全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (7): 901~908　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0252 901
收稿 2014-05-26　　修定 2014-06-16
资助 浙江农林大学启动经费(2010FR042)。
* 通讯作者(E-mail: jkrong@yahoo.com; Tel: 0571-63742027)。
过量表达棉花GaSus3基因增强拟南芥的耐盐性
王敏华1,2, 丁明全2, 陈爱群3, 张毓婷1,2, 戎均康2,*
浙江农林大学1亚热带森林培育国家重点实验室培育基地, 2浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室, 浙江临安311300;
3南京农业大学资源与环境科学学院, 南京210095
摘要: 构建了植物过量表达载体p35S::GaSus3, 通过花序浸染法成功获得转GaSus3基因拟南芥植株。利用NaCl模拟盐胁迫
处理, 证实转基因拟南芥与野生型相比耐盐性明显增强。在盐胁迫下, 转基因拟南芥受到的影响较小, 而野生型则受盐害
影响严重: 转基因拟南芥具有更好的萌发率和主根长度, 以保证植株正常生长; 盐胁迫下转基因拟南芥能保持较多的绿色
叶片, 而野生型则过早黄化死亡。研究还发现, 转基因拟南芥的过氧化氢酶活性在胁迫前后都高于野生型, 这说明转Ga-
Sus3基因能够提高拟南芥抗氧化胁迫的能力。研究结果为进一步探讨GaSus3基因在棉花耐盐方面的功能奠定了基础。
关键词: 棉花GaSus3基因; 盐胁迫; 过量表达; 基因功能研究
Over Expression of a Cotton GaSus3 Gene Enhancing the Salt Stress Tolerance
of Arabidopsis thaliana
WANG Min-Hua1,2, DING Ming-Quan2, CHEN Ai-Qun3, ZHANG Yu-Ting1,2, RONG Jun-Kang2,*
1Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, 2Key Laboratory for Quality Improvement of Agri-
cultural Products of Zhejiang Province, Zhejiang A & F University, Lin’an, Zhejiang 311300, China; 3College of Resources and
Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: A plant over expression vector p35S::GaSus3 was constructed and transformed into the Arabidopsis.
Transgenic plants were obtained successfully by floral dip method. Compared to the wide type plants, the salt
resistance ability of GaSus3 transgenic plants were enhanced significantly under NaCl treatments. Under salt
stress concentration, the growth rate of the wild-type Arabidopsis was severely suppressed, while the transgenic
Arabidopsis showed less impact. Transgenic plants showed better seed germination rate and relatively longer
root length than wild type, which could support plant growth under stress condition. Besides, the leaves of
transgenic plants were less harmed which keep more green blade, whereas the wild-type Arabidopsis showed
early yellowing and death. A relative significantly higher catalase activity had been found in transgenic plant
compared with the wide type before and after salt stress treatment, which indicated that over expression of Ga-
Sus3 could significantly enhance the plants ROS scavenge ability. The result showed that with the comparison
of wide type plants, the salt resistance ability of transgenic plants were enhanced significantly. All these results
help to establish the basis of study the functions of GaSus3 in response to salt stress in the future.
Key words: cotton GaSus3; salt stress; over expression; gene function research
当植物受到低温、干旱、高盐等非生物胁迫
时, 会产生保护性反馈。蔗糖是高等植物光合作
用的主要产物, 不仅是重要的细胞结构组分和能
量来源, 直接影响植物的生长发育, 还可以作为信
号物质调节植物多种生理进程(Jang等1997; Loreti
等2001)。植物细胞中蔗糖含量增加不仅能为植物
适应胁迫提供能量, 也是植物体通过自身渗透调
节维持胞内环境稳定的表现 ( H a n s o n和H i t z
1982)。已证实蔗糖在植物抵御逆境胁迫的渗透调
节中具有重要作用(Sasaki等2001)。
蔗糖合酶(Sus)是参与蔗糖代谢的关键酶, 能
可逆地催化蔗糖与UDP形成UDPG和果糖(Geigen-
berger和Stitt 1993; Heim等1993)。自Cardini等
(1955)首次在小麦胚芽中发现蔗糖合酶后, 很多高
等植物如拟南芥(Chopra等1992)、玉米(McCarty等
1986)、土豆(Salanoubat和Belliard 1987)、棉花
(Ruan等1997)、甘蔗(Lingle和Dyer 2001)中也克隆
到Sus基因。
植物生理学报902
蔗糖合酶基因在植物生长发育和响应逆境胁
迫过程中起重要作用, 研究发现, 许多逆境条件都
可诱导Sus基因的表达。在拟南芥中, 蔗糖合酶成
员AtSus1和AtSus4在厌氧条件下表达量增加(Baud
等2004)。Biemelt等(1999)对马铃薯Sus突变体的
研究发现, 经过低氧胁迫又恢复供氧后, 突变体植
株恢复生长的能力比野生型弱, 说明Sus在低氧胁
迫中起着关键作用。Ricard等(1998)在对玉米双基
因(Sus1/sh1)突变体的研究中也得到了相似的结
果, 认为Sus在玉米根尖的缺氧耐受中起着重要的
作用。在对小麦的研究中也发现Sus可以被低氧环
境诱导表达(Albrecht和Mustroph 2003)。在低温环
境下, 洋白菜幼苗中的蔗糖含量和Sus活性都有所
增加(Sasaki等2001), 低温处理也可引起小麦中Sus
活性增加 , 尤其是在根中S u s 1的表达量上升
(Maraña等1990)。大麦蔗糖合酶的Sus1和Sus3可
被低温环境诱导表达(Barrero-Sicilia等2011)。拟南
芥中AtSus3在叶片失水、渗透胁迫及后熟的种子
等各种脱水条件下在各个组织中均有表达(Baud等
2004), 大麦蔗糖合酶成员Sus3可被干旱胁迫诱导表
达, 何美静等(2012)利用10% PEG模拟干旱处理花
生幼苗, 发现胁迫后AhSus的转录表达量、蔗糖合
成酶活性和蔗糖含量均有升高, 推测该基因能够响
应干旱胁迫, 在花生抗旱调控中起着一定的作用。
上述研究表明Sus基因在植物抵御逆境胁迫中起着
重要作用, 因此对Sus基因的研究对于阐明植物的
抗逆机理、指导作物抗逆育种具有重要意义。
在棉花中已克隆并定位到了7个Sus家族基因
(Chen等2012), 其中Sus3已被证明在棉纤维起始及
伸长过程中起重要作用(Ruan等2003; Ruan 2005),
而棉花蔗糖合酶在抗逆方面的研究尚无报道。基
于Sus基因在其他植物的抗逆调节中发挥的作用,
本研究利用转基因技术, 将棉花GaSus3基因通过
花絮浸染法在模式植物拟南芥中进行过量表达,
利用NaCl模拟盐胁迫环境, 研究GaSus3基因在植
物抵御盐胁迫过程中的作用, 以期为揭示GaSus3
基因的抗逆机制, 丰富GaSus3基因的生物学功能
研究和为棉花分子设计育种提供理论依据。
材料与方法
1 试验材料
哥伦比亚野生型拟南芥(Col-0, Arabidopsis
thaliana L.)种子、植物过表达载体pBI121质粒、
根癌农杆菌GV3101由本实验室保存; 大肠杆菌感
受态细胞选用全式金Trans1-T1; 凝胶回收试剂
盒、质粒微量提取试剂盒购自Axygen公司; 限制
性内切酶BamHI和SacI、T4连接酶、DNA聚合
酶、DNA消化酶、Reverse Transcriptase M-MLV
试剂盒购自大连宝生物公司(TaKaRa); 其他试剂购
自上海生工生物公司或为国产分析纯试剂; 引物
合成和序列测序由华大基因完成。
2 转GaSus3基因拟南芥的获得
2.1 植物表达载体构建、遗传转化及初步筛选
设计特异引物, 并以树棉(Gossypium arbore-
um Linn.)品种‘A2-47’的cDNA为模板扩增GaSus3
基因, 构建克隆载体。根据植物表达载体pBI121
和GaSus3基因序列分析, 设计引物引入BamHI和
SacI限制性酶切位点(GaSus3-BAMF: 5′-TTAG-
GATCCTCCATTGCGTTAAACCCCTCCAT-3′; Ga-
Sus3-SACR: 5′-TTAGAGCTCCGGCGAAAAAAG-
GAAAAGGAAAAG-3′), 经PCR扩增后与pBI121载
体一同进行双酶切, 回收片段连接、转化大肠杆
菌, 经酶切和测序验证无误后得到植物表达载体
p35S::GaSus3。将p35S::GaSus3质粒转化农杆菌
GV3101, 挑取单克隆后进行菌液PCR、质粒酶切
和测序验证。利用农杆菌特性通过拟南芥花序浸
染法(Clough和Bent 1998)进行拟南芥的遗传转
化。浸染后收获的拟南芥种子, 经75%酒精和2%
次氯酸钠灭菌后, 播种于含50 mg·L-1 Kan的1/2MS
选择培养基上, 4 ℃黑暗春化3 d后转入正常条件
(19~21 ℃, 16 h光照/8 h黑暗)下培养。2周后将正
常生长的幼苗移栽到培养钵中(营养土:有机质=
3:1), 覆膜后置于培养室中继续培养, 待拟南芥恢
复生长后揭去覆膜。植株经分子检测和自交纯化
后, 得到T3代植株用于后续实验。
2.2 转基因拟南芥的分子检测
利用经典CTAB法提取拟南芥基因组DNA, 用
GaSus3基因引物进行PCR扩增, 1%琼脂糖电泳检
测目的条带, 筛选出基因组中有GaSus3基因整合
的拟南芥植株。利用pBIOZOL试剂盒提取拟南芥
RNA, 经DNA酶消化处理, 反转录后设计引物进行
RT-PCR, 选取拟南芥AtGAPC基因作为内参基因,
1%琼脂糖电泳检测结果, 以验证GaSus3基因是否
能在拟南芥中正常表达。
王敏华等: 过量表达棉花GaSus3基因增强拟南芥的耐盐性 903
3 盐胁迫下转基因拟南芥观测
3.1 盐胁迫下转基因拟南芥的萌发实验
将灭菌后的野生型和转基因拟南芥种子播种
于未加入和加入100 mmol·L-1 NaCl的MS培养基
上。4 ℃黑暗春化3 d后转入正常条件(19~21 ℃,
16 h光照/8 h黑暗)下培养。培养7 d后选取3个重复,
每重复约100粒种子, 统计拟南芥的萌发情况。
3.2 培养基盐胁迫下转基因拟南芥的形态观测
拟南芥种子灭菌后, 播种于空白和含100 mmol·L-1
NaCl的MS培养基上, 经春化后正常培养。直立培
养2周后, 选取3个重复, 每重复30株幼苗, 进行主
根长的测量和记录。水平培养3周后, 观测植株形
态并拍照记录。
3.3 盐胁迫下盆栽转基因拟南芥形态观测
拟南芥种子灭菌处理后, 铺于MS培养基上,
春化后正常培养。14 d后选健壮幼苗移栽到培养
钵中(营养土:有机质=3:1), 覆膜后置于培养室中继
续培养(19~21 ℃, 16 h光照/8 h黑暗), 待拟南芥恢
复生长后揭去覆膜。选取长势一致的1月龄拟南
芥植株, 分别用100和200 mmol·L-1 NaCl溶液浇灌
模拟盐胁迫处理, 对照组浇灌清水。观测并拍照
记录拟南芥植株生长状况。
3.4 转基因拟南芥过氧化氢酶活性测定
选取长势一致的1月龄拟南芥植株 , 用200
mmol·L-1 NaCl溶液浇灌拟南芥进行胁迫处理。分
别测定胁迫处理前和处理3 d后拟南芥植株的过氧
化氢酶活性(Aebi 1984)。
实验结果
1 转基因拟南芥的获得与鉴定
1.1 棉花GaSus3基因的克隆与鉴定
通过PCR反应, 从树棉‘A2-47’ cDNA中扩增
GaSus3基因, 得到大小为2 418 bp的片段(图1), 经
克隆、测序验证为GaSus3基因(Chen等2012)。
1.2 植物表达载体的构建
构建好的p35S::GaSus3表达载体经酶切鉴定出
现预期的2条带(图2), 测序后证实目的片段与载体
连接正确, 表达载体构建成功。将重组质粒转化
农杆菌GV3101后, 挑取单克隆进行菌液PCR检测,
1%琼脂糖电泳检测出现目的片段(图3), 说明农杆
菌转化成功, 提取阳性克隆质粒酶切、测序验证无
误, 农杆菌菌液即可用于下一步的拟南芥转化。
1.3 转基因拟南芥的抗性筛选及分子检测
在抗性培养基上, 转化成功的拟南芥能够正
常生长, 而未转化成功的拟南芥在卡那霉素作用
下逐渐白化死亡。将抗性培养基初筛得到的幼苗
移栽到培养钵中继续培养成苗, 剪取拟南芥叶片
提取基因组DNA, 用目的片段引物进行PCR检测,
1%琼脂糖电泳出现目的条带(图4), 表明GaSus3基
因已经成功整合到拟南芥基因组中。进一步提取
图1 GaSus3基因的克隆
Fig.1 Cloning of GaSus3 gene
M: Marker 5000; 1: GaSus3扩增条带; 2: 阴性对照。
图2 重组质粒p35S::GaSus3酶切鉴定
Fig.2 Digestion of recombinant plasmid of p35S::GaSus3
M: Marker 15000; 1: BamHI和SacI双酶切; 2: BamHI单酶切。
植物生理学报904
植株RNA, 进行RT-PCR检测(图5), 结果显示Ga-
Sus3基因能够在拟南芥中正常表达。筛选到的阳
性植株自交纯化后可以用于进一步实验。
野生型的萌发率存在极显著差异。野生型拟南芥
生长受到强烈的抑制, 萌发率明显下降, 降幅达
20%。而转基因拟南芥虽也受到一定的抑制, 但萌
发状况明显优于野生型, 依然能达到92% (图6)。
结果显示, GaSus3基因的转入, 提高了拟南芥抵御
盐胁迫的能力。
图4 转基因拟南芥PCR检测
Fig.4 PCR detection of transgenic Arabidopsis plant
M: Marker 5000; 1: 野生型; 2~6: 转基因拟南芥; 7: 阳性质粒。
图5 转基因拟南芥RT-PCR表达分析
Fig.5 Expression analysis of transgenic Arabidopsis using
RT-PCR
1~5: 转基因拟南芥; 6: 野生型。
2 转基因拟南芥耐盐胁迫能力优于野生型
实验获得多个转基因拟南芥株系, 通过表达
水平的验证, 选取了表达量相对较高的L5、L9和
L10株系进行后续的实验。
2.1 盐胁迫下转基因拟南芥的萌发率优于野生型
相同培养条件下, 不含有NaCl的平板上, 转基
因拟南芥和野生型的种子萌发率没有明显差异;
在含100 mmol·L-1 NaCl的平板上, 转基因拟南芥和
图6 转基因拟南芥种子萌发率
Fig.6 Germination rate of transgenic Arabidopsis seed
WT: 野生型; L5、L9、L10: 转基因拟南芥; 各柱形上大写字
母不同表示差异极显著(P<0.01)。图7、11同此。
2.2 盐胁迫下转基因拟南芥的主根长度优于野生型
在MS培养基上生长2周后, 转GaSus3基因的
拟南芥主根长度短于野生型。生长到第14天时,
转基因拟南芥的平均根长约4.5 cm, 而野生型的平
均根长可以达到5.6 cm。当培养基中加入100
mmol·L-1 NaCl后, 野生型根长明显下降, 均值仅为
2.2 cm, 降幅达4.4 cm。而转基因拟南芥根长均值
为3.4 cm, 降幅为1.9 cm, 较野生型长1.2 cm, 表现
出对盐胁迫较强的耐受性(图7)。
2.3 盐胁迫下转基因拟南芥植株长势优于野生型
在MS培养基上(图8-A组), 野生型和转基因拟
南芥长势基本一致, 而在含有100 mmol·L-1 NaCl的
培养基上 , 野生型的长势明显弱于转基因拟南
芥。在胁迫培养基上生长3周后(图8-B、C组), 野
生型拟南芥植株弱小, 仅有2对叶片, 且叶缘内扣,
叶片小而色深, 玻璃化现象明显, 生长发育受阻严
重。转基因拟南芥则表现出较好的适应性, 植株
较大, 叶片3~5对, 大而色翠, 叶缘平展。这表明盐
图3 农杆菌菌液PCR检测
Fig.3 PCR analysis of Agrobacterium transformation
M: Marker 5000; 1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3~5: 不同的农杆
菌克隆。
王敏华等: 过量表达棉花GaSus3基因增强拟南芥的耐盐性 905
胁迫对转基因拟南芥造成的影响明显小于对野生
型的影响, 转基因拟南芥有更好的耐盐能力。
2.4 转基因拟南芥盐胁迫耐受能力优于野生型
对1月龄的拟南芥幼苗进行盐胁迫处理, 转基
因拟南芥的耐受力明显优于野生型。用100 mmol·L-1
NaCl溶液浇灌拟南芥幼苗4周后, 野生型植株萎蔫
明显, 而转基因拟南芥并未出现萎蔫, 生长良好(图
9)。用200 mmol·L-1 NaCl溶液浇灌拟南芥幼苗2周
后, 野生型黄化死亡, 转基因拟南芥则仍有一定绿
色叶片, 可以维持植株生长(图10)。
2.5 转基因拟南芥过氧化物酶活性高于野生型
分别测定200 mmol·L-1 NaCl处理前和处理后3
d拟南芥幼苗的过氧化氢酶活性, 结果显示在处理
前转基因拟南芥过氧化氢酶活性水平维持在1 600
U·g-1 (FW), 野生型则仅为1 250 U·g-1 (FW), 说明在
处理前转基因拟南芥的过氧化氢酶活性水平已明
显高于野生型。盐胁迫处理后, 野生型拟南芥过
氧化物酶活性升高至约1 850 U·g-1 (FW), 而转基因
拟南芥为2 450 U·g-1 (FW), 上升幅度较野生型略
高, 仍保持高于野生型的过氧化氢酶活性(图11)。
结果显示, 转基因拟南芥在正常生长条件下即具
有较高的过氧化氢酶活性, 胁迫后上升幅度也高
于野生型, 说明转GaSus3基因提高了拟南芥抗氧
图7 转基因拟南芥根系长度
Fig.7 Root length of transgenic Arabidopsis
图8 转基因拟南芥植株长势
Fig.8 Growth of transgenic Arabidopsis plants
A: 对照组; B: NaCl胁迫组; C: NaCl胁迫组单株; 1: 野生型; 2~4: 转基因拟南芥。
植物生理学报906
化胁迫的能力, 这可能是转基因拟南芥耐盐性增
强的一种表现。
讨　　论
GaSus3基因是棉花蔗糖合酶家族的重要成员,
图9 100 mmol·L-1 NaCl盐胁迫4周后的转基因拟南芥植株
Fig.9 Phenotype of 35S::GaSus3 transgenic plants after 4 weeks under 100 mmol·L-1 NaCl stress
A: 对照组; B: NaCl处理组; 1: 野生型; 2: 转基因拟南芥。箭头所示为野生型花序萎蔫。
图10 200 mmol·L-1 NaCl盐胁迫2周后的转基因拟南芥植株
Fig.10 Phenotype of 35S::GaSus3 transgenic plants after 2 weeks under 200 mmol·L-1 NaCl stress
A: 对照组; B: NaCl处理组; 1: 野生型; 2: 转基因拟南芥。
调控着细胞内蔗糖的代谢。本研究将棉花GaSus3
基因整合到拟南芥基因组中, 通过对转基因拟南
芥在盐胁迫下表现的观测, 验证GaSus3基因的功
能。结果显示, 转基因拟南芥对于盐胁迫的耐受
性优于野生型。在盐胁迫条件下, 转基因拟南芥
王敏华等: 过量表达棉花GaSus3基因增强拟南芥的耐盐性 907
图11 转基因拟南芥过氧化氢酶活性
Fig.11 Hydrogen peroxide activity of transgenic Arabidopsis
与野生型相比具有更好的萌发率, 主根长度也略
优。在同等胁迫下, 野生型拟南芥的生长受到严
重抑制, 而转基因拟南芥受到的影响较小, 植株能
够较顺利的生长。成株胁迫下, 转基因拟南芥能
保存更多的绿色叶片支持自身生长, 而野生型则
过早黄化死亡。同时转基因拟南芥在盐胁迫前后
具有较野生型高的过氧化氢酶活性, 这说明转Ga-
Sus3基因能够提高拟南芥抗氧化胁迫的能力, 这可
能是转基因拟南芥耐盐性增强的一种表现。上述
的实验结果都清晰显示出棉花GaSus3基因与植物
的耐盐性有关, 其过量表达有助于提高植物的耐盐
能力。蔗糖合酶在植物抵御盐胁迫的过程中起重
要作用, 其作用的发挥可能是通过以下两种途径。
水分子是小分子物质, 其跨膜运输是以自由
扩散的方式顺浓度梯度进行的。植物在盐胁迫下,
由于细胞外界渗透势大于细胞内部, 造成植物水
分吸收困难, 出现生理性干旱。植物体会通过增
加细胞内渗透调节物质的方式增加细胞渗透势,
促进植物吸水。研究表明, 蔗糖是调节植物细胞
渗透势的重要物质, 植物在遭受渗透胁迫时, 蔗糖
合酶表达量增加, 活性增强, 细胞中蔗糖积累增加,
促进植物吸水, 缓解胁迫影响。过量表达蔗糖合
酶基因后, 拟南芥的耐盐性增强, 可能是由于高表
达的蔗糖合酶提高了转基因拟南芥细胞中蔗糖的
含量, 使得转基因拟南芥具有高的细胞渗透势。
当受到盐胁迫时, 植株仍能保持较高的细胞内外
渗透压, 缓解了吸水困难, 保证水分需求, 从而表
现出较好的盐耐受力。同时蔗糖含量的提高还能
为细胞呼吸提供充足底物, 产生更多能量抵御逆
境影响。
纤维素是细胞壁的重要成分, 其合成的底物是
UDPG, 在植物中UDPG合成有两种途径: 一是在
UDPG焦磷酸化酶的作用下, 以1-磷酸葡萄糖和
UTP为原料合成UDPG; 另一途径是在质膜定位的
蔗糖合酶作用下以蔗糖和U D P作为原料合成
UDPG (Haigler等2001)。植物在遭受盐胁迫时, 细
胞壁的物质成分、代谢相关酶活性和机械特性会
发生变化(裴惠娟等2011)。蔗糖合酶的过量表达,
可能使得转基因拟南芥中的UDPG含量升高, 保证
纤维素合成过程中有充足的底物供给, 促进了纤
维素合成。细胞壁纤维素含量的提高, 增加了细
胞壁的交联度, 减小转基因植株的细胞壁孔径, 增
强细胞保水能力, 从而使转基因拟南芥具有更好
的耐盐性。
研究中还发现, 转基因拟南芥在正常条件下,
具有较高的过氧化氢酶活性。过氧化氢酶是逆境
条件下酶促防御系统的关键酶之一, 是一种活性
氧清除酶。活性氧的产生是线粒体、叶绿体和质
膜上电子传递的结果。即随电子传递到分子氧上
而产生。转基因拟南芥具有较高的过氧化氢酶活
性, 推测可能是过量表达的蔗糖合酶提高了细胞
中的蔗糖浓度, 增大了细胞渗透势, 使植物细胞处
于一种类似胁迫响应的状态, 调动了细胞内的酶
促防御系统, 以适应逆境胁迫, 是植物抗逆性增强
的一种表现。
本研究不仅采用了传统的浇灌胁迫处理方法,
同时选用更加容易控制胁迫条件也更容易达到一
致处理条件的培养基胁迫处理方法, 分别在拟南
芥的萌发期、幼苗期以及成苗期都进行了盐胁迫
实验, 并获得了一致的实验结果, 证明转基因拟南
芥在不同的发育时期都有良好的耐盐性, 结果重
复性好、可信度高。
棉花作为中国重要的经济作物, 其产量和品
质的提高一直以来都是育种工作的重点。前人研
究显示, 蔗糖合酶与棉纤维的发育有关(Ruan等
2003; Ruan 2005), 影响棉花的产量和品质, 而本研
究结果证实GaSus3基因与植物抵抗盐胁迫相关,
更丰富了蔗糖合酶的生物学功能研究, 为进行棉
植物生理学报908
花优质、抗逆等品种培育工作的顺利开展, 提供
了理论依据。
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