全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (7): 931~936　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2013.0466 931
收稿 2014-03-20　　修定 2014-05-29
资助 国家自然科学基金(21277072)、江苏省科技支撑计划-社
会发展项目(BE2013709)和中央高校基本科研业务费专项
基金(KYZ201158)。
* 通讯作者(E-mail: gpwang@njau.edu.cn; Tel: 025-84396391)。
脯氨酸对不结球白菜(Brassica chinensis)镉积累的影响
胡蔚1, 夏妍1, 陈亚华2,3, 沈振国1, 王桂萍1,*
1南京农业大学生命科学学院, 南京210095; 2江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心, 南京210095; 3农村土地资源利用
与整治国家地方联合工程研究中心, 南京210095
摘要: 采用溶液培养的方法, 研究了过量Cd对不结球白菜(Brassica chinensis)幼苗内源脯氨酸含量的影响及外源脯氨酸在
不结球白菜Cd积累中的作用。100 μmol∙L-1 Cd 处理明显增加不结球白菜叶片脯氨酸(Pro)的含量, 并且随着Cd胁迫时间的
延长, 其含量也显著上升。100 μmol∙L-1 Cd 处理明显降低脯氨酸脱氢酶(PDH)活性, 而增加δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)
的活性。1~5 mmol∙L-1外源Pro处理显著降低不结球白菜幼苗地上部Cd含量, 对根系Cd含量无显著影响, 但外源Pro处理并
不能缓解过量 Cd对不结球白菜幼苗生物量的抑制作用。外源Pro处理下, 不结球白菜叶片中Pro含量与其地上部干重呈显
著的负相关关系。
关键词: 镉; 脯氨酸; 不结球白菜
Effects of Proline on Cadmium Accumulation in Brassica chinensis
HU Wei1, XIA Yan1, CHEN Ya-Hua2,3, SHEN Zhen-Guo1, WANG Gui-Ping1,*
1College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2Jiangsu Collaborative Innovation Center for
Solid Organic Waste Resource Utilization, Nanjing 210095, China; 3National Joint Local Engineering Research Center for Rural
Land Resources Use and Consolidation, Nanjing 210095, China
Abstract: Hydroponic experiments were used to study the effects of cadmium on endogenous proline content
in Brassica chinensis seedlings and the roles of exogenous proline on cadmium accumulation in plants were
also studied. The contents of proline in leaves of B. chinensis were significantly increased under 100 μmol∙L-1
Cd treatment, and accumulated more as the stress prolonged. The activities of PDH were significantly decreased
under 100 μmol∙L-1 Cd treatment, while P5CS increased. Exposure with 1–5 mmol∙L-1 proline significantly de-
creased the Cd concentrations in the shoots of B. chinensis seedlings, and had no effect on the Cd concentration
in roots. However, exogenous proline had no alleviation effect on biomass of B. chinensis seedlings treated with
Cd. A negative correlation between the contents of proline in leaves of B. chinensis and the dry weight of shoots
was found under exogenous proline stress.
Key words: cadmium; proline; Brassica chinensis
镉(cadmium, Cd)是毒性最强的重金属元素之
一, 与其他非必需元素相比, Cd具有较强的从土壤
向植物迁移的能力。一些植物种类可以从Cd含量
较低的土壤中吸收累积大量的Cd (Satarug等
2003)。近年来, 由于矿产资源的开发利用, 工业废
物、汽车尾气的排放和各种化学产品、农业杀虫
剂、农药及含Cd化肥的广泛使用, Cd对土壤、水
体的污染越来越严重。土壤一旦被Cd污染以后不
仅直接影响植物的生长和发育, 影响农产品的品
质, 而且Cd在植物中的大量积累, 通过食物链, 危
及人类的健康。如, 20世纪60年代在日本的富山县
神通川流域发现“痛痛病”, 便是由于长期食用被
Cd污染的大米所致。
脯氨酸(proline, Pro)的累积不仅被认为是逆
境的指示物, 同时还在抗重金属胁迫中起到重要
的保护作用(Sharma等1998; Maheshwari和Dubey
2007; Sun等2007; Choudhary等2007)。Pro可以螯
合Cd, 并形成无毒害的Cd-Pro复合体来减轻Cd对
植物的伤害(Sharma等1998)。Bačkor等(2004)等研
究结果表明, Pro的累积与苔藓的耐Cu性呈正相关,
说明Pro的累积在植物耐重金属胁迫中起到一定的
作用。在植物中, Pro的合成一般从谷氨酸开始, 经
由δ1-吡咯啉-5-羧酸(pyrroline-5-carboxylate, P5C)
植物生理学报932
再还原成Pro。在此过程中, δ1-吡咯啉-5-羧酸合成
酶(pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS)和δ1-吡
咯啉-5-羧酸还原酶(pyrroline-5-carboxylate reduc-
tase, P5CR)两个酶起到很关键的作用。Pro的分解
代谢主要通过脯氨酸脱氢酶(proline dehydroge-
nase, PDH)和δ1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(pyrro-
line-5-carboxylate dehydrogenase, P5CDH)的催化,
经由P5C, 再进一步降解为谷氨酸(Hayat等2012)。
因此, 研究过量Cd对参与Pro合成和降解酶的活性
影响可以为Pro的累积提供有力证据。
不结球白菜(Brassica chinensis)是十字花科芸
薹属芸薹种白菜亚种的一个变种。原产于我国,
在我国南方地区广泛栽培, 因其在城市郊区栽培
较多, 因而易受Cd污染。一些城市郊区及矿区生
长的青菜其地上部含Cd量可达到0.73~2.96 mg·kg-1
(DW), 已远远超过食用安全标准, 对人民的健康造
成了很大的危害(丁爱芳和潘根兴2003; 陈亚华等
2006)。本文采用溶液培养法, 研究了过量Cd对不
结球白菜内源脯氨酸含量的影响、以及外源脯氨
酸对Cd毒害的影响, 探讨脯氨酸在植物Cd积累和
耐性中的作用, 为进一步揭示植物耐Cd机理提供
理论依据。
材料与方法
1 实验材料
不结球白菜 (Brassica chinensis L.) 品种为‘五
月慢’, 种子购于江苏省农业科学院。
2 实验方法
2.1 植物材料的培养与实验设置
种子用5%的次氯酸钠消毒20 min, 用水冲洗
干净后播于灭菌后的沙子中, 在培养箱中催芽5 d
后移苗, 用1/2Hoagland营养液培养6 d后换成全
Hoagland营养液培养, 每2 d更换一次营养液, 生长
期间调节pH为5.8, 幼苗生长至四叶一心期时进行
各种处理, 处理期间每2 d更换一次处理液。Cd以
CdCl2∙2.5H2O的形式加入, 每个处理设3个重复。
镉处理设置3个浓度 , 分别为0、10和100
μmol∙L-1 Cd。镉处理的0、2、4、6、8和10 d采集
植物样品测定脯氨酸含量及PDH和P5CS活性。
外源Pro处理设6个处理: 1为对照即Hoagland
营养液; 2为1 mmol∙L-1 Pro; 3为5 mmol∙L-1 Pro; 4为
100 μmol∙L-1 Cd; 5为复合处理: 1 mmol∙L-1 Pro+100
μmol∙L-1 Cd; 6也为复合处理: 5 mmol∙L-1 Pro+100
μmol∙L-1 Cd。处理10 d后采集植物样品测定生物
量、Cd含量及PDH、P5CS活性。
2.2 Pro含量的测定
参照李合生(2000)的方法略经改进。取植物
叶片0.5 g, 加入5 mL 3% (W/V)的磺基水杨酸研磨,
在沸水浴中提取10 min, 冷却后离心(10 000×g, 10
min), 上清液即为脯氨酸的提取液。取2 mL的提
取液, 加入2 mL 冰醋酸及2 mL酸性茚三酮, 在沸水
浴中加热30 min, 溶液即呈红色。冷却后加入4 mL
甲苯, 摇匀, 静置片刻, 吸取上层脯氨酸红色甲苯
溶液于比色皿中, 以甲苯为空白对照, 测定520 nm
处吸光值。同法作标准曲线。
2.3 PDH和P5CS活性测定
取叶片1.0 g , PDH提取液用5 mL含有100
mmol∙L-1 MgSO4和0.01 g PVP的100 mmol∙L
-1 Tris-
HCl缓冲液(pH 7.4)冰浴研磨, 匀浆液于4 ℃冷冻离
心(12 000×g) 20 min, 上清液既为粗酶提取液; P5CS
提取液用5 mL含有100 mmol∙L-1 β-巯基乙醇、10
mmol∙L-1 MgCl2和1 mmol∙L
-1 PMSF的100 mmol∙L-1
Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)冰浴研磨, 匀浆液于4 ℃冷
冻离心(10 000×g) 15 min, 上清液用于测定酶活。
PDH和P5CS活测定性参照Sumithra等(2006)的方
法。P D H活性的测定 : 3 m L反应体系含1 0 0
mmol∙L-1 Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 10.3)、20
mmol∙L-1 L-脯氨酸、适量的酶液及10 mmol∙L-1
NADH, 测定3 min内A340的连续变化值。P5CS活性
的测定: 3 mL反应体系含100 mmol∙L-1 Tris-HCl缓
冲液(pH 7.2)、25 mmol∙L-1 MgCl2、75 mmol∙L
-1谷
氨酸钠、5 mmol∙L -1 ATP、适量的酶液及0.4
mmol∙L-1 NADPH, 测定3 min内A340的连续变化值。
2.4 植物体内Cd含量的测定
不结球白菜样品用自来水洗净后, 再用去离
子水清洗3遍, 吸干表面水分并用信封装取, 放置
烘箱内, 80 ℃烘干至恒重。植物样品经玛瑙研钵
磨碎, 用优级纯的HNO3+HClO4 (V/V=87/13)混合酸
消煮至近干, 用5%的HNO3定容至20 mL, 80 ℃水
浴溶解30 min, 静置2 h即可测定, 采用原子吸收分
光光度计(Jena, Nov AA-400)测定Cd含量。消煮过
程中设置空白管和国际标准样进行质量控制。
胡蔚等: 脯氨酸对不结球白菜(Brassica chinensis)镉积累的影响 933
实验结果
1 Cd 对不结球白菜叶片中脯氨酸含量的影响
如图1所示, 过量Cd处理下, 叶片中内源Pro含
量随着Cd处理浓度的提高而增加。低浓度(10
μmol∙L-1) Cd处理没有显著影响Pro含量(P>0.05) ;
而100 μmol∙L-1 Cd 处理2 d, 叶片Pro含量已显著高
于对照及低浓度Cd处理的叶片Pro含量, 并且Pro含
量随着处理时间的延长而增加; 当处理10 d时, 叶
片Pro含量是对照的10倍之多。
4 外源Pro对Cd胁迫下不结球白菜幼苗Cd含量的
影响
在100 μmol∙L-1 Cd存在下, 不结球白菜地上部
Cd含量随着外源Pro处理浓度的提高而显著下降
(图4-A); 而与对照(0 mmol∙L-1 Pro)相比, Pro处理10
d, 根系Cd含量没有显著变化(图4-B)。
5 叶片中PDH和P5CS活性
由图5可知, 在无Cd条件下, 与对照(0 mmol∙L-1
Pro)相比, 1 mmol∙L-1外源Pro处理对PDH和P5CS的
活性没有显著影响, 而5 mmol∙L-1外源Pro处理显
著降低PDH活性和显著增加P5CS活性。在100
μmol∙L-1 Cd处理下, 1 mmol∙L-1外源Pro处理显著增
加PDH活性, 降低P5CS活性; 5 mmol∙L-1外源Pro
处理对PDH活性没有显著影响, 而显著增加P5CS
活性。
图1 镉处理对不结球白菜叶片Pro含量的影响
Fig.1 Effects of Cd on content of proline in leaves of
B. chinensis
2 不结球白菜叶片中PDH和P5CS活性
不结球白菜叶片的PDH活性随着Cd处理浓度
的增加而降低(图2-A)。10 μmol∙L-1 Cd处理没有显
著降低PDH活性, 100 μmol∙L-1 Cd处理4 d显著降低
PDH活性 , 并且随着处理时间的延长而逐渐下
降。叶片中P5CS活性随着Cd处理浓度的提高而增
加(图2-B), 10 μmol∙L-1 Cd处理只有在8 d才显著增
加P5CS活性, 而100 μmol∙L-1 Cd处理4 d显著增加
P5CS活性, 并且随着处理天数的增加而增加。
3 外源Pro对Cd胁迫下不结球白菜幼苗生物量的影响
无论有100 μmol∙L-1 Cd还是没有Cd的存在, 高
浓度外源Pro (5 mmol∙L-1)处理不结球白菜10 d, 对
其地上部的生长都有明显的抑制作用(图3-A), 而
对根系干重的影响不显著(图3-B)。在相同Pro浓
度处理下, 100 μmol∙L-1 Cd的存在均抑制了地上部
和根系的生长。
图2 不同浓度镉处理对不结球白菜叶片PDH (A)和
P5CS (B) 活性的影响
Fig.2 Effects of Cd on activities of PDH (A) and P5CS (B) in
leaves of B. chinensis
植物生理学报934
图3 外源脯氨酸对Cd胁迫下不结球白菜地上部(A)和根系(B)干重的影响
Fig.3 Effects of exogenous proline on shoot (A) and root (B) dry weight of B.chinensis under Cd stress
图中不同的小写字母表示在0.05水平有显著差异, 图4和5同此。
图4 Cd胁迫下外源脯氨酸处理对不结球白菜地上部(A)和根系(B) Cd含量的影响
Fig.4 Effects of exogenous proline on shoot (A) and root (B) Cd concentration of B. chinensis treated with Cd
图5 外源脯氨酸对Cd胁迫下不结球白菜叶片PDH (A)和P5CS (B)活性的影响
Fig.5 Effects of exogenous proline on activities of PDH (A) and P5CS (B) in leaves of B. chinensis treated with Cd
胡蔚等: 脯氨酸对不结球白菜(Brassica chinensis)镉积累的影响 935
6 叶片中Pro含量与地上部干重的相关性
外源Pro处理下, 不结球白菜叶片中Pro含量与
其地上部干重具有明显的负相关性(P<0.05), 即植
物受到伤害程度越大, Pro含量就越高(图6); 上述
结果表明Pro的累积与植物所受伤害程度相一致。
随着细胞内Pro的积累。与对照及10 μmol∙L-1处理
相比, 随着100 μmol∙L-1 Cd处理时间的延长, PDH
的酶活性逐渐降低, 这暗示了Pro分解代谢的下降
(Tripathi等2013), 这也为Cd胁迫下Pro在不结球白
菜体内的积累做出了贡献。
在Hoagland营养液中添加100 μmol·L-1 CdCl2
可显著抑制不结球白菜幼苗生长(图3), 施加低浓
度外源脯氨酸(1.0 mmol·L-1)有缓解镉胁迫对不结
球白菜生长毒害作用的趋势, 但统计学上未达到
显著水平; 而高浓度外源脯氨酸(5.0 mmol·L-1)则抑
制了植物地上部的生长。我们进一步的研究结果
发现, 外源Pro处理还显著降低不结球白菜幼苗地
上部的Cd含量(图4), 这不同于对玉米、向日葵、
风花菜、球果蔊菜等植物的研究结果(王燕燕等
2007; 孙瑞莲等2009)。究其原因, 我们推测可能是
施加的脯氨酸在植物根外即可以与自由金属离子
结合, 减少了进入根系的镉含量, 从而降低了向地
上部转运的Cd (Gomathy等2011)。但5.0 mmol·L-1
脯氨酸处理下, 根系Cd含量与对照相比并未下降,
反而有升高的趋势; 这可能是高浓度Pro处理使根
系受到伤害 , 根系细胞膜透性增加 (Székely等
2008), 其进入根系的Cd也有增加的趋势。
相关研究显示脯氨酸积累量与植物遭受的胁
迫程度具有显著相关性。孙瑞莲等(2009)研究结果
表明, 球果蔊菜根系脯氨酸含量与根系鲜重呈极显
著负相关, 与根系MDA 含量呈显著正相关; 风花菜
脯氨酸含量与叶片鲜重及叶绿素含量呈极显著负
相关, 及与叶片MDA 含量呈极显著正相关。本研
究也获得了类似的结果, 即不结球白菜叶片中Pro
含量与其地上部生物量呈明显的负相关性(图6)。
并由此推断, 脯氨酸含量可以作为植物受到Cd胁迫
的一种监测指标。
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图6 叶片中Pro含量与地上部干重的相关性
Fig.6 The correlation between the content of proline in leaves
and the dry weight of shoot per plant
讨　　论
Pro累积不仅被认为是逆境指示物, 而且是植
物抵御重金属毒害的一种重要机制(Bačkor等2004;
Chen等2001; Sun等2007)。已有研究结果表明, Cd
胁迫能引起植物体内Pro的累积(王春春2000; Dhir
等2004; Balestrasse等2005; Sun等2007)。除了作为
一种重要的渗透调节物质, 在胁迫条件下Pro可作
为螯合剂、抗氧化剂、分子伴侣或信号分子(Ha-
yat等2012), Mohd等(2013)认为芥菜栽培种的耐Cd
性依赖于Pro的积累。我们的研究结果也显示, 过
量Cd处理引起了不结球白菜叶片Pro含量显著升
高, 并且随着Cd处理时间的延长其含量也逐渐升
高(图1)。同时, 伴随着Pro合成途径的关键酶P5CS
酶活性逐渐上升, 而降解途径关键酶PDH的酶活
性逐渐下降(图2和3)。Tripathi等 (2013)也得到类
似的研究结果。稍早研究证实 , 过量Cu能促进
P5CS催化谷氨酸向P5C (Pro合成前体)的转化
(Hare和Cress 1997)。在藻类中超量表达P5CS基
因, 导致Cd胁迫下绿藻体内比对照多积累80%的
Pro (Siripornadulsil等2002)。Kavi-Kishor (1995)的
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