全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月 625
收稿 2008-12-08 修定 　2009-04-15
资助 教育部新世纪优秀人才支持计划(NECT-06-0327)和国
家高技术研究发展计划(“863”计划) (2007AA021405)。
* 通讯作者(E-mail: daishaojun@hotmail.com; Tel: 0451-
8 2 1 9 2 2 3 7 )。
分子生物学技术在蕨类植物研究中的应用
杜红红 1,2, 刘红梅 3, 石雷 2, 戴绍军 1,*
1东北林业大学生命科学学院, 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040; 2中国科学院植物研究所, 北京
100093; 3北京大学深圳研究生院, 城市人居环境科学与技术重点实验室, 广东深圳 518055
Application of Molecular Biology Techniques in Pteridophyte Researches
DU Hong-Hong1,2, LIU Hong-Mei3, SHI Lei2, DAI Shao-Jun1,*
1Key Laboratory of Forestry Tree Genetics Improvement, Ministry of Education, College of Life Sciences, Northeast Forestry
University, Harbin 150040, China; 2Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China; 3The Key Laboratory
for Environmental and Urban Sciences, Shenzhen Graduate School, Peking University, Shenzhen, Guangdong 518055, China
提要: 近年来, 分子标记、基因克隆、RNA干扰和基因芯片等分子生物学技术已应用于蕨类植物的系统进化、遗传多样
性、孢子萌发以及生理代谢分子机制的研究。本文介绍近年来分子生物学技术在蕨类植物研究中的应用进展。
关键词: 蕨类植物; 分子标记; 基因芯片; 分子系统学
蕨类植物是维管植物中一个较为特殊的类群,
其发达的孢子体和退化的配子体均能够独立生活。
在对蕨类植物长期的研究过程中, 人们已从形态
学、细胞学和生理学的角度认识了蕨类植物的类
群划分、生长发育和生理代谢的特点。近年来,
随着分子生物学技术在种子植物中应用的不断完善
和成熟, 人们也开始应用这方面的方法和技术探讨
蕨类植物生长发育和代谢的分子机制(Sundaram等
2008; Schallau等 2008)。同工酶技术、分子标记
技术和分子系统学研究方法的应用, 为深入分析蕨
类植物系统进化、种群结构、遗传变异和亲缘关
系提供了新的手段(王中仁 1996; 刘红梅等 2009)。
同时, 人们还开始以水蕨(Ceratopteris richardii)等
为模式植物, 采用基因克隆与转化、RNA干扰(或
DNA干扰)或基因芯片等技术研究蕨类植物的孢子
萌发、配子体发育以及生理代谢过程中对不同环
境因子响应的分子调控机制(Banks 1999)。本文就
近年来分子生物学技术在蕨类植物研究中的应用研
究概况作一介绍。
1 分析蕨类植物遗传多样性的分子标记技术
遗传多样性揭示了种群遗传变异规律和变异
机制, 代表了物种对外部环境的适应能力。遗传多
样性可以体现在从形态到DNA分子的各个水平上,
目前已经建立在不同水平上的遗传多样性检测方法
主要包括: (1)等位酶分析(allozyme analysis)技术; (2)
以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)
为基础的DNA分子标记技术, 如限制性内切酶酶切
片段长度多态性( res tr ict ion fr agment length
polymorphism, RFLP)、扩增酶切片段多态性
(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、
随机扩增的多态性DNA (random amplified polymor-
phic DNA, RAPD)和单链构象多态性 PCR (single
strand conformation polymorphism-PCR, SSCP-PCR)
等; (3)以重复序列为基础的标记技术, 如卫星DNA
(satellite DNA)、微卫星DNA (microsatellite DNA,
MS DNA)、简单重复序列(simple sequence repeat,
SSR)、表达序列标签 -微卫星(expressed sequence
tag-SSR, EST-SSR)和间隔简单重复序列(inter-
simple sequence repeats, ISSR)技术等。近年来, 这
些研究手段开始逐渐用于蕨类植物遗传多样性的研
究, 为全面准确地反映蕨类植物的遗传多样性、群
体遗传结构和亲缘关系以及保护和利用蕨类植物提
供了有价值的遗传学信息。
1.1 等位酶分析技术 等位基因酶(al1ozyme)是指同
一基因位点上等位基因所编码的同种酶的不同分子
植物生理与分子生物学 Plant Physiology and Molecular Biology
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月626
形式。与DNA标记技术相比, 虽然等位酶标记有
信息量少、不能直接检测DNA水平上的遗传变异
以及所需新鲜样品量较大等缺点, 但是在蕨类植物
遗传多样性的早期研究中曾被广泛应用。利用等
位酶分析技术, 潘丽芹等(2005)在三峡库区特有的
荷叶铁线蕨(Adiantum reniforme var. sinense)中检
测到了酯酶(EST)、酸性磷酸酶(ACP)、苹果酸脱
氢酶(MDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和甲酸脱氢
酶(FDH)共 5个酶系统的 14个酶位点, 并根据对等
位基因平均数、多态位点百分率、期望杂合度和
遗传变异等分析, 发现荷叶铁线蕨居群内和居群间
的遗传分化均较低。此外, 陈媛媛等(2003)在用 7
种酶系统分析中华水韭(Isoetes sinensis)的遗传变异
时, 共检测出 16个位点 27个等位基因, 其中 12个
位点表现出多态性, 据此认为中华水韭的遗传多样
性较低。
1.2 AFLP技术 Kang等(2005)应用AFLP技术研究
了中华水韭现存7个居群的群体遗传结构和遗传分
化, 用 8对引物扩增出的 343个条带中有 210条表
现出多态性(占 61.2%), 基因分化系数为 0.535, 不
仅表现出高度的群体内遗传多样性, 而且群体间也
有较高的遗传变异, 他们推测这种情况很可能是由
于日益缩小的种群规模引起的遗传漂变造成。此
外, Nakazato等(2006)将AFLP与RFLP技术结合使
用构建了水蕨基因组结构的遗传图谱, 初步获得了
基因拷贝数以及这些拷贝在基因组中的分布特点。
1.3 RAPD技术与SSCP-PCR技术 陈进明等(2004)
采用RAPD方法对中华水韭的居群研究显示, 所选
居群总的多态位点百分率为58.06%, 居群间基因分
化系数为0.589, 即遗传变异中有相当一部分来源于
居体间, 因此作者认为日益缩小的种群规模而导致
的居群内近交和遗传漂变的发生以及居群间有限的
基因交流可能是造成中华水韭目前遗传结构的主要
成因。Wang等(2004)和 Su等(2004)则将RAPD技
术与叶绿体 atpB-rbcL IGS序列分析相结合, 探讨
了我国华南地区孑遗蕨类植物刺桫椤(Alsophila
spinulosa)种群的遗传多样性。另外, Noumi等
(1984)在 F1-ATPase基因的研究中发现, 相同长度
的DNA小片段, 即使仅有一个碱基的差异, 经聚丙
烯酰胺凝胶电泳后也能明显地被分开, 这种由碱基
差异引起的DNA片段迁移率不同的现象称为单链
构象多态性( s i n g l e - s t r a n d c o n f o r m a t i o n
polymorphism, SSCP)。Ishikawa等(2002)利用此
技术对Dryopteris caudipinna的pgiC基因进行了分
析, 结果表明D. caudipinna两个居群的平均期望杂
合度(HE)分别为 0.61和 0.39, 具有较高的群体杂合
度和遗传分化。
1.4 EST-SSR技术和ISSR技术 Woodhead等(2003,
2005)运用 EST-SSR技术对Athyrium distentifolium
进行了遗传多样性研究。他们从 1 152个植物体
的cDNA克隆中得到165个微卫星, 在74个微卫星
上设计出引物, 随后在 6个群体的 186个个体中检
测到 10个 SSR的位点, 每个位点有 2~7个等位基
因, 统计结果显示, 平均期望杂合度的变化范围在
0.027~0.809之间, 扩增条带表现出丰富的多态性,
由此表明 EST-SSR技术适合于蕨类植物遗传多样
性的研究。Korpelainen等(2005)借助 ISSR指纹识
别技术分析铁线蕨属(Adiantum)的毛叶铁线蕨
(A. hispidulum)、楔叶铁线蕨(A. raddianum)、A.
incisum和 A. zollingeri等 4个种的遗传变异, 发现
铁线蕨属表现出丰富的遗传变异, 而且71.1%的变
异发生在居群内, 18.5%的变异发生在种间, 10.4%
的变异发生在同一物种的不同居群间且遗传分化系
数较低(0.089~0.179)。此外, Dong等(2007)利用
ISSR分子标记技术研究粗梗水蕨(C. pteridoides)的
遗传多样性时, 13组引物共扩增出 125个条带, 多
态位点(PPB)占 44.8%, 群体间遗传分化系数为
0.297, 反映出这种濒危水生蕨类的遗传多样性和群
体间遗传分化程度均较低。
2 蕨类植物基因表达与功能分析
2.1 蕨类突变体的获得 研究和分析突变体形态与
代谢特征是解析基因功能的主要手段之一。真蕨
类植物配子体能通过自体受精, 形成每个位点均纯
合的纯合子, 容易分离和获得突变体, 同时可以根
据基因突变后配子体的形态特征鉴别显性与隐性突
变基因的表达, 便于进行分子生物学和遗传学研
究。水蕨(C. richardii)是一种优良的模式植物, 其
生活史短, 孢子萌发后 10~12 d就能发育成性成熟
的配子体并产生精子器和颈卵器, 受精卵经 3个月
就可发育为能产生孢子的孢子体(Banks 1997)。获
得水蕨突变体的主要方法是用X-射线或甲基磺酸
乙酯(EMS)处理孢子, 处理后2周M1代的配子体就
可以发育成熟, 并且表现出与野生型不同的发育和
代谢特征。迄今已经获得 10余种蕨类突变体, 主
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月 627
要包括以下几种类型: (1)孢子萌发相关突变体。
如暗萌发突变体的孢子可以在全黑暗条件下正常萌
发, 而不同于野生型孢子需要红光诱导才能萌发, 而
且暗萌发突变体的配子体与野生型也有明显差异
(Kamachi等 2004)。(2)光形态建成相关突变体。
野生型配子体在红光的照射下, 叶绿体会朝着红光
光源的方向移动, 但phy3突变体的叶绿体在红光下
缺少这种反应(Tsuboi等 2006)。另外, 铁线蕨(A.
capillus-veneris)中缺少叶绿体避光反应的phot1和
phot2突变体(Wada 2007)。(3)性别分化相关突变
体。在水蕨中已经获得多种单突变体或多突变体,
其中具有代表性的包括, ① her突变体: 配子体对
成精子囊素(antheridiogen)不敏感, 在成精子囊素存
在条件下发育成雌雄同体的配子体(Kamachi等
2007); ② tra突变体: 在没有成精子囊素存在条件
下, 仍然会发育成雄性配子体; ③ fem突变体: 配子
体发育成雌性配子体的突变体; ④ man突变体: 在
成精子囊素存在时发育成雄性配子体, 无成精子囊
素存在时发育成雌雄同体配子体, 但配子体上能产
生高于正常情况10倍或更多的精子器(Banks 1999)。
(4)响应环境胁迫的突变体。如抗盐和抗除草剂的
突变体, 这些突变体的配子体对NaCl和草甘膦具有
很强的抗性(Caliea 2005)。
2.2 分析基因功能的RNA干扰和DNA干扰技术
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是真核生物体
内的一种基因调控机制。人们采用真核生物的这
一特征设计并构建了可转录为 dsRNA的表达载体
(RNAi载体), 用于抑制真核生物体内特定基因的表
达, 然后通过获得表达构建序列的转基因植株(遗传
稳定的突变体)分析目的基因的功能。与之相似,
DNA干扰(DNAi)是真核生物体内由双链 DNA
(double stranded DNA, dsDNA)介导体内同源序列
降解的现象, 人们据此发展了DNAi技术。相对于
RNAi技术, DNAi省去了构建dsRNA表达载体的步
骤, 因此更为方便和简单, 而且可以高通量且有效
地抑制目的基因表达(Kawai-Toyooka等 2004)。人
们最初分别利用DNAi和RNAi技术, 成功地抑制了
水蕨幼配子体发育过程中与叶绿素合成和叶绿体发
育相关的同源基因CrChlI、CrFtsZ和CrUrod以及
CrCaM1、CrCPK1和CrPRO1基因的表达(Stout等
2003; Rutherford等 2004), 从而证明了这两种技术
手段在研究蕨类配子体发育过程中的有效性, 并且
明确了这些基因在配子体中的功能。进而, Kawai-
Toyooka等(2004)用DNAi技术证明了铁线蕨配子
体的AcPHOT2 (叶绿体避光反应相关基因)参与叶
绿体避光反应的移动过程, 而AcPHY3基因(红光介
导的光受体趋光性同源基因)参与萌发不久的丝状
体细胞红光趋光性过程。van der Weele等(2007)
也利用RNAi技术证明了Mv-mago基因参与苹科植
物Marsilea vestita精子发生的细胞分裂过程。
2.3 分析孢子萌发相关基因表达的基因芯片等技术
蕨类的孢子萌发是一个受到多个基因精细调控的
细胞学过程。孢子在光照(或激素和植物生长调节
物质)条件下打破休眠状态启动萌发, 先以重力作用
建立极性, 进行一次不对称的细胞分裂并萌发出假
根和丝状体原始细胞, 后者继续分裂形成配子体
(Roux等 2003)。Salmi等(2005)用 cDNA微阵列技
术分析了水蕨孢子萌发过程中不同时间点mRNA
表达丰度的变化, 发现孢子萌发最初24 h转录本的
表达丰度没有明显变化, 萌发 48 h时有 900多个
mRNA (占初始转录本的 29%)的表达丰度明显改
变, 这表明孢子在进行了第一次细胞分裂后由静止
状态迅速转为活跃的代谢状态。同时, 作者通过对
水蕨孢子EST的分析显示, 参与孢子萌发过程的基
因可能超过 14 000个, 其中 3 500多个基因序列与
拟南芥具有高度相似性。在此基础上, Salmi等
(2007)利用 cDNA芯片和实时定量PCR技术, 证明
了水蕨孢子萌发过程中3个参与信号转导和胁迫反
应的基因受到外源伟哥(viagra)的影响, 由此证明
NO/cGMP信号途径参与了重力指导的孢子极性建
立过程。此外, 人们已用分子生物学技术分析了部
分参与光调控孢子萌发基因的功能, 如红光对孢子
萌发的促进作用是通过光敏色素蛋白基因家族
PHY1、PHY2和 PHY4的调控来完成, 而且已经在
铁线蕨孢子中克隆出这些基因(Wada 2007)。铁线
蕨孢子细胞核的移动在红光、蓝光和黑暗条件下
分别受到 neo1、phot2与 phot1等不同基因的调控
(Tsuboi等 2007)。Imaizumi等(2000)从铁线蕨中分
离出蓝光受体基因家族中的 5个基因(CRY1-5), 并
证明CRY3和CRY4基因有调节蓝光抑制孢子萌发
的作用, 同时也找到了部分孢子萌发特异表达基因
的同源基因并推测了这些基因的功能, 如认为PgiC
基因编码的蛋白质与葡萄糖磷酸酶具有较高的同源
性; S t ou t 等( 2 0 0 3 )的研究则证明 C r C a M 1、
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月628
CrCPK1和CrPRO1基因编码的蛋白产物与钙离子
信号通道有关。
2.4 性别分化相关基因的功能分析 多数孢子同型
的真蕨类植物其性别分化受激素、接种密度和营
养条件等环境因素的影响。成精子囊素和赤霉素
在蕨类植物性别分化过程中起着关键作用, 此类激
素存在时, 配子体即发育成雄配子体; 若缺少此类
激素, 配子体发育成两性或雌配子体。而且, 当除
去已发育成雄配子体的环境中的这两类激素, 雄配
子体上尚未发生性别分化的细胞就会发生逆转, 从
而导致雄配子体发育为雌雄同体的两性配子体
(Banks 1999)。在自然条件下, 孢子萌发后生长发
育较快的配子体形成雌配子体或两性配子体, 这些
配子体向环境中分泌激素, 以致生长较慢的配子体
形成雄配子体。此外, 高密度、弱光照和饥饿条
件均更有利于配子体精子器的形成(Banks 1999;
Huang等 2004)。近年来, 人们已经克隆到了受激
素影响的性别决定基因FEM和TRA, 其中FEM促
进雄配子体形成, 而 TRA则促进雌配子体形成, 而
且这2个基因的表达相互抑制, 同一配子体中也只
表达其中一类基因。成精子囊素可以激活HER基
因, 从而抑制 TRA基因, 使 FEM基因得以表达, 由
此产生雄配子体, 反之则产生雌配子体(Banks 1999;
Eberle和 Banks 1996)。此外, Wen等(1999)用消
减杂交(subtractive hybridization)技术从水蕨配子体
中分离出ANI1基因, 并通过突变体分析发现ANI1
基因往往瞬时表达并通过与TRA5表达相互抑制参
与性别决定。
2.5 应答环境胁迫基因的功能分析 近年来, 人们利
用基因克隆与转化等分子生物学技术分析了以蜈蚣
草(Pteris vittata)为代表的凤尾蕨科以及蕨科植物对
金属(如As、Cd和Ni)超富集或耐受能力的分子机
理(Ma等2001), 并克隆和表征了其中一些关键的功
能基因, 如蜈蚣草中的谷氧还蛋白基因(PvGrx5)、
砷酸盐还原酶基因(PvACR2)、磷酸丙糖异构酶
(TPI)的同源基因(PV4-8 )和植络素合成酶基因
(PvPCS1)等, 通过在拟南芥和大肠杆菌中将这些基
因敲除或超量表达分析表明, 它们参与了生物体抗
砷过程中氧化还原等关键事件的调控( Dong 等
2005; Duan等 2005; Ellis等 2006; Rathinasabapathi
等 2006; Sundaram等 2008)。此外, 满江红(Azolla
filiculoides)中的金属硫蛋白基因(AzMT2)参与了植
物体对 Cd2+和Ni2+等重金属离子解毒的代谢过程
(Schor-Fumbarov等 2005)。
3 蕨类植物起源与进化研究中的分子生物学技术
蕨类植物是一个非常古老的类群, 其起源可以
追溯到 4亿多年前。研究者们根据化石标本和现
存植物的形态比较以及地理分布等特征, 建立了蕨
类植物的起源和系统发生关系。自上世纪90年代,
随着分子生物学的兴起, 在DNA分子水平上重建蕨
类植物系统进化关系逐渐成为蕨类研究中的热点。
蕨类分子系统学研究常用的分子标记主要来自叶绿
体基因组, 如 rbcL基因、atpB基因、rps4和 rps4-
trnS基因间隔区(intergenic spacer region, IGS)以及
trnL-F基因间隔区(刘红梅等 2009)。rbcL基因编
码 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 /氧化酶大亚基, 位于
植物叶绿体DNA的大单拷贝区, 长约 1 400 bp, 该
基因进化速率相对较慢, 主要用于研究蕨类植物科
和目甚至整个蕨类类群的系统进化关系。atpB基
因编码叶绿体ATP合成酶的β亚基, 该基因进化速
率慢, 序列保守但能提供足够的系统发育信息, 多
用于蕨类植物目、科和属水平上的系统发育重
建。rps4基因长约 600 bp, 该基因多与 rps4-trnS
IGS联合用于系统发育分析。trnL-F基因间隔区
是编码转运RNA (tRNA)的trnL基因与trnF基因之
间的一段基因间隔区, 长 160~440 bp, 一般用于科
内属间或者属下的系统学研究(刘红梅等 2009)。
利用这些基因序列进行的分子系统学研究为验证传
统分类系统科属分类关系的合理性提供了证据, 并
且对划分外部形态相似却难以依据经典分类方法区
分的类群亦有很大帮助。
3.1 维管植物各类群的重新界定 传统分类观点认
为, 从蕨类植物开始具有维管束组织, 据此将其与
种子植物合称为维管束植物, 并将其分为松叶蕨类
(Psilophytina)、石松类(Lycophytina)、木贼类
(Sphenophytina)、水韭类(Isoephytina)和真蕨类
(Filicophytina) 5个类群。Pryer等(2001)通过对 35
种代表性陆生植物的形态性状与 4 个基因序列
(atpB、rbcL、rps4和 18S rDNA)的分析, 重新界
定了维管植物各个类群之间的关系, 现存维管植物
分为 3个单系类群: (1)石松类、(2)种子植物和(3)
木贼类、松叶蕨类和真蕨类(薄囊蕨类和厚囊蕨
类), 其中石松类是维管植物的最早分支, 木贼类和
真蕨类与种子植物的亲缘关系最近。P r y e r 等
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月 629
(2001)的研究也推翻了传统认为蕨类植物为一自然
单系类群的观点。
3.2 早期薄囊蕨类之间的系统发育关系 不同学者
综合 atp1、atpB、rbcL、rps4、18S rDNA和核
SSU rDNA基因序列, 重建了早期薄囊蕨类的系统
演化关系(Pryer等 2004; Wikström和 Pryer 2005)。
这些分子系统学研究从以下几方面更新或进一步证
实了人们对一些类群亲缘关系的认识: (1)紫萁科
(Osmundaceae)是薄囊蕨类植物的最早分支, 是其他
类群的姐妹群; (2)澄清了双扇蕨科(Dipteridaceae)、
马通蕨科(Matoniaceae)和里白科(Gleicheniaceae)的
系统位置, 而且双扇蕨属(Dipteris)和燕尾蕨属
( C h e i r o p l e u r i a )、马通蕨属( M a t o n i a )和
Phanerosorus互为姐妹群, 上述 4个属同里白科
(Gleicheniaceae)构成姊妹群关系; (3)孢子异型的水
生蕨类(heterosporous ferns)、树蕨类(tree ferns)
和水龙骨类(polypods ferns)等构成 “核心薄囊蕨类 ”
(core leptosporangiates), 莎草蕨类(schizaeoid ferns)
为其姊妹群; (4)松叶蕨类(Psilotaceae)与瓶尔小草类
(Ophioglossaceae)、木贼(Equisetaceae)与莲座蕨类
(Marattiaceae)分别构成姐妹群关系。
3 . 3 蕨类植物科内属间的关系分析 蹄盖蕨科
(Athyriaceae)是一个较为复杂的大科, 其科下属间关
系一直是不同学者争论的焦点。Sano等(2000)和
王玛丽等(2003)分别利用叶绿体rbcL基因和trnL-F
序列构建了蹄盖蕨科的系统发育树, 并综合形态特
征, 对长期争论的科下属间关系提出了新的观点: (1)
蹄盖蕨属(Athyrium)、角蕨属(Cornopteris)、假冷
蕨属(Pseudocystopteris)和安蕨属(Anisocampium)位
于系统发育树的同一分支, 系统关系较近; (2)肠蕨
属( D i p l a z i o p s i s )和 H o m a l o s o r u s 同岩蕨科
(Woodsiaceae)植物位于同一分支; (3)轴果蕨属
(Rhachidosorus)与蹄盖蕨属和双盖蕨属(Diplazium)
的关系较远; (4)新蹄盖蕨属(Neoathyrium)应该作为
角蕨属(Cornopteris)植物处理; (5)将蹄盖蕨科划分
为 5个亚科, 即冷蕨亚科(Cystopterioideae)、蹄盖
蕨亚科(Athyrioideae)、对囊蕨亚科(Deparioideae)、
双盖蕨亚科(Diplazioideae)和轴果蕨亚科(Rhachi-
dosorioideae)。
分类学家对鳞毛蕨类植物的概念和科属界定
也存在很大争议。鳞毛蕨类植物类群多, 分类难度
大, 其分类范畴、属间界限以及主要类群间的系统
演化关系一直是蕨类学家们争论不休的问题。李
春香和陆树刚(2006a)和 Liu等(2007b)分别利用来
自叶绿体基因组的 rbcL、rbcL和 atpB基因联合分
析对该类植物进行了系统发育重建, 两者均认为鳞
毛蕨科的概念需要重新调整。Liu等(2007b)的研
究认为, 狭义鳞毛蕨科(秦仁昌1978)的概念需要扩
大, 即还应该包括球盖蕨科(Peranemaceae)、叉蕨
科(Tectariaceae)的部分属(如肋毛蕨属 Ctenitis、节
毛蕨属 Lastreopsis等)以及舌蕨类植物(elaphog-
lossidoid ferns), 而传统的鳞毛蕨科成员 -拟贯众属
(Cyclopeltis)同鳞毛蕨科其他成员的关系较远, 应该
作为藤蕨科(Lomariospidaceae)成员。对鳞毛蕨类
植物成员属, 如鳞毛蕨属(Dryopteris)、舌蕨属
(Elaphoglossum)、耳蕨属(Polystichum)、贯众属
(Cyrtomium)以及特有植物玉龙蕨属(Sorolepidium)
的研究, 也加深了对该类植物的进一步认识(Little和
Barrington 2003; Rouhan等 2004; Geiger和 Ranker
2005; Lu等2005, 2007; Li和Lu 2006; Liu等2007a;
Li等 2008)。
3.4 种间亲缘关系分析 在对蕨类植物进行物种划
分和界定时, 不同研究者由于对形态特征的处理不
同, 从而导致对物种的定义存在差异。云南铁角蕨
(Asplenium yunnanense)和泸山铁角蕨(A. lushanense)
为 2个近缘种, 在整体形态特征上很接近, 但在羽
片形态、分裂式样和有无芽胞等方面存在差异, 因
而被作为2个种。王中仁等(2003)的细胞学研究显
示, 云南铁角蕨与泸山铁角蕨的染色体数目不相同,
因此支持作为2个独立的种, 但是李春香和陆树刚
(2006b)的研究显示2个物种在rbcL、trnL-F和rps4-
trnS基因序列上无明显差异, 认为应该将两者合并
为一个种。
3.5 不同谱系起源时间的推算 随着分子生物学技
术在揭示不同类群系统关系中的逐步深入应用, 利
用DNA序列的演化速率估算类群起源和发生辐射
演化的时间也成为了分子系统学研究中一个新的生
长点, 尤其是如果所研究的类群缺乏化石证据, 那
么利用DNA序列推测类群的起源和演化时间则是
唯一可用的方法。Pryer等(2004)依据化石参照点,
利用 2个基因组 4个DNA序列对真蕨类早期类群
的起源和分化时间进行了估算。他们的研究显示,
真蕨类植物的早期类群是在石炭纪至侏罗纪开始分
化, 其中紫萁科植物在石炭纪中期(约 323 Mya)开
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月630
始分化, 而松叶类和瓶尔小草类植物则在泥盆纪末
期(约 364 Mya)开始出现, 后在石炭纪晚期发生分
化, 莲座蕨类和木贼类在石炭纪早期(约 359 Mya)
开始出现, 此后不久(约354 Mya)两者即发生分化。
Schneider等(2004)综合rbcL和rps4的分析, 认为多
数蕨类植物是在白垩纪以后才发生分化的, 而大多
数被子植物辐射分化的时间是在中侏罗纪到早白垩
纪, 即多数蕨类植物是在被子植物出现后才发生辐
射分化的, 该论点彻底打破了传统认为的蕨类植物
在被子植物起源和分化后逐渐走向衰退的观点。
此外, Yatabe等(1999)、Wikström和 Kenrick
(2001)、Des Marais等(2003)结合化石记录和DNA
序列分别对紫萁科、现存石松类植物和木贼属
(Equisetum)的起源和演化时间进行了估算。
4 结语
虽然 DNA分子标记、基因克隆、基因芯片
和RNAi等技术已经在蕨类植物的各项研究中得以
应用, 但与这些技术在种子植物中的应用相比, 无
论是技术应用的成熟程度还是所能够解释的科学问
题都是刚刚起步。因此, 建议以后的蕨类植物研
究从以下几个方面开展工作: (1)利用在种子植物中
应用成熟的技术, 深入分析以水蕨等类群为代表的
模式植物的基因组结构(Nakazato等2006)和全基因
组序列信息, 或者构建蕨类植物不同组织的EST数
据库(Salmi等 2005; Yamauchi等 2005), 摸索建立
可操作性强的转基因体系(Davis等2005), 为分子生
物学技术在蕨类研究方法学中的不断改进与完善奠
定基础, 同时也为深入分析和解决蕨类植物生物学
问题提供可能; (2)利用分子标记技术与特异DNA
序列特征, 以分类系统尚存的有疑问的类群和科属
(如水龙骨科、凤尾蕨科等)为重点开展分子系统
学研究, 为建立自然的科属分类系统提供进一步证
据(刘红梅等 2008)。同时, 可以根据蕨类植物的特
殊进化位置, 开展进化 -发育(Evo-Devo)生物学研
究; (3)基于种子植物基因功能分析的现有成果, 通
过同源基因序列分析, 利用基因克隆与表达技术、
基因芯片技术、RNAi/DNAi技术以及蛋白质组学
技术, 深入揭示蕨类植物发育与代谢过程的分子机
制。在基础研究层面, 深入分析蕨类植物特有的
生物学过程, 如孢子形成与萌发、配子体性别分
化、受精作用与胚发育等过程中关键事件(如单细
胞光响应、细胞核迁移、细胞骨架动态、细胞
极性生长)的分子调控机理(戴绍军等2008), 以及深
入解析一些蕨类植物对重金属和干旱等逆境的适应
与防御的分子机制等。在应用基础研究层面, 有针
对性地利用基因功能分析与转基因等技术, 改善一
些具经济价值蕨类植物的生物学性状, 比如园艺观
赏(如肾蕨 Nephrolepis auriculata)、工艺(如树蕨
Alsophi la spinulosa)、环保植物(如蜈蚣草 P.
vittata)、药用(如问荆 E. arvense)、食用(如蕨菜
Pteridium aquilinum var. latiusculum)、工业用(如
石松 L y c o p o d i u m )与农用(如满江红 A z o l l a
imbricata)植物等, 使其获得更大的经济价值。
参考文献
陈进明, 王晶苑, 刘星, 张彦文, 王青锋(2004). 中华水韭遗传多样
性的 RAPD分析. 生物多样性, 12: 348~353
陈媛媛, 叶其刚, 黄宏文(2003). 中华水韭(Isoétess inensis)等位酶
分析的初步研究. 武汉植物学研究, 21: 91~94
戴绍军, 高晶, 牟鸿飞, 宋莹莹(2008). 蕨类植物孢子与种子植物
花粉萌发的比较. 植物学通报, 25: 139~148
李春香, 陆树刚(2006a). 鳞毛蕨科植物的系统发育: 叶绿体 rbcL
序列的证据. 植物分类学报, 445: 503~515
李春香, 陆树刚(2006b). 云南铁角蕨与泸山铁角蕨的关系: 来自
叶绿体 rbcL、trnL-F和 rps4-trnS序列的证据. 植物分类学
报, 44: 296~303
刘红梅, 王丽, 张宪春, 曾辉(2008). 石松类和蕨类植物研究进展:
兼论国产类群的科级分类系统. 植物分类学报, 46: 808~829
刘红梅, 张宪春, 曾辉(2009). DNA序列在蕨类分子系统学研究
中的应用. 植物学报, 44: 143~158
潘丽芹, 季华, 陈龙清(2005). 荷叶铁线蕨自然居群的遗传多样性
研究. 生物多样性, 13: 122~129
秦仁昌(1978). 中国蕨类植物科属的系统排列和历史来源. 植物
分类学报, 16: 1~19, 16~37
王玛丽, 陈之端, 张宪春, 陆树刚, 赵桂仿(2003). 蹄盖蕨科的系统
发育: 叶绿体 DNA trnL-F区序列证据. 植物分类学报, 41:
416~426
王中仁(1996). 植物等位酶分析. 北京: 科学出版社, 1~137
王中仁, 王可青, 张方, 侯鑫(2003). 华中铁角蕨复合体的生物系
统学研究. 植物学报, 45: 1~14
Banks JA (1997). The TRANSFORMER genes of the fern
Ceratopteris richardii simultaneously promote meristem and
archegonia development and repress antheridia development
in the developing gametophyte. Genetics, 147: 1885~1897
Banks JA (1999). Gametophyte development in ferns. Annu Rev
Plant Physiol Plant Mol Biol, 50: 163~186
Caliea PJ (2005). A mutant hunt using the C-fern (Ceratopteris
richardii). Am Biol Teach, 67: 295~299
Davis CC, Anderson WR, Wurdack KJ (2005). Gene transfer from
a parasitic flowering plant to a fern. Proc Biol Sci, 272:
2237~2242
Des Marais DL, Smith AR, Britton DM, Pryer KM (2003).
Phylogenetic relationships and evolution of extant horsetails,
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月 631
Equisetum, based on chloroplast DNA sequence data (rbcL
and trnL-F). Int J Plant Sci, 164: 737~751
Dong RB, Formentin E, Losseo C, Carimi F, Benedetti P, Terzi M,
Schiavo FL (2005). Molecular cloning and characterization
of a phytoehelatin synthase gene, PvPCS1 , from Pteris
vittata L. J Ind Microbiol Biotechnol, 32: 527~533
Dong YH, Chen JM, Gituru RW, Wang QF (2007). Gene flow in
populations of the endangered aquatic fern Ceratopteris
pteridoides in China as revealed by ISSR markers. Aquatic Bot,
87: 69~74
Duan GL, Zhu YG, Tong YP, Cai C, Kneer R (2005). Character-
ization of arsenate reductase in the extract of roots and
fronds of Chinese brake fern, an arsenic hyperaccumulator.
Plant Physiol, 138: 461~469
Eberle JR, Banks JA (1996). Genetic interactions among sex
determining genes in the fern Ceratopteris richardii. Genetics,
142: 973~985
Ellis DR, Gumaelius L, Indriolo E, Pickering IJ, Banks JA, Salt DE
(2 006) . A novel a rsenate reductase from the a rsenic
hypemccumulating fern Pteris vittata. Plant Physiol, 141:
1544~1554
Geiger JM, Ranker TA (2005). Molecular phylogenetics and
h i s t o r i c b i o g e o g r a p h y o f H a w a i i a n D r y o p t e r i s
(Dryopteridaceae). Mol Phylogenet Evol, 34: 392~407
Huang YM, Chou HM, Chiou WL (2004). Density affects gameto-
phyte growth and sexual expression of Osmunda cinnamomea
(Osmundaceae: Pteridophyta). Ann Bot, 94: 229~232
Imaizumi T, Kanegae T, Wada M (2000). Cryptochrome nucleo-
cytoplasmic distribution and gene expression are regulated
by light quality in the fern Adiantum capillus-veneris. Plant
Cell, 12: 81~95
Ishikawa H, Watano Y, Kano K, Ito M, Kurita S (2002). Devel-
opment of primer sets for PCR amplification of the PgiC
gene in ferns. J Plant Res, 115: 65~70
Kamachi H, Iwasawa O, Hickok LG, Nakayama M, Noguchi M,
Inoue H (2007). The effects of light on sex determination in
gametophytes of the fern Ceratopteris richardii. J Plant Res,
120: 629~634
Kamachi H, Matsunaga E, Noguchi M, Inoue H (2004). Novel
mutant phenotypes of a dark-germinating mutant dkg1 in
the fern Ceratopteris richardii. J Plant Res, 117: 163~170
Kang M, Ye Q, Huang H (2005). Genetic consequence of restricted
habitat and population decline in endangered Isoetes sinensis
(Isoetaceae). Ann Bot, 96: 1265~1274
Kawai-Toyooka H, Kuramoto C, Orui K, Motoyama K, Kikuchi
K, Kanegae T, Wada M (2004). DNA interference: a simple
and efficient gene-silencing system for high-throughput func-
tional analysis in the fern Adiantum. Plant Cell Physiol, 45:
1648~1657
Korpelainen H, Britto J, Doublet J, Pravin S (2005). Four tropical,
closely related fern species belonging to the genus Adiantum
L. are genetically distinct as revealed by ISSR fingerprinting.
Genetica, 125: 283~291
Li CX, Lu SG (2006). Phylogenetics of Chinese Dryopteris
(Dryopteridaceae) based on the chloroplast rps4-trnS se-
quence data. J Plant Res, 119: 589~598
Li CX, Lu SG, Barrington DS (2008). Phylogeny of Chinese
Polystichum (Dryopteridaceae) based on chloroplast DNA
sequence data (trnL-F and rps4-trnS). J Plant Res, 121: 19~26
Little DP, Barrington DS (2003). Major evolutionary events in the
origin and diversification of the fern genus Polystichum
(Dryopteridaceae). Am J Bot, 90: 508~514
Liu HM, Zhang XC, Chen ZD, Qiu YL (2007a). Inclusion of the
Asiatic endemic genu s Sor olep idiu m in Poly st ich um
(Dryopteridaceae): evidence from the chloroplast rbcL and
morphological evidence. Chin Sci Bull, 52: 631~638
Liu HM, Zhang XC, Wang W, Qiu YL, Chen ZD (2007b). Molecular
phylogeny of the fern family Dryopteridaceae inferred from
chloroplast rbcL and atpB genes. Int J Plant Sci, 689: 1311~1323
Lu JM, Barrington DS, Li DZ (2007). Molecular phylogeny of the
polystichoid ferns in Asia based on rbcL sequences. Syst Bot,
32: 26~33
Lu JM, Li DZ, Gao LM, Cheng X, Wu D (2005). Paraphyly of
Cyrtomium (Dryopteridaceae): evidence from rbcL and trnL-
F sequence data. J Plant Res, 118: 129~135
Ma LQ, Komar KM, Tu C, Zhang WH, Cai Y, Kennelley ED
(2001). A fern that hyperaccumulates arsenic. Nature, 409:
579~584
Nakazato T, Jung MK, Housworth EA, Rieseberg LH, Gastony GJ
(2006). Genetic map-based analysis of genome structure in
the homosporous fern Ceratopteris richardii. Genetics, 173:
1585~1597
Noumi T, Mosher ME, Natori S, Futai M, Kanazawa H (1984). A
phenylalanine for serine substitution in the beta subunit of
Escherichia coli F1-ATPase affects dependence of its activ-
ity on divalent cations. J Biol Chem, 259: 10071~10075
Pryer KM, Schneider H, Smith AR Cranfill R, Wolf PG, Hunt JS,
Sipes SD (2001). Horsetails and ferns are a monophyletic
group and the closest living relatives to seed plants. Nature,
409: 618~622
Pryer KM, Schuettpelz E, Wolf PG, Schneider H, Smith AR,
Cra nfil l R (2004 ). Phylogeny a nd evolut ion of ferns
(monilophytes)with a focus on the early leptosporangiate
divergences. Am J Bot, 91: 1582~1598
Rathinasabapathi B, Wu S, Sundaram S, Rivoal J, Srivastava M, Ma
LQ (2006). Arsenic resistance in Pteris vittata L.: identifica-
tion of a cytosolic triosephos-phate isomerase based on cDNA
expression cloning in Escherichia coli. Plant Mol Biol, 62:
845~857
Rouhan G, Dubuisson JY, Pakotondrainibe F, Motley TJ, Mickel
JT, Labat JN, Moran RC (2004). Molecular phylogeny of
the fern genus Elaphoglossum (Elaphoglossaceae) based on
chloroplast non-coding DNA sequences: contributions of
species from the Indian Ocean area. Mol Phylogenet Evol,
33: 745~763
Roux SJ, Chatterjee A, Hillier S, Cannon T (2003). Early devel-
opment of fern gametophytes in microgravity. Adv Space
Res, 31: 215~220
Rutherford G, Tanurdzic M, Hasebe M, Banks JA (2004). A
systemic gene silencing method suitable for high throughput,
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月632
reverse genetic analyses of gene function in fern gametophytes.
BMC Plant Biology, 4: 6
Salmi ML, Bushart TJ, Stout SC, Roux SJ (2005). Profile and
analysis of gene expression changes during early develop-
ment in germinating spores of Ceratopteris richardii. Plant
Physiol, 138: 1734~1745
Salmi ML, Morris KE, Roux SJ, Porterfield DM (2007). Nitric
oxide and cGMP signaling in calcium-dependent develop-
ment of cell polarity in Ceratopteris richardii. Plant Physiol,
144: 94~104
Sano R, Takamiya M, Ito M, Kurita S, Hasebe M (2000). Phylog-
e n y o f t h e l a d y f e rn g r o u p , t r i b e P h y s e m a t i e a e
(Dryopteridaceae), based on chloroplast rbcL gene sequences.
Mol Phylogenet Evol, 15: 403~413
Schallau A, Kakhovskaya I, Tewes A, Czihal A, Tiedemann J, Mohr
M, Grosse I, Manteuffel R, Bäumlein H (2008). Phylogenetic
footprints in fern spore- and seed-specific gene promoters.
Plant J, 53: 414~424
Schneider H, Schuettpelz E, Pryer KM Cranfill R, Magallon S,
Lu pia R (20 04 ). Ferns diversifi ed in the sha dow of
angiosperms. Nature, 428: 553~557
Schor-Fumbarov T, Goldsbrough PB, Adam Z, Tel OE (2005).
Characterization and expression of a metallothionein gene
in the aquatic fern Azolla fil iculoides under heavy metal
stress. Planta, 223: 69~76
Stout SC, Clark GB, Sarah AE, Roux SJ (2003). Rapid and efficient
suppression of gene expression in a single-cell model system,
Ceratopteris richardii. Plant Physiol, 131: 1165~1168
Su YJ, Wang T, Zheng B, Jiang Y, Chen GP, Gu HY (2004).
Population genetic structure and phylogeographical pattern
of a relict tree fern, Alsophila spinulosa (Cyatheaceae),
inferred from cpDNA atpB-rbcL intergenic spacers. Theor
Appl Genet, 109: 1459~1467
Sundaram S, Rathinasabapathi B, Ma LQ, Rosen BP (2008). An
a r s en a te -a c t i va t ed g l u t a r ed o xi n f ro m t he a r se ni c
hyperaccumulator fern Pteris vittata L. regulates intracellular
arsenite. J Biol Chem, 283: 6095~6101
Tsuboi H, Suetsugu N, Kawai-Toyooka H, Wada M (2007).
Phototropins and neochrome1 mediate nuclear movement
in the fern Adiantum capillus-veneris. Plant Cell Physiol,
48: 892~896
Tsuboi H, Suetsugu N, Wada M (2006). Negative phototropic
response of rhizoid cells in the fern Adiantum capillus-
veneris. J Plant Res, 119: 505~512
van der Weele CM, Tsai CW, Wolniak SM (2007). Mago nashi is
essential for spermatogenesis in Marsilea. Mol Biol Cell, 18:
3711~3722
Wada M (2007). The fern as a model system to study photom-
orphogenesis. J Plant Res, 120: 3~16
Wang T, Su YJ, Li XY, Zheng B, Chen GP, Zeng QL (2004).
Genetic structure and variation in the relict populations of
Alsophila spinulosa from southern China based on RAPD
markers and cpDNA atpB-rbcL sequence data. Hereditas,
140: 8~17
Wen CK, Smith R, Banks JA (1999). ANI: A sex pheromone-
induced gene in Ceratopteris gametophytes and its possible
role in sex determination. Plant Cell, 11: 1307~1317
Wikström N, Kenrick P (2001). Evolution of Lycopodiaceae
(Lycopsida): estimating divergence times from rbcL gene
sequences by use of nonparametric ra te smoothing. Mol
Phylogenet Evol, 19: 177~186
Wikström N, Pryer KM (2005). Incongruence between primary
sequence data and the distribution of a mitochondrial atp1
group II intron among ferns and horsetails. Mol Phylogenet
Evol, 36: 484~493
Woodhead M, Russell J, Squirrell J, Hollingsworth PM, Cardle L,
Ramsay L, Gibby M, Powell W (2003). Development of
EST-SSRs from the alpine lady fern, Athyrium distentifolium.
Mol Ecol Notes, 3: 287~290
Woodhead M, Russell J, Squirrell J, Hollingsworth PM, Mackenzie
K, Gibby M, Powell W (2005). Comparative analysis of
population genetic structure in Athyrium distentifo lium
(Pteridophyta) using AFLPs and SSRs from anonymous and
transcribed gene regions. Mol Ecol, 14: 1681~1695
Yamauchi D, Sutoh K, Kanegae H, Horiguchi T, Matsuoka K,
Fukuda H, Wada M (2005). Analysis of expressed sequence
tags in prothallia of Adiantum capillus-veneris. J Plant Res,
118: 223~227
Yatabe Y, Nishida H, Murak ami N (1999). Phylogeny of
Osmundaceae inferred from rbcL nucleotide sequences and
comparison to the fossil evidences. J Plant Res, 112: 397~404