maniatis N (2012). A
candidate-gene association study for berry colour and anthocy-
anin content in Vitis vinifera L. PLoS ONE, 7 (9): e46021.
Chang LH, Tam MF (1993). Site-directed mutagenesis and chemical
modification of histidine residues on an alpha-class chick liver
glutathione S-transferase CL 3-3. Histidines are not needed for
the activity of the enzyme and diethylpyrocarbonate modifies
both histidine and lysine residues. Eur J Biochem, 211 (3):
805~811
Conn S, Zhang W, Franco C (2003). Anthocyanic vacuolar inclusions
(AVIs) selectively bind acylated anthocyanins in Vitis vinifera
L. (grapevine) suspension culture. Biotechnol Lett, 25 (11):
835~839
Dixon DP, Lapthorn A, Edwards R (2002). Plant glutathione transfer-
ases. Genome Biol, 3 (3): reviews3004.1-3001.10
Dubos C, Stracke R, Grotewold E, Weisshaar B, Martin C, Lepiniec L
(2010). MYB transcription factors in Arabidopsis. Trends Plant
Sci, 15 (10): 573~581
Edwards R, Dixon DP, Walbot V (2000). Plant glutathione S-transfer-
ases: enzymes with multiple functions in sickness and in health.
Trends Plant Sci, 5 (5): 193~198
Edwards R, Dixon DP (2005). Plant glutathione transferases. Methods
Enzymol, 401: 169~186
Francisco RM, Regalado A, Ageorges A, Burla BJ, Bassin B, Eisen-
ach C, Zarrouk O, Vialet S, Marlin T, Chaves MM et al (2013).
ABCC1, an ATP binding cassette protein from grape berry,
transports anthocyanidin 3-O-Glucosides. Plant Cell, 25 (5):
1840~1854
Frank S, Keck M, Sagasser M, Niehaus K, Weisshaar B, Stracke R
(2011). Two differentially expressed MATE factor genes from
apple complement the Arabidopsis transparent testa12 mutant.
Plant Biol, 13 (1): 42~50
Geourjon C. Deléage G (1995). SOPMA: significant improvement in
protein secondary structure prediction by consensus prediction
from multiple alignments. Comput Appl Biosci, 11 (6): 681~684
Goldberg T, Hamp T, Rost B (2012). LocTree2 predicts localization
for all domains of life. Bioinformatics, 28 (18): i458~i465
Goldberg T, Hecht M, Hamp T, Karl T, Yachdav G, Ahmed N, Alter-
mann U, Angerer P, Ansorge S, Balasz K et al (2014). LocTree3
prediction of localization. Nucleic Acids Res, 42 (Web Server
issue): W350~W355
Gomez C, Conejero G, Torregrosa, L, Cheynier V, Terrier N, Ageorg-
es A (2011). In vivo grapevine anthocyanin transport involves
vesicle-mediated trafficking and the contribution of anthoMATE
transporters and GST. Plant J, 67 (6): 960~970
Grotewold E (2004). The challenges of moving chemicals within and
out of cells: insights into the transport of plant natural products.
Planta, 219 (5): 906~909
Holton TA, Cornish EC (1995). Genetics and biochemistry of antho-
cyanin biosynthesis. Plant Cell, 7 (7): 1071~1083
Kitamura S, Shikazono N, Tanaka A (2004). TRANSPARENT TESTA
19 is involved in the accumulation of both anthocyanins and pro-
植物生理学报1512
anthocyanidins in Arabidopsis. Plant J, 37 (1): 104~114
Kobayashi S, Ishimaru M, Hiraoka K, Honda C (2002). Myb-related
genes of the Kyoho grape (Vitis labruscana) regulate anthocyan-
in biosynthesis. Planta, 215 (6): 924~933
Kyte J, Doolittle RF (1982). A simple method for displaying the hy-
dropathic character of a protein. J Mol Bioi, 157 (1): 105~132
Lepiniec L, Debeaujon I, Routaboul JM, Baudry A, Pourcel L, Nesi
N, Caboche M (2006). Genetics and biochemistry of seed flavo-
noids. Annu Rev Plant Biol, 57: 405~430
Licciardello C, DAgostino N, Traini A, Recupero GR, Frusciante L,
Chiusano ML (2014). Characterization of the glutathione S-trans-
ferasegene family through ESTs and expression analyseswithin
common and pigmented cultivars of Citrus sinensis (L.) Osbeck.
BMC Plant Biol, doi: 10.1186/1471-2229-14-39
Marrs KA (1996). The functions and regulation of glutathione S-trans-
ferases in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 47:
127~158
Marrs KA, Alfenito MR, Lloyd AM, Walbot V (1995). A glutathione
stransferase involved in vacuolar transfer encoded by the maize
gene Bronze-2. Nature, 375 (6530): 397~400
Moons A (2005). Regulatory and functional interactions of plant
growth regulators and plant glutathione S-transferases (GSTs).
Vitam Horm, 72: 155~202
Mueller LA, Goodman CD, Silady RA, Walbot V (2000). AN9, a
petunia glutathione S-transferase required for anthocyanin se-
questration, is a flavonoid-binding protein. Plant Physiol, 123 (4):
1561~1570
Nutricati E, Miceli A, Blando F, De Bellis L (2006). Characterization
of two Arabidopsis thaliana glutathione-S-transferases. Plant
Cell Rep, 25 (9): 997~1005
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S (2011).
MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maxi-
mum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimo-
ny methods. Mol Biol Evol, 28 (10): 2731~2739
Theodoulou FL (2000). Plant ABC transporters. Biochim Biophys
Acta, 1465 (1~2): 79~103
Sun Y, Li H, Huang JR (2012). Arabidopsis TT19 functions as a car-
rier to transport anthocyanin from the cytosol to tonoplasts. Mol
Plant, 5 (2): 387~400
Wagner U, Edwards R, Dixon DP, Mauch F (2002). Probing the di-
versity of the Arabidopsis glutathione-S-transferase gene family.
Plant Mol Biol, 49 (5): 515~532
Zhang H, Wang L, Deroles S, Bennett R, Davies K (2006). New
insight into the structures and formation of anthocyanic
vacuolar inclusions in flower petals. BMC Plant Biol, 6: 29
doi:10.1186/1471-2229-6-29