全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (9): 1457~1464　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0140 1457
收稿 2015-03-12　　修定 2015-09-08
资助 辽宁省科学技术计划项目(2011208001)。
* 通讯作者(E-mail: dsuqiao@dlut.edu.cn; Tel: 13940903690)。
多重胁迫下玉米实时定量PCR内参基因的筛选与验证
姜婷, 苏乔*, 安利佳
大连理工大学生命科学与技术学院, 辽宁大连116024
摘要: 实时定量PCR (qPCR)技术广泛应用于基因表达量的检测, 为了保证其结果的准确性, 选择合适的内参基因是必不可
少的环节。本研究分析了11个玉米候选内参基因的稳定性, 其中7个是常用内参基因(GAPDH、ACT、EF-1α、γ-TUB、18S
rRNA、5S rRNA和U6 snRNA), 4个是microRNA (zma-miR171a、zma-miR171b、zma-miR172和zma-miR159a/b)。通过计算11
个基因在正常生长条件与干旱、盐和碱共胁迫条件下的循环阈值(Ct), 输入软件geNorm、NormFinder和BestKeeper中进行
分析。结果表明, microRNA比其他候选内参基因稳定, 其中zma-miR172和zma-miR171a最稳定, 18S rRNA最不稳定。另外,
选择zma-miR397a及其靶基因LAC4对候选内参基因进行验证, 发现不合适的内参基因可能会导致错误的结果。
关键词: 玉米; 内参基因; 实时定量PCR; 干旱胁迫; 盐胁迫; 碱胁迫
Screening and Validation of Reference Genes of qPCR in Maize under Multiple
Stresses
JIANG Ting, SU Qiao*, AN Li-Jia
School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian, Liaoning 116024, China
Abstract: qPCR is a powerful and widely used technique for the measurement of different gene expression lev-
els. However, it is crucial to choose a suitable gene as an internal control for the proper analysis. In the present
study, we analyzed the expression patterns of 11 genes which include seven common reference genes (GAPDH,
ACT, EF-1α, γ-TUB, 18S rRNA, 5S rRNA and U6 snRNA) and four microRNAs (zma-miR171a, zma-miR171b,
zma-miR172 and zma-miR159a/b) in maize (Zea mays) samples. Expression level of these genes was observed
from two experimental conditions i.e. normal growth condition and co-stress of drought, salt and alkali. The
threshold cycle (Ct) values of each sample were analyzed using geNorm, NormFinder and BestKeeper. In this
study, the expression of microRNAs was found to be more stable than other reference genes. The results re-
vealed that zma-miR172 and zma-miR171a were highly stable compared to other reference genes while 18S
rRNA was the most unstable one in both experimental conditions. The expression levels of zma-miR397a and
its target gene LAC4 (laccase 4) were used to confirm the effect of candidate reference genes, showing that the
use of an inappropriate reference gene could induce erroneous results.
Key words: Zea mays; reference genes; qPCR; drought stress; salt stress; alkali stress
实时定量PCR (quantitative real-time PCR,
qPCR), 是指在PCR反应体系中加入荧光基团的技
术, 它具有特异性强、灵敏度高、重现性好以及
可以在较宽范围内定量等特点(吴文凯等2009;
Kulcheski等2010), 因此被广泛应用于基因功能的
研究。在qPCR技术, Ct值(threshold cycle)表示每个
反应的荧光信号达到阈值时所经历的循环数, Ct值
的大小与起始模板中目的基因的拷贝数有关, 拷
贝数越高, Ct值越小。在基因功能的相关研究中,
qPCR技术常用于比较分析基因在不同处理、组织
或生长阶段的表达量。而导致基因表达量变化的
原因主要包括以下两个方面: 第一, 由实验处理本
身引起的特异性变化; 第二, 由实验误差引入的非
特异性变化, 例如初始RNA模板的质量和数量、
cDNA合成的效率以及移液操作过程的精确性等
(Vandesompele等2002)。为保证qPCR所获数据的
准确性和可靠性, 尽可能避免非特异性变化, 需要
选择合适的内参基因校正上样量和操作过程中的
误差(樊连梅等2014)。
合适的内参基因应具备两个条件, 即在所有
植物生理学报1458
样本中保持恒定的表达量, 不随实验条件的改变
而改变。目前, 在研究中广泛使用的内参基因大
多是一些管家基因, 如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyc-
eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、
肌动蛋白(actin, ACT)、延伸因子(elongation factor
1-alpha, EF-1α)和微管蛋白(tubulin, TUB)的基因
等。这些管家基因在所有细胞中均表达, 并且是
维持细胞基本生命活动所必需的(张玉芳等2014;
Nicot等2005)。但在最近的研究中发现, 某些管家
基因的表达量存在显著的变化(Czechowski等2005;
Nicot等2005; Gutierrez等2008)。因此, 挖掘新的或
更稳定的内参基因很有必要。另外, 在进行实验
之前 , 会经常忽视对内参基因进行评估和验证
(Bustin等2009)。目前, 常用的内参基因评估方法
是基于qPCR的Ct值进行软件的综合分析。采用的
软件有geNorm、NormFinder和BestKeeper, 它们被
广泛应用于植物和动物内参基因的研究中(Chen等
2012; Manoli等2012)。
玉米广泛种植于世界各地, 是一种重要的谷
类作物。它的生长和产量会受到多种非生物胁迫
的影响(Jiao等2011), 其中干旱、盐和碱胁迫较为
常见。目前的研究主要集中在单一非生物胁迫对
玉米的生长发育、生理生化和基因表达等方面的
影响, 而对多种胁迫共同作用的研究较少。这可
能是由于多种胁迫共同作用是一种非常复杂的生
理过程, 但是这种作用方式更接近于自然条件。
在自然环境中, 植物遭受干旱胁迫时, 往往伴随着
盐和碱胁迫的出现(Frazier等2011; Gong等2014),
并且它们存在某些共同的生理变化机制。
在玉米基因表达量的研究中, 常以18S rRNA
和γ-TUB作为内参基因; 而研究microRNA的表达
量时, U6 small nuclear RNA (U6 snRNA)和5S rRNA
常作为内参基因, 有少数研究以zma-miR172作为
内参基因(Ding等2009; Wei等2014)。目前, 已有一
些关于玉米内参基因稳定性分析的报道: Chen等
(2012)评价了8个常用内参基因在玉米种子萌发过
程中的稳定性; Manoli等(2012)分析了12个内参基
因在20个不同处理的玉米组织中的稳定性; Lin等
(2014)分析了10个玉米内参基因在不同胁迫和激
素处理下的稳定性。在这些研究中, 所选取的内
参基因均为蛋白质编码基因或rRNA, 而最近的研
究表明microRNA也可以作为内参基因, 有的甚至
比常用内参基因更稳定(Kulcheski等2010)。因此,
本研究分析了11个候选内参基因在正常生长及干
旱、盐和碱共胁迫条件下的稳定性, 其中7个为玉
米常用内参基因: GAPDH、ACT、EF-1α、γ-TUB、
18S rRNA、5S rRNA和U6 snRNA (Kulcheski等2010;
Chen等2012; Manoli等2012), 另外4个是玉米microRNA:
zma-miR171a、zma-miR171b、zma-miR172和zma-
miR159a/b, 它们在其他植物中被广泛评价是稳定的
内参基因(Kulcheski等2010; Feng等2012; Lin和Lai
2013; Borowski等2014; Luo等2014)。
材料与方法
1 植物材料及处理
2014年3~6月, 在大连市农业科学研究院的温
室内, 将玉米(Zea mays L.)自交系‘郑58’种子用
0.1% NaClO消毒15 min, 再用无菌水清洗3遍。将
消毒后的种子种在装有等量混合土(原土:丹麦品
氏托普泥炭=1:1)的花盆(口×底×高=19 cm×14
cm×17 cm)中。培养条件为: 光周期16 h/8 h (昼/夜),
温度27 ℃/23 ℃ (昼/夜), 湿度60%~70%。待玉米幼
苗长到三叶一心期时, 将玉米材料分为2组: (1)进
行干旱、盐和碱共胁迫, 首先浇灌600 mL的NaCl
(100 mmol·L-1)和Na2CO3 (50 mmol·L
-1)混合溶液,
之后不再浇灌其他溶液, 自然干旱; (2)对照为正常
生长的材料, 首先浇灌600 mL水, 之后每隔4 d浇灌
200 mL水, 保持正常的水分供应。待处理组玉米
材料的叶片相对含水量(leaf relative water content,
LRWC) (Marulanda等2010)和土壤相对含水量(soil
relative water content, SRWC) (Xu和Zhou 2006)分
别达到轻度干旱 (80%≤LRWC<90%; 40%≤
SRWC<50%, 10 d)、中度干旱(70%≤LRWC<
80%; 30%≤SRWC<40%, 14 d)和重度干旱(60%≤
LRWC<70%; 20%≤SRWC<30%, 18 d)时取样, 3种
处理及其对照(90%≤LRWC<100%; 50%≤SRWC<
60%)均取5棵苗, 分别收集经不同处理植物材料及
对照的地上部分和地下部分, 将每部分分别等量
混样, 用液氮速冻, 之后冻存于–80 ℃冰箱中用于
RNA的提取。
2 候选内参基因的选择和引物设计
11个候选内参基因的序列信息来自NCBI数据
库和miRBase 21, 用Primer 3设计引物(表1), 由上海英
骏生物技术有限公司合成引物, 纯度级别为PAGE。
姜婷等: 多重胁迫下玉米实时定量PCR内参基因的筛选与验证 1459
表1 候选内参基因和目的基因的引物序列及扩增特点
Table 1 Primer sequences and amplicon characteristics of candidate reference genes and target genes
基因(登录号) 引物序列(5→3) Tm/℃ 片段大小/bp 扩增效率/% r
2
GAPDH (X07156.1) F: CCATCACTGCCACACAGAAAAC 86.20 170 95.0 0.994
R: AGGAACACGGAAGGACATACCAG
ACT (J01238.1) F: CAACAGAGAGAAAATGACGCAGA 81.86 128 93.0 0.994
R: CACCTGAATCCATCACAATACCA
EF-1α (NM_001112117.1) F: TGGGCCTACTGGTCTTACTACTGA 83.82 135 92.4 0.990
R: ACATACCCACGCTTCAGATCCT
γ-TUB (X83696.1) F: AAACGACGGTATTGGATGTTATGAG 80.02 131 122.8 0.999
R: CACCTCCCCTTGAATGATGTT
18S rRNA (AF168884.1) F: CCATCCCTCCGTAGTTAGCTTCT 84.97 151 109.6 0.997
R: CCTGTCGGCCAAGGCTATATAC
U6 snRNA (X52315.1) F: GATGACACGCACAAATCGAGAAATG 78.92 95.6 0.995
5S rRNA (AF273104.1) F: GATCCCATTCCGACCTCGATATA 81.77 90.0 0.987
zma-miR172 F: AGAATCTTGATGATGCTGCA 77.93 92.6 0.999
zma-miR171a F: TGATTGAGCCGCGCCAATAT 79.54 127.0 0.996
zma-miR171b F: TTGAGCCGTGCCAATATCAC 78.77 108.5 0.994
zma-miR159a/b F: TTTGGATTGAAGGGAGCTCTG 78.54 94.9 0.989
zma-miR397a F: TCATTGAGCGCAGCGTTGATG 80.80 123.0 0.989
LAC4 (GRMZM2G164467) F: TCTGCCAAAGACACGTACAA 85.70 105 93.0 0.999
R: GTTGGCGACGGAGAAGAA
3 总RNA提取以及cDNA合成
采用Trizol法提取总RNA, 1%琼脂糖凝胶电
泳检测RNA的完整性, NanoDrop 2000c进行纯度
检测以及浓度的定量。将地上部分和地下部分的
RNA样品等量混匀。采用SYBR PrimeScript miRNA
RT-PCR Kit试剂盒(TaKaRa)对microRNA、5S
rRNA和U6 snRNA进行反转录; 用PrimeScript RT
Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)对其
余5个基因进行反转录。
4 qPCR反应
以cDNA为模板, 分别以表1中各对引物进行
qPCR反应, 反应在实时定量仪Thermal Cycler Dice
Real Time System TP800 (TaKaRa)中进行。采用两
步PCR法, 反应条件为: 95 ℃ 30 s预变性; 95 ℃ 5 s,
60 ℃ 30 s, 40个循环。反应使用的试剂为SYBR
Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)和SYBR Prime-
Script miRNA RT-PCR Kit (TaKaRa)。不同基因在
进行qPCR时, 所用的模板cDNA量18S rRNA和
5S rRNA分别为0.05和0.4 ng·μL -1, 其余基因10
ng·μL-1, 以保证荧光信号在稳定的范围内Ct值在
15~30。进行3次生物学重复和3次技术重复, 并设
阴性对照。
实验结果
1 引物的扩增效率和特异性
经PCR反应后, 用4%琼脂糖凝胶电泳进行检
测, 出现大小与预期一致的单一条带; 经熔解曲线
分析得到明显的单峰, 这两项分析均表明引物具
有很好的特异性。采用标准曲线法对引物的扩增
效率进行分析, 对模板进行5倍梯度的稀释, 共设6
个梯度, 所有引物的相关系数(correlation coefficient,
r2)均在0.987~0.999, 引物的扩增效率均在90.0%~
127.0% (表1)。由此可见, 本研究所用的引物均具
有良好的特异性与扩增效率, 可以用于qPCR分析。
2 内参基因的Ct值分析
对11个候选内参基因的所有生物学重复和技
术重复得到的C t值进行分析 , 整体变化范围在
15~27, 其中18S rRNA的Ct值最小, zma-miR171a的
Ct值最大。每个候选内参基因的Ct值变化均小于3,
变化范围相对较小, 其中Ct值变化较大的是zma-
miR171b (2.68)和zma-miR159a/b (2.62), 变化较小
的是GAPDH (0.92)和EF-1α (1.02) (图1)。
3 geNorm软件分析
geNorm软件以平均变异度M值作为衡量内参
基因稳定性的指标, M值越低, 表明稳定性越好
植物生理学报1460
图1 候选内参基因Ct值的箱形图
Fig.1 Box plot of the Ct values of the candidate reference genes
每个盒代表一个候选内参基因, 盒中的横线代表中位数, 盒的
上下边分别代表上四分位数和下四分位数, 两端的盒须代表最大
值与最小值。
(Chen等2012)。由图2可见, 11个玉米候选内参基
因的M值均小于上限1.5。相对稳定的候选内参基
因在对照组中为zma-miR172、zma-miR171b和zma-
miR171a (图2-A), 在处理组中为zma-miR171a、
zma-miR171b和EF-1α (图2-B), 在所有样本(对照和
处理)中为zma-miR171a、zma-miR171b和zma-
miR172 (图2-C), 而18S rRNA最不稳定。
geNorm软件可以通过配对变异分析Vn/Vn+1来
确定合适的内参基因数, 选择阈值为V<0.15。在本
研究中, 配对变异分析的V值均小于0.15 (图2-D),
表明选择2个内参基因进行分析即可。geNorm软
件推荐的最佳候选内参基因组合是zma-miR171a
和zma-miR171b。
4 NormFinder软件分析
采用NormFinder软件进行分析时, 候选内参基
因的稳定性与稳定值呈负相关(Andersen等2004)。
因此, 相对稳定的内参基因在对照组中为GAPDH、
5S rRNA和EF-1α, 在处理组中为zma-miR172、
zma-miR171a和U6 snRNA, 在所有样本中为GAP-
DH、zma-miR172和U6 snRNA (表2)。NormFinder
和geNorm软件的分析结果有3个共同点: (1)在处理
组中, zma-miR171a是相对稳定的候选内参基因之
一; (2)在所有样本中, zma-miR172是相对稳定的候
选内参基因之一; (3) 18S rRNA在2个软件中均最不
稳定。
5 BestKeeper软件分析
BestKeeper软件依据每个样本的平均Ct值进
行分析(Pfaffl等2004), 该软件最多只能同时分析10
个候选内参基因 , 所以在进行分析之前去除了
geNorm和NormFinder一致评价为最不稳定的18S
rRNA。稳定的内参基因在BestKeeper中应具有较
低的假定值(P值)、标准偏差(standard deviation, s)
和变异系数(coefficient of variation, CV), 以及高的
相关系数(pearson correlation coefficient, r) (Rueda-
Martinez等2014; Zhou等2014)。结果显示, GAP-
DH、ACT、EF-1α、γ-TUB、zma-miR171b和5S
rRNA的P值大于0.01且r值较低, zma-miR159a/b的s
和CV较高, 所以以上这些基因不是相对稳定的内
参基因。最终, BestKeeper选择的稳定内参基因是
zma-miR172、zma-miR171a和U6 snRNA (表3)。
6 内参基因验证
综合3个软件的分析结果显示, zma-miR172和
zma-miR171a是相对稳定的候选内参基因组合,
18S rRNA最不稳定。为进一步验证结果的准确性,
以这3个候选基因作为内参, 分析zma-miR397a及
其靶基因LAC4的相对表达量。结果表明, 当以zma-
miR172和zma-miR171a作为内参联合分析时 ,
zma-miR397a在共胁迫条件中显著下调表达(P≤
0.05), 其靶基因LAC4显著上调表达(P≤0.05), 二者
呈现明显的负相关。而以18S rRNA作为内参分析
时, zma-miR397a虽然下调表达, 但差异不显著
(P≤0.05), 而且其靶基因LAC4也下调表达(图3)。
讨　　论
以microRNA作为候选内参基因进行分析最
早应用在动物的研究中, 直到2010年才在植物中
有相关的研究(Kulcheski等2010), 目前已报道的植
物有大豆(Glycine max)、小麦(Triticum aestivum)、
柑橘(Citrus sinensis)、龙眼(Dimocarpus longan)、
桃(Prunus persica)和生菜等(Kulcheski等2010;
Feng等2012; Kou等2012; Lin和Lai 2013; Borowski
等2014; Luo等2014)。虽然在玉米中有候选内参基
因稳定性的研究, 但目前没有以microRNA作为候
选内参基因的报道。
本研究采用geNorm、NormFinder和Best-
姜婷等: 多重胁迫下玉米实时定量PCR内参基因的筛选与验证 1461
图2 geNorm软件分析候选内参基因的稳定性
Fig.2 The stability of candidate reference genes analyzed by geNorm software
A: 对照; B: 处理; C: 所有样本(对照和处理); D: 配对变异分析Vn/Vn+1
表2 NormFinder软件分析候选内参基因的稳定性
Table 2 The stability of candidate reference genes analyzed by NormFinder software

排名
对照 处理 所有样本(对照和处理)
基因 稳定值 基因 稳定值 基因 稳定值
1 GAPDH 0.050 zma-miR172 0.076 GAPDH 0.099
2 5S rRNA 0.053 zma-miR171a 0.123 zma-miR172 0.105
3 EF-1α 0.112 U6 snRNA 0.151 U6 snRNA 0.107
4 U6 snRNA 0.219 γ-TUB 0.220 5S rRNA 0.115
5 zma-miR171a 0.279 zma-miR171b 0.238 zma-miR171a 0.116
6 zma-miR172 0.286 GAPDH 0.292 EF-1α 0.125
7 zma-miR171b 0.335 ACT 0.310 zma-miR171b 0.165
8 ACT 0.348 EF-1α 0.322 ACT 0.190
9 zma-miR159a/b 0.402 5S rRNA 0.344 γ-TUB 0.208
10 γ-TUB 0.501 zma-miR159a/b 0.347 zma-miR159a/b 0.216
11 18S rRNA 0.564 18S rRNA 0.494 18S rRNA 0.306

植物生理学报1462
Keeper软件, 系统地对玉米的11个候选内参基因进
行不同条件下的稳定性评估, 结果表明microRNA
要比其他候选内参基因表现得更稳定 , 这与大
豆、桂圆和小麦等研究中的分析结果一致(Kul-
cheski等2010; Feng等2012; Lin和Lai 2013)。在3个
软件的分析结果中, 均发现zma-miR172是相对稳
定的内参基因, 这与Kong等(2010)和Borowski等
(2014)的研究结果一致。Kong等(2010)发现在干
旱和盐胁迫下, zma-miR172的表达没有显著变化。
Borowski等(2014)采用geNorm和NormFinder软件
分析生菜的内参基因, 结果表明在干旱和盐胁迫
表3 BestKeeper软件分析候选内参基因稳定性
Table 3 The stability of candidate reference genes analyzed by BestKeeper software
GAPDH ACT EF-1α γ-TUB zma-miR171b 5S RNA U6 snRNA zma-miR171a zma-miR172 zma-miR159a/b
P值 0.918 0.528 0.400 0.216 0.023 0.014 0.004 0.004 0.002 0.002
r 0.054 –0.326 0.427 0.592 0.874 0.902 0.951 0.974 0.966 0.965
s 0.100 0.130 0.170 0.420 0.400 0.450 0.430 0.410 0.460 0.590
CV 0.530 0.560 0.850 1.730 1.590 2.380 2.540 1.630 2.240 3.190
图3 zma-miR397a (A)及其靶基因LAC4 (B)的表达水平
Fig.3 The expression levels of zma-miR397a (A) and
its target gene LAC4 (B)
*: 差异显著(P≤0.05); ns: 差异不显著。
下miR172相对稳定, 但在大豆和桃的研究中(Kul-
cheski等2010; Luo等2014), miR172在非生物胁迫
下的稳定性排名居中。
geNorm和NormFinder软件分析结果均表明
18S rRNA是最不稳定的内参基因, 这与Manoli等
(2012)对玉米内参基因的评估结果一致。另外, 在
西瓜(Citrullus lanatus)和白菜(Brassica rapa)的研
究中, 18S rRNA同样被评价为非生物胁迫下最不
稳定的内参基因之一(Qi等2010; Kong等2014)。在
生物体内, 18S rRNA的表达丰度高, 而其他基因的
表达丰度低, 表达丰度的不一致可能会影响qPCR
结果的准确性(Manoli等2012)。
在棉花(Gossypium hirsutum)、杨树(Populus
cathayana)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的mi-
croRNA研究中, 发现miR397对干旱和盐胁迫均有
响应, 并且与其靶基因LAC的表达呈现明显的负相
关, 符合microRNA的调控规律(Yin等2012; Zhou等
2012; Sunkar和Zhu 2004)。在本课题组构建的玉
米microRNA文库中, 发现zma-miR397a在干旱、
盐和碱共胁迫中显著下调表达, 并且预测得到的
靶基因是LAC4 (数据未发表)。因此, 选择zma-miR397a
及其靶基因LAC4对内参基因评估结果进行验证。
当采用zma-miR172和zma-miR171a作为内参进行
分析时, zma-miR397a在共胁迫条件下显著下调表
达, 其靶基因LAC4显著上调表达, 符合预期且与
Wang等(2014)和Liang等(2006)的研究结果一致。
Wang等(2014)发现zma-miR397在干旱胁迫下会显
著下调表达; 而Liang等(2006)发现玉米LAC的转录
水平会随NaCl浓度的升高而增高。当以18S rRNA
作为内参进行分析时, 这两个基因的表达量均未
有显著变化, 说明不合适的内参基因可能会导致
错误的分析结果。
综上所述, 本研究采用geNorm、NormFinder
和BestKeeper软件分析了11个玉米候选内参基因
姜婷等: 多重胁迫下玉米实时定量PCR内参基因的筛选与验证 1463
在不同条件下的稳定性, 发现microRNA表现更稳
定, 而常用的18S rRNA最不稳定。
参考文献
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