全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (10): 987~990 987
收稿 2011-07-28 修定 2011-08-25
资助 国家“973”前期研究专项(2010CB134403)和湖南省科技
计划项目(2009FJ1004-2、2009WK4002和2011FJ3015)。
* 通讯作者(E-mail: langtaoxiao@163.com; Tel: 0731-84635261)。
南荻的组织培养与快速繁殖技术
郭夏宇, 李合松, 彭克勤, 黄志刚, 萧浪涛*
湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室, 长沙410128
摘要: 以南荻幼穗为外植体, 进行了组织培养与快速繁殖技术的研究。结果表明: 最佳诱导培养基: MS+2.0 mg·L-1 2,4-
D+0.1 mg·L-1 6-BA+0.5 g·L-1水解酪蛋白+0.5 g·L-1脯氨酸; 最佳分化培养基: MS+0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1
IAA+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 g·L-1水解酪蛋白+0.5 g·L-1脯氨酸; 最佳生根培养基: MS+1.0 mg·L-1 NAA+0.25 mg·L-1 Met。炼苗
后, 移入营养土与珍珠岩(1:1)的基质中, 移栽成活率高达100%。该体系的建立为南荻规模化生产及遗传改良提供了前提条件。
关键词: 南荻; 组织培养; 快速繁殖
Tissue Culture and Rapid Propagation Technology of Triarrhena lutarioriparia
L. Liu sp. nov.
GUO Xia-Yu, LI He-Song, PENG Ke-Qin, HUANG Zhi-Gang, XIAO Lang-Tao*
Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development, Hunan Agricultural University, Changsha
410128, China
Abstract: Young ears of Triarrhena lutarioriparia were used as explant in the study of tissue culture and rapid
propagation. The results indicate that the best induced medium for callus induction was MS medium with 2.0
mg·L-1 2,4-D, 1.0 mg·L-1 6-BA ,0.5 g·L-1 casein acids hydrolysate and 0.5 g·L-1 proline. The best medium for bud
differentiation was MS medium with 0.5 mg·L-1 NAA, 0.5 mg·L-1 KT, 0.5 mg·L-1 IAA, 2.0 mg·L-1 6-BA, 0.5 g·L-1
casein acids hydrolysate and 0.5 g·L-1 proline. The best medium for root differentiation was MS medium with
1.0 mg·L-1 NAA and 0.25 mg·L-1Met. After acclimatization, the culture-bottle seedlings were transplanted into
base materials which contains nutritious soil and perlite (1:1). The survival rate was up to 100%. The estab-
lished system provided preconditions for large-scale production and genetic modification improvement of Tri-
arrhena lutarioriparia.
Key words: Triarrhena lutarioriparia L. Liou. sp. nov; tissue culture; rapid propagation
南荻(Triarrhena lutarioriparia L. Liu sp. nov.)
是我国特有的芒荻类植物新种, 原产于我国长江
流域, 在植物学分类中归属禾本科荻属。南荻以
无性繁殖为主、有性繁殖为辅, 常伴生于芦苇丛
中, 为水陆两生的高大草本植物, 在我国鄱阳湖区
和洞庭湖区等很多湿地均有分布(刘亮等2001), 具
有水土保持、固堤防洪、净化水体、空气、维
护自然生态系统等作用。近年来 , 随着石油枯
竭、粮食短缺和温室气体大量排放导致全球气候
变暖等多重危机重压下, 新能源的开发迫在眉睫。
南荻是C4植物, 是一种较为理想的纤维素乙醇原料
(孙逸和贺稚非2009), 同时也是一种可持续利用的
高生物量资源。因此, 大面积种植开发南荻意义
重大。
传统的南荻繁殖方法有种子繁殖、扦插繁殖
等。南荻种子发芽力强, 外界条件合适就可迅速
定植发展成群落, 但其种子生命期短, 30~50 d内发
芽率为85%~95%, 60 d后种子活力迅速下降。南荻
扦插繁殖属于无性繁殖, 扦插苗入土过后, 笋芽迅
速生长, 2个月左右株高可达2~3 m, 但是经过多代
无性繁殖后, 易造成种性退化, 甚至病毒积累(刘亮
1997)。南荻组培无性繁殖具有节约繁殖材料、繁
殖速度快、繁殖系数大并可进行周年工厂化大批
量生产等优点, 开发潜力巨大。南荻幼穗来源广,
取材方便, 接种操作简便, 出愈率与分化率高, 是
南荻组织培养的最佳外植体。易自力等(2001)曾
成功地诱导出南荻的愈伤组织并开展了遗传转化,
植物生理学报988
但未对分化后的试管苗生根率及移栽成活率进行
相关研究。本试验在前人基础上, 研究了南荻的
愈伤组织诱导、分化、生根直至得到南荻幼苗的
整个过程, 对南荻的再生体系进行了系统的研究
与优化。以幼穗为外植体在MS基础培养基上添加
不同种类、浓度的植物生长物质, 得到了更好的
试验结果。同时进行了不同基质对南荻幼苗移栽
影响的研究, 提高了幼苗的成活率。建立了一种
稳定而高效的南荻组织培养与快繁技术体系, 从
而为南荻规模化生产及遗传改良提供了前提条
件。
材料与方法
1 材料
供试材料为南荻(Triarrhena lutarioriparia L.
Liu sp. nov.)‘突节荻’品种幼穗, 由湖南沅江市芦苇
研究所提供。
2 方法
2.1 外植体处理
本试验选取南荻幼穗作为外植体进行离体培
养的研究。接种幼穗的最佳时期为颖花原基形成
期(何立珍等1995), 用70%酒精进行表面消毒, 无
菌剥离幼穗, 整穗接种时的长度为1.0~1.5 cm。
2.2 培养基
本试验选用了MS为基本培养基。愈伤组织
诱导及继代培养基为MS+2,4-D+6-BA+0.5 g·L-1水
解酪蛋白+0.5 g·L-1脯氨酸, 其中2,4-D浓度处理为
1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1; 6-BA浓度处理为
0.1、0.2 mg·L-1。30 d后统计不同植物生长物质浓
度配比对南荻幼穗愈伤组织诱导的影响。10 d继
代培养一次。
愈伤组织分化培养基为M S + N A A + K T +
IAA+6-BA+0.5 g·L-1水解酪蛋白+0.5 g·L-1脯氨酸,
NAA和IAA浓度为0.5 mg·L-1, KT浓度为0、0.5
mg·L-1, 6-BA浓度为1.0、2.0、3.0 mg·L-1。20 d后
统计不同激素与浓度对芽诱导的影响。
生根培养基为MS+NAA+Met, NAA浓度为0、
1.0、2.0、3.0 mg·L-1, Met浓度为0.25 mg·L-1。10 d后
统计不同激素与浓度对试管苗生根的影响。
上述培养基均添加3%的蔗糖和7.0 g·L-1琼脂,
pH值为5.8。培养温度(28±1) ℃, 愈伤组织诱导阶
段为暗培养, 待愈伤组织长势良好, 转移至分化培
养基。诱导出芽点后采用光照培养, 时间12 h·d-1,
光照强度30~40 μmol·m-2·s-1。分化出的无根幼苗
转移到生根培养基上约10 d后长出新根。
2.3 练苗与移栽
生根培养20 d后, 将完整试管苗移到与培养温
度相同的温室中炼苗, 打开瓶口, 使嫩苗逐渐与外
界接触, 提高适应能力, 保持较高的空气湿度。炼
苗7 d后用镊子把苗从培养瓶中取出, 用流水将根
部的培养基冲洗干净, 然后移入已消毒的基质中,
本实验选用了3种基质: (1) V营养土:V砂=1:1; (2) V营养土:
V珍珠岩=1:1; (3)纯砂。3 d内注意给幼苗喷施营养液,
7 d内注意遮荫, 并及时喷水保持湿度, 30 d后记录
其存活率。
实验结果
1 不同植物生长物质浓度配比对南荻幼穗愈伤组
织诱导的影响
如表1所示, 当2,4-D浓度较低时, 愈伤组织出
愈率较低且生长缓慢。随着2,4-D浓度的升高, 出
愈率有较大的提高。在2,4-D浓度为2.0 mg·L-1, 出
愈率达到100%, 而随着2,4-D浓度继续升高, 出现
了抑制愈伤组织生长的现象, 诱导率随之下降。
6-BA浓度为0.1 mg·L-1时 , 诱导率略高。因此 ,
2,4-D浓度为2.0 mg·L-1、6-BA浓度为0.1 mg·L-1时
的浓度配比是本试验最适合的浓度。诱导出的愈
表1 不同植物生长物质浓度配比的培养基上愈伤组织诱导率
Table 1 Induction rate of callus on mediums with different
concentrations of plant growth substance
生长物质浓度/mg·L-1
出愈率/%
2,4-D 6-BA
1.0 0.1 73.33±2.72d
1.5 0.1 85.83±3.19b
2.0 0.1 100.00±0.00a
2.5 0.1 80.00±2.72c
3.0 0.1 15.83±7.39f
1.0 0.2 65.00±1.92e
1.5 0.2 82.50±4.19bc
2.0 0.2 100.00±0.00a
2.5 0.2 65.83±4.19e
3.0 0.2 7.50±5.00g
数字旁小写字母不同表示在0.05水平上差异显著, 下表同。
郭夏宇等: 南荻的组织培养与快速繁殖技术 989
伤组织有淡黄、黄褐、褐、浅紫、紫褐色, 其中淡
黄色或浅紫色的胚性愈伤组织结构致密、色泽鲜
2 不同植物生长物质浓度配比对愈伤组织分化率
的影响
将继代培养2~3次保持良好生长状态的愈伤
组织转至MS培养基添加0.5 mg·L-1 IAA和NAA以
及不同浓度的6-BA和KT的分化培养基上, 统计不
同处理对愈伤组织分化频率的影响, 结果如表2所
示。6-BA浓度为2 mg·L-1分化率较高, 加入KT后,
分化率明显提升, 最高的分化率达到了92.72%, 因
此本实验确定MS+0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1
KT+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 g·L-1水解
酪蛋白+0.5 g·L-1脯氨酸为适宜的分化培养基。愈
伤组织转移后7 d左右就出现绿芽点, 而后逐渐发
育成丛芽(图1-C)。20 d后转入生根培养基。
3 不同植物生长物质浓度配比对试管苗生根的影响
将无根壮苗转入生根培养基中进行生根诱导
(图1-D)。本试验在MS培养基基础上添加0.25 mg·L-1
Met和不同浓度的NAA, 统计不同处理对试管苗生
根的影响。从表3可以看出, NAA浓度过高或过低
都不利于根的诱导, 最适宜的浓度是1.0 mg·L-1, 因
此最适宜的生根培养基是MS+1.0 mg·L-1 NAA+
0.25 mg·L-1 Met。在此培养基中, 28 ℃条件下10 d
后试管苗基部长出新根, 获得完整植株(图1-E)。
艳、成颗粒状, 增殖能力强。将其继代培养, 可以
产生大量淡黄色致密型胚性愈伤组织(图1-A、B)。
图1 南荻幼穗再生体系的建立
Fig.1 Establishment of plantlet regeneration system from young ears of Triarrhena lutarioriparia
A: 幼穗诱导培养20 d: B: 愈伤组织继代培养10 d; C: 愈伤组织分化培养10 d; D: 幼芽接种至生根培养基; E: 幼芽生根培养15 d; F: 生
长在V营养土:V珍珠岩=1:1基质上的再生植株。
表3 不同植物生长物质浓度配比的培养基上试管苗生根率
Table 3 Rooting rate of regenerated plantlet on mediums with
different concentrations of plant growth substance
生长物质浓度/mg·L-1
生根率/%
NAA Met
0 0.25 52.60±0.99d
1.0 0.25 92.42±2.10a
2.0 0.25 75.77±2.96b
3.0 0.25 69.67±0.39c
表2 不同植物生长物质浓度配比的培养基上愈伤组织分化率
Table 2 Differentiation rate of callus on mediums with
different concentrations of plant growth substance
生长物质浓度/mg·L-1
分化率/%
6-BA KT IAA NAA
1.0 0 0.5 0.5 65.04±1.11e
2.0 0 0.5 0.5 75.16±1.24c
3.0 0 0.5 0.5 70.49±2.25d
1.0 0.5 0.5 0.5 80.75±2.14b
2.0 0.5 0.5 0.5 92.72±1.11a
3.0 0.5 0.5 0.5 76.62±1.63c
植物生理学报990
4 不同基质对试管苗移栽成活的影响
生根培养20 d后, 将完整试管苗移到与培养温
度相同的温室中炼苗, 1周后从培养瓶中取出试管
苗, 用流水将根部的培养基冲洗干净, 然后移入已
消毒的基质中。在试验的几种基质中, V营养土:V珍珠岩
=1:1炼苗成活率达到了100%, 且幼苗生长迅速(图
1-F), V营养土:V砂=1:1次之, 纯砂存活率较低(表4)。
南荻试管苗在炼苗的过程中, 纯砂基质中的幼苗
随着时间的延长成活率不断降低, 30 d时间内下降
了40%左右, 分析其原因, 可能是纯砂虽然透气性
好但保水性较差, 这说明南荻幼苗适宜生长在水
分充足的环境中。营养土与砂混合虽然保水性好,
但透气性与透水性一般, 而营养土与珍珠岩混合
则结合了保水性与透气性, 适合南荻幼苗生长, 幼
苗成活率高。
淡黄色或浅紫色的胚性愈伤组织结构致密、色泽
鲜艳、成颗粒状, 增殖能力强, 继代培养后能产生
大量淡黄色致密型胚性愈伤组织。继代培养时可
以适当调高6-BA的浓度, 降低2,4-D的浓度。研究
表明, 在诱导过程中, 2,4-D浓度应逐步降低, 否则
愈伤组织细胞不能成为胚胎细胞 (王冬梅等
1996)。在分化培养中, 添加NAA、KT和IAA后,
可以改进愈伤组织的质量(陈惠等2008; 陈以峰等
1998)。从外形上看, 愈伤组织比较致密、较硬、
颗粒状结构、易于分化。
胚性愈伤组织的培养时间也是一个重要问
题。有研究报告认为, 南荻幼穗愈伤组织在继代
培养140 d左右, 其分化能力下降50% (易自力等
2001)。水稻的研究结果表明, 不论成熟胚还是幼
胚诱导的愈伤组织, 继代均比不继代分化频率高
(陈惠等2008)。本研究显示, 愈伤组织从幼穗上剥
离后继代2~3次, 也就是20~30 d的胚性状态较好,
色泽鲜艳, 颗粒圆润紧凑, 呈现出生长和分裂旺盛
的趋势, 是分化的最佳时期, 分化率较高。
长期以来, 南荻一直作为主要的造纸原料, 而
没有作为一种特色能源植物进行开发, 南荻的细
胞和组织培养研究也很少。本研究中以南荻幼穗
作为培养材料, 获得了较高的愈伤组织诱导、分
化和生根率, 筛选出了比较容易离体培养南荻幼
穗的最适培养基, 建立了一种稳定而高效的南荻
组织培养与快繁技术体系, 从而为南荻工厂化快
速育苗及南荻遗传改良提供了技术支持, 能够更
加有效的开发利用南荻。
参考文献
陈惠, 赵原, 种康(2008). 一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因
转化系统. 植物学通报, 25 (3): 322~331
陈以峰, 周辩, 汤日圣, 张金榆, 梅传生(1998). 水稻体细胞培养中胚
性细胞出现与IAA的关系.植物学报, 40 (3): 474~477
何立珍, 周朴华, 刘选明, 曹学军, 曹明德(1995). 荻不同外植体离体
培养研究. 西北植物学报, 15 (4): 307~313
刘亮(1997) . 中国植物志(荻属). 北京: 科学出版社, 10 (2): 19~26
刘亮, 朱明, 朱太平(2001). 芒荻类植物资源的开发和利用. 自然资
源学报, 16 (6): 562~563
孙逸, 贺稚非(2009). 纤维素发酵生产酒精的研究进展. 农产品加
工, (4): 70~73
王冬梅, 黄学林, 黄上志(1996). 细胞分裂素类物质在组织培养中的
作用机理. 植物生理学报, 32 (5): 373~377
易自力, 周朴华, 储成才, 李祥, 田文忠, 王力, 曹守云, 唐柞舜
(2001). 南荻遗传转化系统的建立及转基因植株的获得. 高技
术通讯, (4): 20~24
表4 不同基质对试管苗移栽成活的影响
Table 4 Survival rate of the transplanting seedling on
different base material
基质
成活率/%
5 d 10 d 15 d 30 d
砂 100 80 63 57
V营养土:V珍珠岩 100 100 100 100
V营养土:V砂 100 100 90 86
讨 论
目前有关南荻组织培养和快速繁殖体系的研
究报道很少。易自力等(2001)对南荻的组织培养
及转基因方面进行了研究, 其试验结果表明: 幼穗
是南荻组培的最佳外值体, CC培养基是南荻愈伤
组织的最适培养基。本试验在其基础上, 对南荻
的再生体系进行了系统的研究与优化, 以幼穗为
外植体在MS基础培养基上添加不同植物生长物
质, 得到了更好的试验结果: 南荻幼穗愈伤组织诱
导率为100%, 愈伤组织最高分化率达到92.72%, 试
管苗生根率为9 2 . 4 2 % , 试管苗移栽成活率为
100%。南荻幼穗愈伤组织形成时间约为20 d, 生
长比较缓慢, 这是由于南荻幼穗常分泌一种紫色
物质, 会影响愈伤组织的产生和活力, 所以及时更
换新鲜的诱导培养基, 是诱导成功的关键。诱导
出的愈伤组织有淡黄、黄褐、褐、浅紫和紫褐色,